Бактериологическая диагностика туберкулёза. Контрольные вопросы по теме занятия Возбудитель туберкулеза история открытия, основные свойства, таксономическое положение
 Скачать 176.5 Kb.
|
|
10 1 месяца. Как правило, для выделения микобактерий используется набор из двух разных питательных сред. Автоматические системы. Разработка радиометрической системы ВАСТЕС 460 (Becton Dickinson) ознаменовала собой качественный прорыв в быстрой детекции микобактерий и определении их лекарственной чувствительности. Принцип ее функционирования заключается в следующем: бактериальные клетки выращивают в жидкой питательной среде, содержащей источник углерода (пальмитиновую кислоту), меченный по ИС. Интенсивность роста бактерий в системе ВАСТЕС определяют путем измерения продукции меченого С02 в процессе жизнедеятельности бактериальных клеток. Следующим шагом было совершенствование методов выявления МБТ, что позволило быстро проводить детекцию роста МБТ без использования радиоактивных материалов. Среди этих методов есть полностью неавтоматизированные, как, например, MGIT(Mycobacteria Growth Indicator Tube, Becton Dickinson). С его помощью рост микобактерий оценивается по флюоресценции, возникающей при окислении в процессе роста микобактерий присутствующего в среде 02-чувстви-тельного флюоресцентного индикатора. В настоящее время разработаны также полностью автоматические системы — ESPCultureSystem(Difco), в которой используется технология измерения давления на крышку пробирки, возникающего в результате продукции и поглощения газа в процессе роста микобактерий. Интенсивность роста МБТ оценивается по времени детекции давления в сравнении с положительным контролем. Кроме того, разработаны автоматические нерадиометрические системы ВАСТЕС 9000 (Becton Dickinson) и МВ/ВасТ System (Organon technica), рост микобактерий в которых оценивается с использованием колориметрического сенсора, реагирующего на продукцию С02, растворенного в культуральной среде, растущими в среде микроорганизмами (табл. 4) Таблица 4 Системы детекция микобактерий в жидкой питательной среде
Автоматические системы, предназначенные для выявления микобактерий туберкулеза, позволяют проводить детекцию роста микобактерий в 2-3.раза быстрее, чем классические методы. Положительный результат анализа должен обязательно подтверждаться бактериоскопически. В практике бактериологических лабораторий исследование с использованием автоматических систем обязательно проводится параллельно с исследованием на плотных питательных средах. и Идентификация микобактерий. Несмотря на то, что морфология колоний, наличие пигмента и ростовые характеристики дают некоторое представление о выделенном штамме микобактерий, для установления их видовой принадлежности микобактерий используют комплекс специальных лабораторных тестов. В 1970-х гг. Международной рабочей группой по таксономии микобактерий была стандартизована серия высоко воспроизводимых биохимических тестов, которые не требуют сложного технического обеспечения и могут быть проведены за несколько часов или дней. Это способность штамма микобактерий синтезировать никотиновую кислоту, восстанавливать нитраты, продуцировать уреазу, проявлять различную резистентность к антибиотикам, а также каталазная активность и термостабильность каталазы штамма МБТ. Кроме этого, для идентификации микобактерий используется набор бактериологических тестов: скорость роста на питательных средах, способность микобактерий образовывать корд-фактор, пигмент, расти на яичной или простой агаровой среде при разных температурных режимах; на средах, содержащих NaCl, пара-нитробензойную кислоту или салициловокислый натрий. Методы определения лекарственной чувствительности микобактерий. В лабораторной практике используют три основных метода определения лекарственной чувствительности микобактерий: метод абсолютных концентраций; метод соотношения резистентности; метод пропорций. Метод абсолютных (предельных) концентраций заключается в следующем. Микобактерий выращивают на питательных средах, содержащих противотуберкулезные препараты (ПТП) в различных концентрациях. Определение лекарственной чувствительности МБТ может быть прямым (посев на среды с противотуберкулезными препаратами патологического материала) и непрямым (посев на среды с противотуберкулезными препаратами выделенных культур микобактерий). Прямой способ позволяет значительно ускорить процесс получения результата, но им можно пользоваться только тогда, когда микобактерий обнаруживаются в исследуемом материале бактериоскопически и содержатся в нем в значительном количестве. Лекарственную чувствительность можно определять на плотных и жидких питательных средах. В современной лабораторной практике ее обычно определяют на среде Левенштейна-Йенсена, не содержащей крахмала, которая принята ВОЗ в качестве международного стандарта. Унификация определения лекарственной чувствительности МБТ позволяет получать сравнимые результаты при проведении эпидемиологических исследований. При определении лекарственной чувствительности на плотных питательных средах результат учитывают через 3 недели после посева по макроросту МБТ на поверхности среды, на жидких питательных средах — через 10-12 дней по наличию микроколоний в виде переплетающихся жгутов и кос в мазках из осадка. Определение лекарственной чувствительности на плотных и жидких питательных средах имеет свои преимущества и недостатки. На плотных средах можно получить более четко сравнимые результаты. При массовых исследованиях этот метод менее трудоемок, однако он более продолжителен по времени получения результата. В плотных средах во время свертывания может несколь- 12 ко уменьшаться содержание некоторых термолабильных препаратов, например, стрептомицина. Определение лекарственной чувствительности на жидких средах более трудоемко, требует микроскопии препаратов, но результат может быть получен в более короткие сроки. Недостатком этого способа является то, что больные, леченные антибактериальными препаратами, могут выделять микобактерий, лишенные корд-фактора, не дающие при размножении жгутов или паукообразных микроколоний, наличие которых служит критерием устойчивости к препарату. Метод соотношения резистентности (resistanceratiomethod) заключается в определении соотношения минимальных ингибирующих концентраций противотуберкулезных препаратов для тестируемого штамма и референс-штамма H37R.V, чувствительного ко всем препаратам. Величина соотношения 2 и менее характеризует штамм как чувствительный, 8 и более — как устойчивый. Вариантом метода минимальных ингибирующих концентраций является E-test. Лекарственная устойчивость микобактерий с использованием этого метода определяется на чашках с агаровой средой, на которые помещают полоски, содержащие градиент концентраций противотуберкулезных препаратов. Чувствительность микобактерий к препаратам оценивается по наличию зоны ингиби-рования роста микобактерий вокруг полоски. Использование E-testпозволяет определять лекарственную чувствительность МБТ в течение 5-10 дней. Метод пропорций был предложен Canetti в 1963 году. Он заключается в определении соотношения числа колоний, выросших на среде, содержащей противотуберкулезный препарат, и числа колоний в контрольной пробирке, не содержащей препарата. Это соотношение является отражением пропорции резистентных бактерий в популяции. Метод позволяет количественно оценить степень резистентности штамма МБТ, однако широкое применение его в классическом варианте затруднено вследствие большой трудоемкости. Определение лекарственной чувствительности микобактерий методом пропорций может проводиться с использованием автоматических систем ВАСТЕС, MGIT, EspCultureSystemи др. Целью интерпретации результатов определения лекарственной чувствительности МБТ к ПТП являются прогнозирование клинической эффективности ПТП у конкретного больного и обоснование рекомендаций по проведению оптимальной химиотерапии. В качестве критериев для отнесения штаммов МБТ к категории чувствительных или устойчивых используют пороговые значения минимальных ингибирующих концентраций (МИК) ПТП, избранные на основе комплекса микробиологических, фармакокинетических и клинических показателей. Данные о величине МИК ПТП в отношении штаммов МБТ, выделенных от больных, служат микробиологическим критерием для определения величины пороговых концентраций. Кроме того, при определении пороговых МИК учитывают данные по фармакокинетикс ПТП. Основным показателем при этом является максимальная концентрация ПТП, которая создается в сыворотке крови после приема ПТП в среднетерапевтической дозе. Четкая зависимость между этим показателем и величинами пороговых МИК отсутствует. В самом общем виде 13 можно лишь сказать, что пороговые МИК не могут быть выше максимально достижимых в сыворотке крови. И, наконец, третьим критерием для определения пороговых значений МИК служат данные о клинической эффективности ПТП при заболевании, вызываемом микроорганизмами с различными МИК. Таким образом, предложенные в разных странах пороговые значения МИК ПТП являются плодом консенсуса между ведущими экспертами, а не результатом точных расчетов. По мере накопления опыта их периодически пересматривают. Несмотря на определенную условность рекомендованных пороговых значений МИК ПТП, они являются единственной основой для первого этапа интерпретации результатов оценки чувствительности МБТ к ПТП. Биологические методы диагностики туберкулеза Биологическая проба (биопроба). Биопроба является еще одним методом выявления микобактерий. Для этого чувствительных к туберкулезу животных (чаще всего морских свинок) заражают патологическим материалом, взятым от больного, и в течение 3 месяцев наблюдают за их весом, поведением, местными изменениями. Если в течение этого срока животное не погибнет, его забивают. Морских свинок, забитых или погибших, обязательно вскрывают и оценивают туберкулезные изменения, произошедшие в их органах животных при развитии специфического процесса. Даже при отсутствии специфических изменений для подтверждения диагноза из лимфатических узлов, легких, печени, селезенки готовят мазки, которые окрашивают по Цилю-Нильсену. Кроме того, кусочки указанных органов гомогенизируют и высевают на питательные среды. В сомнительных случаях выполняют гистологическое исследование тканей. Чувствительность биологического метода выявления микобактерий высока (несколько клеток МБТ на пробу). Однако в последнее время появились сообщения о том, что результат биологического исследования не всегда коррелирует с данными клинико-рентгенологического обследования. Определение вирулентности штаммов микобактерий. Как и в общей микробиологии, при туберкулезе под вирулентностью понимают степень патогенное™, то есть способность штамма МБТ размножаться в организме хозяина и вызывать в нем специфические патоморфологические изменения. Вирулентность МБТ обусловливается биологическими особенностями возбудителя туберкулеза, с одной стороны, и степенью резистентности макроорганизма — с другой. Определенная степень вирулентности присуща конкретному штамму МБТ и является не видовым (как патогенность), а индивидуальным признаком. Наиболее чувствительными животными для определения вирулентности микобактерий туберкулеза являются морские свинки, обладающие слабой естественной защитой против туберкулезной инфекции. Для изучения вирулентности микобактерий суспензию штамма МБТ вводят подкожно двум морским свинкам в паховую область и ведут наблюдение за их весом, поведением, местными изменениями. Погибших морских свинок вскрывают. Для оценки степени вирулентности МБТ используют несколько критериев. Один из них — продолжительность жизни лабораторных животных, 14 использованных в эксперименте. К высоковирулентным относят культуры, выбывающие гибель морских свинок от генерализованного туберкулеза в период до 45 дней после заражения, к средневирулентным — при гибели через 1,5-3 месяца, к слабовирулентным — при гибели через 3-5 месяцев и более. Вирулентность культур МБТ можно оценивать также по степени пораженное™ внутренних органов, выраженной в баллах (по М.В. Триус). По этой схеме специфические изменения в органах и лимфатических узлах зараженных свинок оцениваются в зависимости от степени их выраженности плюсами, которые затем переводятся в цифровые показатели. Одним плюсом обозначается наличие единичных очагов в органе (селезенке, печени, легком), тремя плюсами — тотальное поражение, двумя — промежуточная степень поражения. При исследовании лимфатических узлов каждый плюс оцениватся в 1 балл, селезенки — в 2, печени — 3, легких — 4 балла. Таким образом, при максимальных специфических изменениях цифровое обозначение поражения выражается цифрой 30. Е.Ф. Чернушенко разработана схема макроскопической оценки поражения внутренних органов морских свинок, зараженных туберкулезом, согласно которой максимальное поражение организма оценивается в 100 баллов. Эта схема позволяет проводить статистическую обработку результатов. Вирулентность культур микобактерий можно оценивать также по индексу пораженности, предложенному Mitchison. Данный индекс рассчитывают как квадратный корень из отношения пораженности внутренних органов, выраженной в баллах, к числу прожитых животным дней. Такой способ оценки учитывает скорость развития специфических поражений во внутренних органах лабораторных животных. При величине индекса пораженности 1 и более штамм микобактерий относят к высоковирулентным. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА Полимеразная цепная реакция. Получение более совершенных питательных сред, разработка автоматических систем позволяют сокращать сроки выявления и идентификации микобактерий. Однако они все еще остаются достаточно длительными и зависят от количества возбудителя в инфекционном материале. Современные молекулярно-генетические методы открывают в этой области значительные перспективы, так как позволяют с высокой чувствительностью и специфичностью проводить выявление и типирование микобактерий в различном диагностическом материале. Наиболее часто на практике используется молекулярно-генетический метод, в основе которого лежит принцип полимеразной цепной реакции (ПЦР). ПЦР — принципиально очень простой метод амплификации, т. е. умножения нуклеиновых кислот. Он был открыт в середине 1980-х гг. Kary Mullis с соавторами (биотехнологическая компания «Cetus», США). За это открытие автор был удостоен Нобелевской премии. В последние годы ПЦР становится одним и) наиболее широко используемых в современной медицине и биологии методов. И частности, в настоящее время выпускаются диагностические наборы кии НЦ1\ которые используются для выявления ВИЧ, вируса гепатита С, ЦМВ, 15 микобактерий туберкулеза и т. д. в различных диагностических материалах. ПЦР имитирует естественный процесс репликации ДНК, при котором число ее молекул удваивается после каждого цикла. Одно из отличий заключается в том, что ПЦР используется для амплификации не всей хромосомы, а лишь небольшого участка ДНК, специфичного для данного вида (последовательность-мишень). Как известно, при репликации одна цепочка ДНК служит матрицей, на которой с помощью ДНК-полимеразы синтезируется комплементарная ей вторая цепочка. Удвоение ДНК с помощью полимеразы происходит от 5'- к З'-концу каждой цепочки. Названия «3'» и «5'-конец ДНК» обусловлены последовательностью соединения нуклеотидов в цепочке. Направленность цепей в двухцепочечной молекуле ДНК противоположна, т. е. 3'-конец одной цепочки всегда взаимодействует с 5'-концом второй цепочки. Противоположную направленность цепей часто выражают термином «антипараллельность». При продвижении ДНК-полимеразы по молекуле ДНК на одной цепочке сразу синтезируется сплошная комплементарная цепь, на другой происходит синтез небольших фрагментов ДНК, получивших название фрагментов Оказаки, которые затем сшиваются при помощи фермента лигазы. Для начала работы ДНК-полимеразы необходим участок двухцепочечной ДНК, с которого начинается репликация. Небольшой участок РНК, с которого начинается удвоение ДНК, получил название праймера, или затравки. Метод ПЦР основан на повторении трех этапов, проходящих при разных температурных режимах. На первом этапе двухцепочечную ДНК денатурируют путем кратковременного нагрева инкубационной системы до 90-95°С. Таким образом, две цепочки ДНК остаются в растворе в не связанном друг с другом состоянии до тех пор, пока температура не будет понижена. На следующем этапе, получившем название этапа отжига праймеров, который проходит при 40-60°С, с участками одноцепочечных молекул ДНК, фланкирующими последовательность-мишень, связываются праймеры. Это короткие участки РНК длиной около 20 нуклеотидов. Каждая из затравок связывается только с одной цепочкой ДНК. Следующий шаг ПЦР — умножение последовательности-мишени с помощью полимеразы. Поскольку инкубационная система на этапе денатурации нагревается до 90-95°С, в ПЦР используется термостабильная Taq-полимераза, выделенная из Thermitsaquaticus. Этап достройки затравок проходит при 70-75°С. На этом заканчивается первый цикл амплификации. Далее все этапы повторяются 20-25 раз. В результате количество ДНК-мишени возрастает в геометрической прогрессии. На практике из патологического материала, взятого от больных, при помощи специальных методов выделяют ДНК. К ней добавляют реакционный буфер, смесь нуклеозидтрифосфатов, праймеры, полимеразу и проводят амплификацию в программируемом термостате (термоциклере). Результат учитывают с помощью электрофореза в агарозном геле или с помощью иммобилизованных фрагментов ДНК. Присутствие в пробе последовательности-мишени свидетельствует о наличии МБТ в исследуемом образце. ПЦР позволяет выяв- |