Бактериологическая диагностика туберкулёза. Контрольные вопросы по теме занятия Возбудитель туберкулеза история открытия, основные свойства, таксономическое положение
 Скачать 176.5 Kb.
|
|
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ КАФЕДРА ФТГОИОПУЛЬМОНОЛОГИИ СОВРЕМЕННАЯ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ТУБЕРКУЛЕЗА Минск 2003 Методические рекомендации  , УДК 616.24-002.5-078 (075.8) ББК 55.4 я73 С 56 Авторы: канд. мед. наук, асе. Г.С. Авдеев; ст. науч. сотр. НИИ пульмонологии и фтизиатрии О.М. Залуцкая; канд. мед. наук, доц. П.С. Кривонос; д-р мед. наук, рук. отдела иммуноморфологических исследований Л.К. Суркова; канд. мед. наук, асе. В.В. Пылишев Рецензент д-р мед. наук, доц. каф. фтизиопульмонологии Белорусской медицинской академии последипломного образования А.Н. Лаптев Утверждено Научно-методическим советом университета в качестве методических рекомендаций 28.05.2003 г., протоколе» 7 Современная бактериологическая диагностика туберкулеза: Метод, рекомен-С 56 дации / Г.С. Авдеев, О.М. Залуцкая, П.С. Кривонос и др. - Мн.: БГМУ, 2003. - 22 с. Рассматриваются современные методы бактериологической диагностики туберкулеза. В частности подробно излагаются методики забора материала для исследования, бактериоскопическое исследование, люминисцентная микроскопия, культуральное исследование, биологические методы и основные молекулярно-генетические методы диагностики туберкулеза. Предназначаются для студентов 4-6 курсов медицинского факультета иностранных учащихся, лечебного, педиатрического, медико-профилактического факультетов, для клинических ординаторов, стажеров и врачей-фтизиатров. УДК 616.24-002.5-078 (075.8) ББК 55.4 я73 © Белорусский государственный медицинский университет, 2003 9. Молекулярно-генетические методы диагностики инфекционных заболеваний. Контрольные вопросы по теме занятия:
УЧЕБНЫЙ МАТЕРИАЛ Возбудитель туберкулеза Род Mycobacterium— единственный представитель группы 21 «Микобактерии». Согласно девятому изданию «Определителя бактерий Берджи» этот род объединяет свыше 100 видов микобактерии; в клиническом диагностическом материале обычно определяется 10-12 видов микобактерии, 6 из которых патогенны для человека. Это М. tuberculosis, M. bovis, M. qfricanum, M. avium, М. хепориМ. fortuitum. Хотя клеточная стенка микобактерии сходна с клеточной стенкой грамположительных бактерий и представляет собой многослойный пептидогликановый комплекс, с ней связаны преимущественно липиды (мико-ловые кислоты, воски, фосфолипиды и ацетилированные трегалозы), а не белки и полисахариды, как у других бактерий. Это придает клеточной стенке микобактерии сильные гидрофобные свойства. В дополнение к липидам, которые могут составлять до 60% клеточной стенки, клетки микобактерии содержат углеводы и растворимые белки. Клеточная стенка микобактерии создает гидрофобный барьер, затрудняющий проникновение в клетку водорастворимых соединений. Вследствие этого микобактерии демонстрируют весьма медленную скорость роста и являются естественно устойчивыми к химическим воздействиям, в том числе к кислотам, спиртам и к большинству используемых в настоящее время антибиотиков. Поэтому выбор препаратов для лечения больных туберкулезом и другими заболеваниями, вызываемыми микобактериями, ограничен. Клетки микобактерии прямые или слегка изогнутые, имеют размеры 0,2-0,7 х 1,0-10 мкм. Микобактерии не образуют спор, жгутиков, мицелия и 4 капсул, одцако имеют микрокапсулу, отделенную от клеточной стенки осмие-фобной зоной. Типовой вид рода Mycobacterium— М. tuberculosis(МБТ). Микобактерии характеризуются плеоморфизмом: клетки в молодых культурах имеют палочковидную форму, в старых — чаще кокковидную. Микобактерии иногда образуют L-формы, сохраняющие инфекционностьг а также фильтрующиеся формы (их патогенетическая роль изучена недостаточно). Вирулентные штаммы М. tuberculosisобладают так называемым*корд-фактором (трегалоза-6,6'-димиколат), обусловливающим слипание бактериальных клеток в микроколониях. Микобактерии являются аэробами, но способны расти в факультативно анаэробных условиях; концентрация С02 5-10% способствует более быстрому росту. Размножаются делением, время генерации составляет 14-18 часов (для сравнения у E.coli— 20 минут). У микобактерии направления репликативной вилки и транскрипции совпадают только у 56% генов (для сравнения, у Bacillussubtilisэтот показатель составляет 78%), что является еще одной причиной медленного роста. Для роста invitroмикобактерии нуждаются в белковом субстрате и глицерине, а также в углероде, хлоре, сере, фосфоре, азоте, факторах роста (биотине, никотиновой кислоте, рибофлавине и др.), в ионах (Mg2+, K+, Na+, Fe2+). Температурный оптимум составляет 37-3 8°С, оптимум рН 7,0-7,2. Диагностический материал для исследования на туберкулез При исследовании с целью выявления МБТ можно использовать любой патологический материал: мокроту, которую выделяет больной, или полученную после раздражающей ингаляции; бронхиальный секрет; бронхоальвеоляр-'ный смыв (БАС); материал катетер- и аспирационной биопсии, полученный при бронхоскопии; аспираты из трахеи; экссудат; транссудат из плевральной и брюшной полостей; гной из натечников и свищей; мочу; спинномозговую жидкость; содержимое открытых ран; менструальную кровь; соскобы эндометрия; сперму; секрет предстательной железы; пунктаты яичек; биопсийный, аутоп-сийный материал; органы экспериментальных животных; смывы с предметов больничной среды и др. Использование бронхоскопии для взятия микробиологических образцов оправдано только при многократных неудачных попытках получения материала более простыми способами у больных с неясным диагнозом. В ряде случаев, когда больному трудно откашлять мокроту, прибегают к специальным методам, например, стимуляции выделения мокроты. Мокрота, собранная после стимуляции, по внешнему виду напоминает слюну, поэтому такой материал перед направлением в лабораторию снабжают специальной маркировкой («индуцированная мокрота»). Все клинические образцы, предназначенные для бактериологического исследования, должны быть собраны до или в течение первых нескольких дней химиотерапии, поскольку в некоторых случаях нескольких дней специфической терапии достаточно для того, чтобы прекратить бактериовыделение, и тогда бактериологическое исследование бесполезно. 5 Эффективность микробиологической диагностики туберкулеза в значительной степени зависит от правильности сбора диагностического материала. От соблюдения правил сбора, хранения и транспортировки диагностического материала зависит также эпидемиологическая безопасность окружающих. Мокроту (основной диагностический материал для исследования на туберкулез) собирают в специальные стеклянные баночки емкостью около 50 мл с герметически закрывающимися крышками. Необходимо использовать баночки с широким горлышком (диаметр не менее 35 мм), чтобы пациент мог легко собрать мокроту без контаминации наружной поверхности баночки. Мокроту можно собирать также в одноразовые плевательницы, которые после использования подлежат уничтожению. Посуда для сбора мокроты должна быть сделана из прозрачного материала, чтобы можно было определить количество и состояние собранного материала, не снимая крышку с баночки. Мокрота для исследования должна собираться под контролем медицинского персонала с обязательным проведением инструктажа о правилах сбора мокроты, которые сводятся к следующему:
Во время продуктивного кашля пациента образуется аэрозоль, содержа-щий МБТ. В целях обеспечения мер безопасности при откашливании мокроты пациентом и предупреждения инфицирования медицинского персонала потенциально заразными аэрозолями сбор мокроты должен осуществляться в специально оборудованном помещении, оснащенном бактерицидными лампами, локальной вытяжной вентиляцией, в присутствии медицинского персонала с обязательным проведением инструктажа о правилах сбора мокроты. Если условия б этого не позволяют, то сбор мокроты проводят вне помещения (на открытом воздухе) или в помещении, где нет других людей, под контролем медицинского работника. В любом случае нельзя собирать мокроту в замкнутых помещениях. Образцы мокроты от одного пациента не объединяют в одном сосуде, а направляют в лабораторию с указанием сведений о пациенте для каждой пробы. Доставку мокроты в лабораторию осуществляют сразу после взятия в плотно закрытом промаркированном контейнере, помещенном в бикс для транспортировки. Если транспортировка откладывается, собранную мокроту следует хранить в холодильнике при 4°С не более одних суток или в консерванте не более трех суток. Методы бактериологической диагностики туберкулеза Бактериологическая лаборатория играет существенную роль в выявлении, диагностике туберкулеза, выборе рациональных схем химиотерапии и оценке их эффективности. Бактериологическая диагностика включает обработку клинического материала, микроскопическое исследование, выделение микроорганизма с применением культуральных методов, идентификацию микобактерий с использованием бактериологических и биохимических тестов, а также определение лекарственной чувствительности микобактерий. Существует несколько групп методов, используемых для выявления МБТ в различном диагностическом материале: рутинные (микроскопия, культураль-ное исследование), биологические (биопроба, определение вирулентности штаммов МБТ), автоматические системы (MGIT, BACTEC, MB/BacT, ESPCultureSystemи др.), молекулярно-генетические методики (PCR, LCR, NASBA, Q-Betaи др.). Каждый из этих методов обладает определенной чувствительностью и специфичностью, что необходимо учитывать при клинической интерпретации полученных результатов. Таблица 1 Чувствительность различных методов бактериологической диагностики туберкулеза
Таблица 2 Длительность бактериологического исследования
7 В таблицах 1 и 2 представлены чувствительность различных методов бактериологической диагностики туберкулеза и длительность проведения бактериологического исследования. Бактериоскопическое исследование. Бактериоскопическое исследование мокроты с окраской мазка по Цилю-Нильсену для выявления кислотоустойчивых микобактерий (КУБ) является наиболее быстрым, доступным и экономически эффективным из существующих методов выявления больных туберкулезом. Оно может быть осуществлено в любой клинико-диагностической лаборатории (КДЛ) лечебно-профилактических учреждений всех уровней и ведомств. Бактериоскопия мокроты представляется чрезвычайно информативной для выяснения эпидемиологической опасности пациента для окружающих, которая коррелирует с числом микобактерий в образце. Бактериоскопическое исследование, проведенное должным образом, имеет положительную прогностическую ценность для легочного туберкулеза, более 90%. Разрешающая способность данного метода составляет 50-100 тыс. микобактерий в 1 миллилитре мокроты и существенно зависит от ряда факторов: правильности сбора мокроты, подготовленности лабораторного персонала и разрешающей способности используемых микроскопов. При микроскопии мазков, приготовленных из проб, взятых в течение трех последовательных дней, результативность метода повышается на 20-30%. Однако нет необходимости использовать более 4-5 проб мокроты. Метод окраски по Цилю-Нильсену наиболее часто используется при бак-териоскопическом выявлении микобактерий. Он заключается в следующем: мазки мокроты окрашивают фуксином при нагревании, затем обесцвечивают солянокислым спиртом и докрашивают метиленовым синим. В результате микобактерий окрашиваются в малиновый цвет, а фон — в синий. Это специфическое окрашивание обусловлено способностью микобактерий удерживать краситель при обработке кислотой или спиртом. В бактериологических лабораториях, выполняющих большое количество исследований (100 и более ежедневно), используется люминесцентная микроскопия. Данный метод основан на способности липидов микобактрий воспринимать люминесцентные красители (акридиновый оранжевый, аурамин, родамин и др.) и затем светиться при облучении их ультрафиолетовыми лучами. В зависимости от красителей, микобактерий туберкулеза дают четкое ярко-красное свечение на зеленом фоне или золотисто-желтое - на темно-зеленом фоне. Метод люминесцентной микроскопии обладает большей чувствительностью, чем световая микроскопия, особенно в сочетании с методом обогащения диагностического материала (микроскопия осадка), поскольку люминесцентная микроскопия позволяет обнаружить измененные микобактерий, утратившие кислотоустойчивость, в связи с чем они не выявляются при бактериоскопии по Цилю-Нильсену. Мазки для люминесцентной микроскопии готовят из осадка, полученного после обработки диагностического материала детергентом с последующим отмыванием либо нейтрализацией. При положительном результате бактериоскопии мазков, окрашенных флуорохромами, должна быть проведена подтверждающая микроскопия мазков, окрашенных по Цилю-Нильсену. 8 Бактериоскопическое исследование необходимо проводить очень тщательно. Обычно образец исследуют в течение 15 минут (что соответствует просмотру 300 полей зрения), чтобы сделать заключение об отсутствии или наличии КУБ в препарате. При окрашивании флюорохромами для исследования одного мазка требуется меньше времени. Основным диагностическим материалом для бактериоскопии на КУБ служит мокрота. Результаты бактериоскопического исследования на КУБ других биологических материалов (различных жидкостей, тканей, гноя, мочи и т.д.) имеют ограниченное значение для диагностики туберкулеза. Так, исследование мазков из осадка центрифугированной мочи не всегда позволяет получить достоверные результаты, поскольку в моче могут присутствовать нетуберкулезные микобактерии. Поэтому выявление КУБ в моче не всегда свидетельствует о наличии специфического процесса. В мазках из осадка промывных вод желудка и других материалов могут обнаруживаться кислотоустойчивые са-профиты, которые легко спутать с МБТ. Результат микроскопического исследования позволяет сделать заключение только о наличии или отсутствии в препарате кислотоустойчивых бактерий. Достоверно диагноз «туберкулез» можно установить только после выделения из клинического материала культуры МБТ с помощью культурального метода и ее идентификации. Отрицательный результат бактериоскоскопического исследования не исключает диагноз «туберкулез», так как в мокроте некоторых пациентов может содержаться меньше микобактерии, чем позволяет выявить бактериоскопия. Количество обнаруженных КУБ определяет степень тяжести заболевания и опасности больного для окружающих. Следовательно, исследование должно быть не только качественным, но и количественным. Регистрация результатов с указанием количества обнаруженных КУБ представлена в табл. 3. Таблица 3 Градация результатов микроскопического исследования при окраске по Цилю-Нильссну (ЮООх)
9 В современных эпидемиологических и экономических условиях бакте-риоскопическое исследование мокроты у обратившихся в ЛПУ за врачебной помощью лиц с клиническими симптомами, подозрительными на туберкулез, является приоритетным направлением в тактике раннего выявления данного заболевания. Возрастание роли этого метода связано также с возникновением в последние годы остропрогрессирующих форм заболевания, сопровождающихся выраженными клиническими проявлениями и обильным бактериовыделением. Культуральное (бактериологическое) исследование. Начиная со вре мени проведения работ Коха и до 1924 г. усилия ученых, направленные на по иски методов выделения чистых культур микобактерий туберкулеза, не имели особых успехов. В 1924 г. Левенштейн и Сумиоши установили, что кислоты и щелочи в известных концентрациях и при определенных экспозициях убивают сопутствующую микрофлору, не влияя на жизнеспособность МБТ. Этот метод при непрерывном совершенствовании стал приобретать практическое значение. < В настоящее время бактериологическое (культуральное) исследование биологического материала на МБТ благодаря его высокой чувствительности (от 10 до 100 жизнеспособных микробных клеток в 1 мл исследуемого материала) и специфичности в сочетании с микроскопическим методом является «золотым стандартом» в диагностике туберкулеза. Бактериологическое исследование на туберкулез выполняется в специализированных бактериологических лабораториях противотуберкулезных диспансеров или посевных пунктах. Материал для бактериологического исследования собирают асептически. Перед проведением бактериологического исследования поступившие в лабораторию пробы обрабатывают растворами кислот или щелочей с последующим центрифугированием. Это необходимо для разжижения и концентрации образца, а также для предотвращения контаминации, поскольку пробы мокроты вязкие по консистенции и содержат большое количество микрофлоры. Около 1 мл разжиженного и деконтаминированного клинического образца засевают в пробирки со средой и инкубируют при 37°С в течение 10 недель. Для культивирования микобактерий используют плотные (яичные, агаровые) и жидкие питательные среды. Яичные среды содержат цельные яйца или яичный желток, а также фосфолипиды, белки и другие ингредиенты. С целью предотвращения контаминации к среде добавляют некоторые красители, например, малахитовый зеленый, а также антибиотики. Поэтому яичные среды (Левеншейна-Иенсена, Финна), на которых культивируют микобактерий, имеют сине-зеленый цвет. Использование яичных сред позволяет получить видимый рост колоний М. tuberculosisчерез 18-24 дня в виде сухого морщинистого налета кремового цвета. Однако качество ингредиентов, из которых готовится среда, иногда значительно варьирует, что может влиять на воспроизводимость результатов. По сравнению с яичными агаровые среды имеют ряд преимуществ: они готовятся из полусинтетических основ, что обеспечивает более стабильное качество и воспроизводимость результатов. Детекция роста МБТ на агаровых средах возможна через 10-14 дней. Однако агаровые среды дороже, требуют присутствия С02 в атмосфере и инкубируются в термостате не более |