Бактериологическая диагностика туберкулёза. Контрольные вопросы по теме занятия Возбудитель туберкулеза история открытия, основные свойства, таксономическое положение
 Скачать 176.5 Kb.
|
|
16 Пять 1-10 бактериальных клеток в 1 мл биологического материала. Специфичность реакции — 97-98%. Исследованию методом ПЦР подлежат мокрота, бронхиальный секрет, плевральная и другие жидкости, моча, периферическая и менструальная кровь, соскобы эпителиальных клеток цервикального канала. Следует отметить, что с помощью ПЦР нельзя определить активность туберкулезного процесса, поэтому интерпретировать полученный результат необходимо с учетом клинико-рентгенологических данных. Метод ПЦР можно использовать как дополнительный диагностический метод при дифференциальной диагностике в комплексе с другими методами лабораторной диагностики туберкулеза и нельзя использовать в качестве скринингового метода для выявления больных туберкулезом из-за возможности ложноположительных результатов. Кроме того, препятствием для широкого использования данного метода служит необходимость использования дорогостоящего оборудования и диагностических наборов. ПЦР — не единственный амплификационный метод детекции микобак-терий. В табл. 5 представлены другие амплификационные методики, позволяющие обнаруживать микобактерии. Таблица 5 Амплификационные методы, используемые для детекции микобактерии
Применение амплификационных методик для выявления различий в генетической структуре чувствительных и устойчивых штаммов — еще один новый подход к определению лекарственной чувствительности микобактерии. Проводить данные исследования стало возможным благодаря определению нуклеотидных последовательностей генов, мутации в которых приводят к возникновению резистентности к противотуберкулезным препаратам. При использовании амплификационных методов значительно сокращаются сроки исследования. Главным ограничением для их применения служит существование других механизмов резистентности. С помощью амплификационных методик не 1>бнпружинается около 10% случаев устойчивости к рифампицину, 20% — к июмиашду и 40% к сфептомицину. Поэтому молекулярные методы, веро- 17 ятно, никогда не смогут полностью заменить классические культуральные методы определения лекарственной устойчивости МВТ. Генотинирование. Исследования по эпидемиологии туберкулеза в течение длительного времени тормозились отсутствием точного и воспроизводимого метода субтипирования клинических изолятов для изучения распространения штаммов МВТ. Совершенствование молекулярно-генетических методов позволило разработать высокоспецифичные маркеры для типирования штаммов МБТ. Штаммы МБТ невозможно различить с помощью рутинных биохимических тестов или серологических методов. Устойчивость к ПТП в некоторых случаях является воспроизводимым маркером, но этот маркер не является общепринятым. До недавнего времени единственным пригодным методом для типирования штаммов МБТ служил метод фаготипирования. Однако он технически сложен и использовался в немногих лабораториях, поскольку не позволяет добиться необходимой специфичности, и с его помощью можно выделить лишь ограниченное число фаготипов. Генотипирование позволяет использовать в качестве маркеров тонкие различия в хромосоме микобактерий, не вызывающие фенотипических различий. Поскольку получаемая в результате исследования картина индивидуальна для конкретного штамма (как отпечатки пальцев для человека), данный метод получил название геномной дактилоскопии (DNA fingerprint). Для типирования чаще всего используют специфичную для М. tuberculosis повторяющуюся мобильную последовательность ДНК, которая демонстрирует необходимый уровень полиморфизма. Число копий этой последовательности высоко у большинства изолятов М. tuberculosis (7-20), низко у большинства изолятов М. bovis от животных (1-4) и у различных штаммов М. bovis BCG (1-2). Метод генотипирования основан на использовании рестрикционных эн-донуклеаз, которые распознают специфические последовательности и нарезают ДНК на фрагменты разной длины. Содержание гуанина и цитозина в микобак-териальной ДНК высоко (около 65%), поэтому целесообразным признано использование энзимов, распознающих фрагменты, богатые аденином и тимином, и разрезающих ДНК на небольшое число крупных фрагментов. Стандартный метод предусматривает следующие этапы: выделение ми-кобактериальной ДНК, ее рестрикцию с использованием эндонуклеаз, разделение рестрикционных фрагментов путем электрофореза и детекцию последовательности-мишени посредством гибридизации с меченой ДНК. Полученная в результате совокупность электрофоретических полос (фингерпринт) отражает число копий данной последовательности ДНК (каждая полоса соответствует одной копии последовательности-мишени), а также гетерогенность в длине рестрикционных фрагментов, которая обычно является результатом точковых мутаций, создающих или уничтожающих сайты рестрикции, либо делеций или других хромосомных перестроек, что нашло отражение в термине «полиморфизм длины рестрикционных фрагментов» (Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP). 18 Использование метода в стандартном варианте осложняется необходимостью экстракции почти 1 мкг ДНК из каждого изолята. Поэтому в настоящее ■ремя разработаны два варианта метода геномной дактилоскопии, основанные на использовании ПЦР. Они позволяют использовать очень маленькое количество ДНК и получать картину, сопоставимую по специфичности со стандартным методом. В таких вариантах исследование может быть выполнено на бактериях из нескольких колоний или старых нежизнеспособных культурах, а также клинических бактериоскопически положительных образцах. Выделенные при вспышке заболевания изоляты МБТ с большой долей вероятности демонстрируют одинаковую генотипическую картину. Поэтому изоляты, связанные с конкретной вспышкой заболевания, можно легко идентифицировать. Однако пока не проведено масштабное исследование с целью определения предполагаемого числа возможных генотипических вариантов в конкретном географическом регионе. Первым применением генотипирования изолятов МБТ было отслеживание вспышек туберкулеза. Так, с использованием этого метода была установлена причина вспышки туберкулеза, вызванной инъекциями контаминированных лекарственных препаратов. Эта работа продемонстрировала полезность геномной дактилоскопии для проведения эпидемиологических исследований и показала, что с использованием данного метода можно идентифицировать изоляты, связанные со вспышкой, среди большого количества изолятов. Доказана полезность геномной дактилоскопии в отслеживании распространения полирезистентных штаммов. В результате нескольких исследований было описано нозо-комиальное распространение таких штаммов среди ВИЧ-инфицированных больных. В каждом из таких исследований были идентифицированы 1 или 2 штамма, связанные со вспышкой заболевания. Используемая для типирования последовательность ДНК не кодирует лекарственную чувствительность, поэтому резистентность к ПТП не влияет на картину фингерпринта. Однако в данном случае фингерпринт может служить маркером данного штамма и указывать на лекарственную резистентность новых изолятов с таким же фингерпринтом. При эпидемиологических исследованиях вспышек полирезистентного туберкулеза лекарственная устойчивость указывает на возможность эпидемиологической связи между штаммами, геномная дактилоскопия обеспечивает окончательное доказательство. Метод даже более полезен для проведения исследования полирезистентных изолятов, поскольку это единственный метод доказательства родства штаммов. Широкомасштабное применение этого метода ко всем изолятам в данной географической зоне может выявить циркулирующие штаммы МБТ и идентифицировать ранее неизвестные источники распространения туберкулезной инфекции. Однако в настоящее время еще не установлено, является ли такое применение метода практически осуществимым, поскольку лабораторное изучение изолятов МБТ легче, чем исследования, необходимые для отслеживания распространения штаммов с использованием геномной дактилоскопии. Метод можно также использовать для подтверждения кросс-контаминации культур и других ошибок, допускаемых при лабораторном ис-гислонштн 19 ЗАДАНИЕ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ СТУДЕНТОВ
ЛИТЕРАТУРА Основная 1. Перелъман М.И., Корякин В.А., Протопопова Н.М. Фтизиатрия. - 1996. Дополнительная
\ ОГЛАВЛЕНИЕ Мотивационная характеристика темы, требования к исходному уровню знаний 3 Контрольные вопросы из смежных дисциплин 3 Контрольные вопросы по теме занятия 4 Учебный материал , 4 Возбудитель туберкулеза 4 Диагностический материал для исследования на туберкулез 5 Методы бактериологической диагностики туберкулеза 7 Биологические методы диагностики туберкулеза 14 Молекулярно-генетические методы диагностики туберкулеза 15 Задание для самостоятельной работы студентов 20 Литература 20 Учебное издание Авдеев Георгий Сергеевич Залуцкая Оксана Михайловна Кривонос Павел Степанович и др. СОВРЕМЕННАЯ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ТУБЕРКУЛЕЗА Методические рекомендации Ответственный за выпуск Г.С. Авдеев Редактор Л.В. Харитонович Компьютерная верстка Н.М. Федорцовой Подписано в печать & &, С5.03Формат 60x84/16. Бумага писчая «Снегурочка». Печать офсетная. Гарнитура «Times». Усл. печ. л. j$9. Уч.-изд. л. 4 £/9- Тираж j5ЈC3K3- Заказ £44 . Издатель и полиграфическое исполнение - Белорусский государственный медицинский университет. ЛВ № 410 от 08.11.99; ЛП № 51 от 17.11.02. 220050, г. Минск, Ленинградская, 6. | ||||||||||||||||||||||||