Клонирование гена эндоглюканазы Cel5A из разлагающего целлюлозу Paenibacillus xylanilyticus kj03, очистка и характеристика рекомбинантного фермента Аннотация
 Скачать 33.46 Kb.
|
  Подпишитесь на DeepL Pro для редактирования данного документа. Дополнительную информацию можно найти на странице www.DeepL.com/pro. Клонирование гена эндоглюканазы Cel5A из разлагающего целлюлозу Paenibacillus xylanilyticus KJ-03, очистка и характеристика рекомбинантного фермента Аннотация Бактериальный штамм Paenibacillus xylanilyticus KJ-03 был выделен из образца почвы, используемой для культивирования Amorphophallus konjac. Ген целлюлазы, cel5A, был клонирован с помощью библиотеки фосмид и экспрессирован в Escherichia coli BL21 (trxB). Ген cel5A состоит из 1 743 п.н. открытой рамки считывания и кодирует 581 аминокислоту белка. Cel5A содержит N-концевой сигнальный пептид, каталитический домен семейства гликозил-гидролаз 5 и домен DUF291 с неизвестной функцией. Рекомбинантная целлюлаза была очищена с помощью Ni-аффинной хроматографии. Целлюлазная активность Cel5A была обнаружена в четкой полосе с молекулярной массой 64 кДа путем активного окрашивания зимограммы. Максимальная активность очищенного фермента проявлялась при температуре 40 С и рН 6,0, когда в качестве субстрата использовалась карбоксиметилцеллюлоза. Он имел 44% своей максимальной активности при 70 С и сохранял 66% своей первоначальной активности при 45 С в течение 1 ч. Очищенная целлюлаза гидролизовала авицел, КМЦ, фильтровальную бумагу, ксилан и 4-метилумбеллиферил b-D-целлобиозу, но не было обнаружено активности в отношении p-нитрофенил b-D-глюкозида. Конечные продукты гидролиза целлотетраозы и целлопентаозы под действием Cel5A были обнаружены с помощью тонкослойной хроматографии, в то время как фермент не гидролизовал целлобиозу и целлотриозу. 1 Введение Целлюлоза, основной полисахарид растений, является одной из самых распространенных биомасс с предполагаемым уровнем синтеза 1010 тонн в год и крупнейшим возобновляемым источником углерода на Земле [10]. Целлюлоза в клеточной стенке растений состоит из линейного полимера b-1,4-связанных остатков глюкозы [1, 15]. Нерастворимые целлюлозные субстраты могут быть преобразованы в полезные продукты, такие как растворимые сахара, спирт и другие соединения, микроорганизмами, разлагающими целлюлозу [2]. Целлюлазы и целлюлолитические ферменты, участвующие в разложении целлюлозы, были сгруппированы в 118 семейств на основе сходства аминокислотной последовательности [7]. В частности, целлюлазы классифицируются в 16 из 118 семейств гликозилгидролаз. Целлюлазы или целлюлолитические ферменты отвечают за гидролитическое расщепление b-1,4-гликозидных связей в целлюлозе и классифицируются на три типа по способу действия [10]. Эндоглюканазы или эндо-1,4-глюканазы беспорядочно гидролизуют b-1,4-гликозидные связи в целлюлозных цепях, создавая более терминальные концы фрагментов. Экзоглюканазы или целлобиогидролазы гидролизуют терминальные гликозидные связи и высвобождают глюкозу или целлобиозу. Наконец, b-глюкозидазы катализируют гидролиз целлобиозы или олигоглюкосахаридов [10, 22]. Кристаллическая и аморфная целлюлоза эффективно гидролизуется под синергическим действием трех вышеуказанных типов ферментов. Целлюлазы могут применяться в различных отраслях промышленности, поскольку они используются в кормлении животных, производстве целлюлозы и бумаги, моющих средств и биотоплива [3, 9, 26]. В частности, они используются для разложения сельскохозяйственных отходов и могут быть преобразованы в растворимые сахара, спирт и другие химические вещества. Поскольку преобразование целлюлозных отходов в глюкозу имеет глобальное значение, целлюлазы играют важную роль для достижения преимуществ утилизации биомассы [12, 14, 16]. Ферментируемые сахара используются в качестве возобновляемого источника энергии для производства биоэтанола. Они также улучшают формирование и гибкость бумажного полотна в целлюлозно-бумажной промышленности [12]. Хотя большинство микроорганизмов, включая бактерии и грибы, производят ферменты, разлагающие целлюлозу, целлюлазы, производимые грибами, представляют значительный интерес для биоконверсии возобновляемых лигноцеллюлоз [19, 21]. Среди грибов виды Trichoderma и Aspergillus способны производить целлюлазы, а некоторые бактерии, такие как Bacillus, Chlostridium, Cellulomonas и Erwinia, как сообщается, производят целлюлазы [8, 20, 24]. В последнее десятилетие виды Paenibacillus были переклассифицированы из видов Bacillus на основе последовательности 16S рДНК [27]. Виды Paenibacillus способны продуцировать ферменты, участвующие в метаболизме углеводных полимеров растений, поскольку они были выделены и идентифицированы из почвы и среды, связанной с растениями [5, 12]. Виды Paenibacillus способны выделять различные полисахариды-гидролизующие ферменты, включая амилазу, целлюлазу, b-глюканазу, пектиназу и ксиланазу [12]. Таким образом, Paenibacillus - факультативно аэробные организмы, которые производят множество промышленных ферментов и имеют потенциал для использования в различных отраслях промышленности [27]. Недавно были проведены обширные исследования ферментов Paenibacillus, но целлюлаза P. xylanilyticus еще не изучалась. В данном исследовании мы сообщили о клонировании, очистке и характеристике целлюлазы из P. xylanilyticus KJ-03, которая показала эффективность гидролиза различных полисахаридов. 2 Материалы и методы 2.1 Штаммы бактерий и условия культивирования Для культивирования P. xylanilyticus KJ-03 использовался триптический соевый бульон, дополненный 0,1% карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ). Escherichia coli (E. coli) JM109 и E. coli BL21 (trxB) были использованы в качестве клеток-хозяев для клонирования генов. В качестве клонирующего вектора использовали pUC118. (Takara, Япония). Рекомбинантную E. coli культивировали в бульоне Лурия-Бертани (LB), дополненном ампициллином (50 lg/mL) при 37 C. КМЦ и целлоолигосахариды были приобретены у компании Sigma chemical. Ферменты рестрикции и лигаза Т4 были приобретены у компании Takara (Япония). 2.2 Изоляция и идентификация штаммов, разлагающих полисахариды Штамм KJ-03 был выделен из образцов почвы поля Amorphophallus konjac с использованием триптического соевого агара (TSA), дополненного 0,2% КМЦ, глюкоманнаном, камедью бобов саранчи, хитином, березовым ксиланом и крахмалом, соответственно. Штаммы из образцов почвы инкубировали в течение 24 ч при 30 С, затем окрашивали 0,5% конго красным и промывали 1 М NaOH. Штаммы окрашивали раствором KI/I2 (2% KI, 0,2% I2) на амилазу. Штамм KJ-03 образовал большую желтую зону вокруг колоний и был окончательно отобран. Геномную ДНК P. xylanilyticus KJ-03 готовили стандартным методом, как описано Sambrook et al. [25]. Хромосомная ДНК, полученная из KJ-03, была подготовлена для анализа 16S рДНК. Полимеразную цепную реакцию проводили для амплификации кодирующей области 16S рДНК с использованием обоих праймеров, 50 -GAGTTTTGATCCTGGCTCAG-30 (позиция 9-27 в E. coli 16S рДНК) и 50 -AGAAAGG AGGTGATGATCCAGCC-30 (позиция 1,542-1,525 в E. coli 16S рДНК). Реакционную смесь подвергали 5 циклам амплификации (60 с при 95 С, 60 с при 37 С, 90 с при 72 С). После этого цикла проводили дополнительные 30 циклов амплификации (60 с при 95 С, 60 с при 55 С, 90 с при 72 С) с использованием термоциклера (Takara, Япония). Продукт ПЦР клонировали в вектор pGEM-T Easy (Promega, США). Была определена нуклеотидная последовательность и проведено филогенетическое дерево с помощью программы ClustalX. 2.3 Подготовка образцов для сканирующего электронного микроскопа Образец предварительно фиксировали 2% глутаральдегидом в 0,1 М какодилатном буфере (pH 7,2) с 0,1% MgSO4 в течение 30 мин при 4 С и центрифугировали для удаления буфера про-фиксации. Предварительно фиксированный образец дважды промывали 0,1 М какодилатным буфером (pH 7,2) в течение 1 ч и центрифугировали для удаления. Затем предварительно фиксированный образец фиксировали 1% тетроксидом осмия в 0,2 М какодилатном буфере (pH 7,4) при 4 С в течение 24 ч, центрифугировали для удаления фиксированного буфера и дважды промывали 0,2 М какодилатным буфером (pH 7,4) в течение 1 ч. Обезвоживание образца проводили в следующем порядке: 50% этанол (Et-OH) в течение 10 мин при 4 С (дважды), 70% Et-OH в течение 10 мин при 4 С (дважды), 80% Et-OH в течение 10 мин при 4 С (дважды), 90% Et-OH в течение 10 мин при 4 С (дважды), 95% Et-OH в течение 10 мин при комнатной температуре (дважды) и 100% Et-OH в течение 10 мин при комнатной температуре (дважды). Обезвоженный образец сушили гексадиметил-дисилазаном в течение 1 ч и центрифугировали для удаления гексадиметил-дисилазана. 2.4 Создание геномной библиотеки Геномная библиотека P. xylanilyticus KJ-03 была создана с использованием коммерческого фосмидного вектора pCC1FOS (Epicentre, Madison, WI). Тотальную геномную ДНК из P. xylanilyticus KJ-03 готовили стандартным методом, как описано Sambrook et al. [25]. Выделенная геномная ДНК была эффективно очищена путем пропускания через наконечник пипетки 100 раз. Для получения тупой, 50-фофорилированной ДНК проводили реакцию восстановления концов. Восстановленную ДНК электрофорезировали в 1% агарозе с низкой температурой плавления при 35 В в течение 12 ч, и фрагменты ДНК размером примерно 23-40 кб были извлечены из геля с помощью GELase (Epicentre, Madison, WI). Подготовленные фрагменты ДНК лигировали в фосмидный вектор и упаковывали с помощью упаковочного экстрактора MaxPlax Lamda (Epicentre, Madison, WI). Упакованный образец трансформировали в E. coli EPI300-T1R. 2.5 Субклонирование гена целлюлазы Клоны библиотеки, обладающие целлюлазной активностью, были отобраны на агаровой пластине LB, дополненной 0,5% CMC и 12,5 lg/mL хлорамфеникола. Клоны инкубировали в течение 2 дней при 37 С, окрашивали 0,5% конго красным и промывали 1 М NaCl. Клоны, образовавшие желтую зону вокруг колоний, отбирали путем окрашивания конго красным. Для субклонирования фосмидные клоны частично переваривали с помощью Sau3AI. Фрагменты ДНК фосмид размером 2-10 кб лигировали в pUC118/BamHI/CIAP и затем трансформировали в E. coli JM109. Клон (pCMC-1), содержащий ген целлюлазы, образовал желтую зону вокруг колоний на агаровой пластинке LB, содержащей 0,5% CMC. Анализ последовательности и поиск сходства в базе данных проводили с помощью BLAST в National Center for Biotechnology Information (NCBI). 2.6 Экспрессия и очистка рекомбинантной целлюлазы Целлюлаза, продуцируемая P. xylanilyticus KJ-03, была экспрессирована путем субклонирования гена с использованием pET-32a(?) (Novagen, Германия). Целлюлаза была амплифицирована методом ПЦР с праймерами CMC-EF-sp (50 -GCAGGATCCGCTCCTGATCACC AAGGC-30 ) и CMC-ER (50 -GAGGTCGACTTAAGAT GTTTGACCAAC-30 ). Эти праймеры были модифицированы так, чтобы содержать сайты ферментов рестрикции BamHI и SalI. Реакционная смесь объемом 50 л содержала 20 пмоль каждого праймера, 0,1 л геномной ДНК, 20 мМ dNTP и 0,25 U Ex Taq ДНК-полимеразы (TakaRa, Япония) и подвергалась 30 циклам амплификации (30 с при 95 С, 30 с при 59 С и 90 с при 72 С). Продукты ПЦР были переварены BamHI и SalI и лигированы в pET-32a(?). Рекомбинантная плазмида pET-CMC-sp была трансформирована в E. coli BL21 (trxB) для экспрессии белка. E. coli BL21 (trxB), несущую pET-CMC-sp, индуцировали для сверхэкспрессии 50 мМ изопропил-bD-тиогалактопиранозида (ИПТГ) при OD600 0,5 и культивировали еще 4 ч. Клетки собирали центрифугированием (6 000 об/мин в течение 10 мин при 4 С), а затем суспендировали в буфере для связывания (20 мМ фосфат натрия pH 7,4, 0,1 М NaCl, 5 мМ имидазол). Клетки разрушали с помощью звуковой обработки, а супернатант собирали центрифугированием (13 000 об/мин в течение 30 мин при 4 С). Аффинная колонка HisTrap (Amersharm Phamacia Biotech.) была уравновешена буфером для связывания, и супернатант был нанесен на колонку. Меченые белки элюировали элюирующим буфером (20 мМ фосфат натрия, pH 7,4, 0,1 М NaCl, 0,5 М имидазол). Элюированные фракции диализовали в течение ночи против 20 мМ натрий-фосфатного буфера и концентрировали на Amicon Ultra-4 (Millipore, Ирландия). Очищенные слитые белки переваривали энтерокиназой в течение 16 ч при 20 С, а затем несвязанные фракции собирали с помощью аффинной колонки HisTrap. 2.7 SDS-PAGE и зимограмма Концентрацию белка определяли по методу Брэдфорда [4]. Электрофорез полиакриламидного геля с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) проводили по методу Лаеммли [13]. Белки в геле окрашивали Coomassie Brilliant blue R-250. Для определения активности целлюлазы в гель добавляли 0,1% КМЦ. После электрофореза гель промывали в 25% изопропаноле, затем замачивали в 0,1 М цитратном буфере (pH 5,0) на 20 мин при 4 С. Гель инкубировали в течение 1 ч при 40 С, окрашивали 0,5% конго красным в течение 30 мин и промывали 1 М NaCl. 2.8 Ферментный анализ Реакционную смесь, содержащую 50 л 0,1% КМЦ, 199 л цитратного буфера (pH 6,0) и 1 л раствора фермента, инкубировали при 40 С в течение 15 мин. Количество восстанавливающих сахаров определяли модифицированным методом динитросалициловой кислоты (DNS) с использованием глюкозы в качестве стандарта [17]. Одна единица целлюлазной активности определялась как количество фермента, необходимое для образования 1 лмоль восстанавливающего сахара в мин. Оптимальная температура и pH фермента определялись стандартным анализом при различных температурах (от 20 до 80 C) и условиях pH (от pH 3 до 10,6). Для определения оптимального pH использовали 50 мМ различные буферы, цитрат (pH 3-6), фосфат натрия (pH 6-8), Трис-HCl (pH 8-9) и глицин-NaOH (pH 9-10,6). Температурную стабильность определяли путем предварительной инкубации при различных температурах, 40, 45 и 50 С без субстратов. pH-стабильность фермента определяли различными буферами при 4 C в течение 3 ч. Остаточную активность измеряли в стандартном анализе. Влияние химических веществ на активность фермента оценивали с помощью различных реагентов, таких как Ca2?, Cu2?, Fe3?, Hg2?, Mg2?, Mn2?, Zn2?, b-меркаптоэтанол и ЭДТА. Каждый реагент добавляли к раствору фермента в конечной концентрации 5 мМ. 2.9 Субстратная специфичность и гидролиз целлюлозы Субстратную специфичность целлюлазы в стандартных условиях определяли в реакциях с 1% КМЦ, авицелом, фильтровальной бумагой Whatman, ксиланом березы и 25 мМ 4-метилумбеллиферил b-D-целлобиозы (4-MUC). 0,025 г фильтровальной бумаги использовали на 0,25 мл реакционной смеси, и реакционную смесь часто преобразовывали во время инкубации. Ферментные анализы проводились в течение 2 ч при pH 6,0 и 40 C, и активность ферментов определялась методом DNS. Реакцию с 20 л 25 мМ 4-MUC, 379 л 50 мМ цитратного буфера (pH 6,0) и 1 л очищенного фермента инкубировали при 40 С в течение 15 мин. Реакцию останавливали добавлением 0,6 мл 1 М Na2CO3 и измеряли активность при 410 нм. Одна единица активности определялась как количество фермента, необходимое для высвобождения 1 лмоль 4-метилумбеллиферила в минуту. Для получения продуктов гидролиза целлоолигосахаридов реакционную смесь, содержащую 5 л 1% целлоолигосахаридов, 5 л цитратного буфера (pH 6,0) и 1 л очищенного фермента, инкубировали при 40 С в течение 2 ч. Продукты реакции целлоолигосахаридов анализировали методом тонкослойной хроматографии (ТСХ). Аликвоты (1 л) реакционных смесей анализировали на пластинах TLC. Пластины обрабатывали н-бутанолом:уксусной кислотой:водой (6:3:2), протравливали анилино-дифениламиновым реактивом (4 мл анилина, 4 г дифениламина, 200 мл ацетона и 30 мл 85% фосфорной кислоты) и запекали при 150 С в течение 3 мин. В качестве стандартных олигосахаридов использовали глюкозу, целлобиозу, целлотриозу, целлотетраозу и целлопентаозу (Sigma, США). 2.10 Номер доступа GenBank Нуклеотидные последовательности 16S рДНК и целлюлазы, изученные в данной работе, были присвоены номерам доступа GenBank HQ258920.1 и JN872736, соответственно. 3 Результаты 3.1 Изоляция и идентификация штамма KJ-03 Штамм KJ-03 был выделен из образца почвы, используемой для культивирования Amorphophallus konjac, с помощью триптического соевого агара (TSA), содержащего 0,2% различных полисахаридов. Этот штамм образовал большую желтую зону на TSA, содержащем 0,2% КМЦ, ксилан березового дерева, ксилан овсяной полбы, глюкоманнан и камедь бобов саранчи, и прозрачную зону на TSA, содержащем 0,2% крахмала. Штамм KJ-03, способный гидролизовать различные полисахариды, был определен как грамположительная палочковидная бактерия размером 0,3 лм 9 3 лм (данные не показаны). Оптимальный рост происходил при 28-30 C, хотя он также рос при 37 C. Колонии KJ-03 на TSA круглые и кремового цвета. Частичное секвенирование 16S рДНК показало, что он наиболее тесно связан с родом Paenibacillus, обладая наибольшим сходством (99%) со штаммом P. xylanilyticus YUPP-1. Идентичность 16S рДНК составила 98% для P. illinoisensis (AB073192), 96% для P. amylolyticus (D85396), 95% для P. pabuli (X60630), 94% для P. favisporus (AY208751) и P. turicensis (AF378694), 92% для P. chibensis (D85395), 91% для P. macquariensis (X57305) и 89% для P. glucanolyticus (D88514), соответственно [23] (рис. 1). Штамм был обозначен как P. xylanilyticus KJ-03. 3.2 Клонирование гена целлюлазы cel5A Десять из 2000 клонов, способных гидролизовать КМЦ, были отобраны из библиотеки генома KJ-03. Фрагмент ДНК Fos-CMC-6 был субклонирован в pUC118, и E. coli, несущие рекомбинантную плазмиду pCMC-1, образовали желтую зону вокруг колоний при окрашивании красным Конго для определения активности целлюлазы. Плазмида pCMC-1 состояла из 4 открытых рамок считывания (ORFs) (рис. 2a). Предсказанный белок ORF1 (370 аминокислот) имел 76% аминокислотную идентичность с внеклеточным раствор-связывающим белком семейства 1 Paenibacillus sp. Y412MC10. Предсказанные белки ORF2 (252 аминокислоты) и ORF3 (312 аминокислот) имели 66% и 52% аминокислотной идентичности, соответственно, с двумя членами семейства транскрипционных регуляторов Arac и гистидиновой киназой сенсорной сигнальной трансдукции Paenibacillus sp. Y412MC10. Анализ последовательности гена целлюлазы выявил единственную ORF длиной 1 743 п.н., которая кодировала белок из 581 аминокислоты с молекулярной массой 64 кДа. N-концевой анализ последовательности, предсказанный SignalP, содержал сигнальный пептид из 35 аминокислот (сайт расщепления перед Ala36). Анализ выведенной аминокислотной последовательности гена целлюлазы показал высокое сходство с целлюлазой, принадлежащей к семейству гликозилгидролаз 5, и был гомологичен с доменом DUF291 на С-конце гена целлюлазы (рис. 2b). 3.3 Экспрессия и очистка слитого белка Cel5A в E. coli Cel5A был экспрессирован в E. coli в виде слитого белка. Слитый белок экспрессировался на высоком уровне при индукции 50 мМ ИПТГ и был очищен с помощью Ni-аффинной хроматографии. Анализ SDS-PAGE очищенного фермента выявил единственную полосу приблизительно 64 кДа, лишенную сигнального пептида (рис. 3). Клеточный экстракт E. coli, содержащий Cel5A, имел специфическую активность 4,8 Ед/мг, и фермент был очищен в 6,4 раза с выходом восстановления 19%. Очищенный фермент показал сильную характерную полосу в SDS-PAGE, содержащем 0,1% CMC. Эти результаты показали, что очищенный фермент является очевидной целлюлазой, произведенной KJ-03. 3.4 Характеристика Cel5A Влияние pH на активность очищенного фермента исследовали в различных буферах в диапазоне от pH 3,0 до 10,6 (рис. 4a). Очищенный фермент проявлял максимальную активность при pH 5,0, а относительная активность при pH 6,0 составляла 77%. Кроме того, Cel5A сохранял до 40% своей оптимальной активности при pH 7,0-8,0; однако при pH 9,6-10,6 активность не наблюдалась. Очищенный фермент был стабилен после инкубации в течение 3 часов в цитратном буфере (pH 6,0). Он был кислотолабилен при pH 6,0 и стабилен в слабощелочных условиях в диапазоне pH 6,0-8,0 (рис. 4b). Очищенный фермент был стабилен при температуре от 30 до 70 С, и резко снижался до 62% от первоначальной активности после инкубации в цитратном буфере (pH 5,0). Оптимальная активность фермента была определена на уровне 40 C, а более 65% максимальной активности наблюдалось при 60 C (рис. 5a). Кроме того, Cel5A проявлял примерно 40% активности при 20 и 80 С. Для определения термостабильности фермента его инкубировали при 40, 45 и 50 С. Целлюлаза сохраняла 86 и 66% своей активности при инкубации при 40 и 45 С в течение 1 ч. При повышении температуры инкубации до 50 С остаточная активность резко снизилась на 74% через 20 мин и оставалась стабильной после 1 ч инкубации при 40 С (рис. 5б). Эти результаты показали, что KJ-03 Cel5A обладает оптимальной активностью при 40 C и сохраняет активность при высоких температурах. Влияние различных ионов металлов и других реагентов на активность Cel5A изучали при 40 С в течение 15 мин после предварительной инкубации при 40 С в течение 30 мин (табл. 1). Ионы Ca2? и Cu2? увеличивали активность целлюлазы на 38 и 35% от контроля, соответственно. Ионы Fe3? и Hg2?, напротив, сильно ингибировали, а Zn2? и Mn2? снижали относительную активность до 64% и 50%, соответственно. Mg2? не влиял на активность фермента. ЭДТА и b-меркаптоэтанол ингибировали его активность. 3.5 Субстратная специфичность и анализ продуктов гидролиза Для определения субстратной специфичности очищенный фермент инкубировали с субстратами КМЦ, авицелом, фильтровальной бумагой и ксиланом березы. Фермент показал самую высокую активность в отношении КМЦ (0,2 Ед/мг), тогда как в отношении авицела, фильтровальной бумаги и березового ксилана активность составила 64 ± 6,72%, 10 ± 0,11% и 59 ± 1,89% соответственно. Гидролиз был более эффективным для КМЦ, чем для кристаллической целлюлозы, такой как авицел и фильтровальная бумага. Конечные продукты гидролиза целлопентаозы ферментом, основными продуктами гидролиза которых были целлобиоза и целлотриоза, а второстепенными - целлотетраоза и глюкоза, были определены методом ТСХ (рис. 6). Фермент также сильно разлагал целлотетраозу на целлотриозу и глюкозу, но целлобиоза была получена как минорный продукт гидролиза. Фермент не гидролизовал целлобиозу и целлотриозу, и был менее активен в отношении целлотетраозы по сравнению с целлопентаозой. 4 Обсуждение В этом докладе мы описываем клонирование, очистку и характеристику гена целлюлазы cel5A из P. xylanilyticus KJ-03, который был выделен из поля Konjac. Выведенные аминокислоты cel5A содержали каталитический домен семейства гликозилгидролаз 5 и домен DUF291. Семейство GH 5 содержало консервативный мотив с консенсусной областью, [LIV]-[LIVMFYWGA](2)-[DNEQG]-[LIVMGST]-{SENR}-N-E-[PV]-[RHDNSTLIVFY]. Целлюлаза P. xylanilyticus KJ-03 также сохранила консенсусную область LMFESINEPR (данные не показаны). Остаток Glu191 в KJ-03, который может играть важную роль в каталитических реакциях, опосредованных семейством GH 5, был сохранен в мотиве семейства GH 5. В то время как глутамат также действует как каталитический нуклеофил и донор протонов в этом семействе. Функция домена DUF291 неизвестна. Структура фермента состоит из Ig-подобной складки, и DUF291 может опосредовать взаимодействие с углеводами [5]. Этот анализ показал относительно высокое сходство между этим и другими генами целлюлаз семейства GH 5, включая P. polymyxa (67%), P. lautus (65%), Micromonospora sp. (64%), B. halodurans (56%), Dictyoglomus turgidum (35%) и Clostridium thermocellum (32%). Целлюлаза KJ-03 секретируется во внеклеточную среду, поскольку на N-конце фермента имеется сигнальная пептидная последовательность. Некоторые представители рода Paenibacillus способны продуцировать различные полисахариды, которые гидролизуются внеклеточными ферментами, такими как целлюлаза, пектиназа, ксиланаза, амилаза и b-глюкозидаза [12]. Кроме того, Cel5A может разлагать такие полисахариды, как КМЦ, ксилан, камедь саранчи, крахмал и хитин, что свидетельствует о ее участии в углеводном обмене растений; таким образом, она может быть привлекательным кандидатом для производства биоэтанола и целлюлозы. По сравнению с некоторыми целлюлазами P. campinasensis BL11 (pH 7,0), P. polymyxa GS01 (pH 6,0) и B. amyloliquefaciens DL-3 (pH 7,0), Cel5A проявляла максимальную активность в отношении CMC при 40 C и pH 5,0, что указывает на то, что она демонстрирует оптимальную активность при более низком pH [5, 12, 14]. Оптимальная активность Cel5A была при 40 C, что аналогично активности Erwinia chrysanthemi PY35 (40 C) и выше, чем у Pseudomonas sp. SK38 (30 C) [18, 24]. Целлюлазы, производимые Paenibacillus sp., такими как P. polymyxa GS01, Paenibacillus sp. strain B39 и P. campinasensis BL11, оптимально активны при 50-60 C, в то время как оптимальная температура Cel5A оказалась ниже, чем у других целлюлаз Paenibacillus sp. [5, 12, 27]. Равные концентрации (5 мМ) ионов Ca2? и Cu2? стимулировали активность целлюлазы KJ-03. Аналогично, эндоглюканаза Paenibacillus sp. штамма B39 и P. campinasensis BL11 из семейства 5 GH показала небольшое увеличение активности с Ca2? [12, 27]. Эти результаты показали, что Ca2? важен для каталитической активности. Поскольку Hg2? может связывать тиоловые группы аминокислот фермента, остатки триптофана или карбоксильные группы, активность целлюлазы ингибировалась Hg2 , в то время как ЭДТА снижала активность фермента, что указывает на то, что ЭДТА удаляет ионы металлов для активации фермента. Восстанавливающий агент b-меркаптоэтанол немного снижал активность целлюлазы, предполагая, что дисульфидные связи необходимы для поддержания структуры фермента. Целлюлаза KJ-03 гидролизовала КМЦ более эффективно, чем нерастворимые целлюлозные субстраты, такие как авицел и фильтровальная бумага, и проявляла более высокую активность в отношении КМЦ, чем авицел или фильтровальная бумага, что сходно с характеристиками целлюлаз других представителей семейства GH 5, включая P. campinasensis BL11, Paenibacillus sp. strain B39 и Vibrio sp. G21 [5, 6, 12]. Кроме того, Cel5A гидролизует кристаллическую целлюлозу (такую как авицел и фильтровальная бумага), а также ксилан березы. В частности, растительные клетки нерастворимы, поэтому в качестве субстрата для исследований с участием эндоглюканаз широко используется хорошо растворимая целлюлоза - КМЦ [16]. Использование КМЦ для целлюлазной активности предполагает участие слабых целлюлолитических ферментов, поскольку большинство организмов, не способных гидролизовать целлюлозу, могут разлагать КМЦ. Целлюлаза KJ-03 может разлагать нерастворимую целлюлозу (авицел) с относительной активностью 64%, и поэтому ее можно использовать для получения растворимых сахаров из нерастворимой целлюлозы при производстве биоэтанола. Кроме того, Cel5A разлагает целлотетраозу и целлопентаозу, но не целлобиозу и целлотриозу. Другие целлюлазы обычно дают целлобиозу и целлотриозу в качестве конечных продуктов из целлотетраозы; однако Cel5A в основном производит целлотриозу в качестве конечного продукта, с небольшим количеством целлобиозы. Продукты гидролиза, полученные из целлобиозы и целлотриозы при опосредованном целлюлазой гидролизе KJ-03, были похожи на продукты гидролиза CelAM11 и Cel5A из E. cellulosolvens [11, 28]. CelAM11 и Cel5A из E. cellulosolvens преимущественно гидролизовали целлотетраозу до целлобиозы, тогда как Cel5A из KJ-03 в основном продуцировал целлотриозу и глюкозу. Эти результаты показали, что паттерны очищенного фермента на TLC были связаны с эндоглюканазной активностью, но отличались от других целлюлаз [6, 11, 28]. В заключение, мы клонировали и охарактеризовали ген целлюлазы из P. xylanilyticus KJ-03, который принадлежит к семейству GH 5. Учитывая способность фермента функционировать в широком диапазоне pH и температуры, целлюлаза KJ-03 имеет потенциал для промышленного применения. Целлюлазы используются для производства биоэтанола из лигноцеллюлозной биомассы. Этот фермент может разлагать целлюлозные материалы из лигноцеллюлозной биомассы и генерировать ферментируемые сахара. Поэтому рекомбинантный Cel5A может быть ценным для повышения эффективности производства сахара и биоэтанола. |