лекарственное растительное сырье, содержащее дубильные вещества. курсовая сивикова. Курсовая работа по фармакогнозии лекарственное растительное сырье, содержащее дубильные вещества

• Название: Курсовая работа по фармакогнозии лекарственное растительное сырье, содержащее дубильные вещества
• Анкор: лекарственное растительное сырье, содержащее дубильные вещества
• Дата: 06.12.2020
• Размер: 1.14 Mb.
• Имя файла: курсовая сивикова.docx
• Тип: Курсовая; #157533
• страница: 2 из 3

Глава 2. Фитохимический анализ лекарственного растительного сырья, содержащего дубильные вещества

1. 
   Качественный анализ исследуемой группы БАВ
   

Все качественные реакции, которые осуществляются для идентификации дубильных веществ можно подразделить на 2 категории: реакции осаждения и хромогенные (цветные) реакции [7, 10, 18].

Реакции осаждения:

1) При взаимодействии дубильных веществ с 1% раствором желатина, приготовленном на 10% растворе натрия хлорида, образуется осадок или возникает помутнение раствора. При добавлении избытка желатина помутнение исчезает.

2) Танниды дают обильные осадки с алкалоидами (кофеин, пахикарпин, 1% раствор хинина хлорида - появляется аморфный осадок за счет образования водородных связей между гидроксильными группами дубильных веществ и атомами азота алкалоида), а также некоторыми азотистыми основаниями (уротропин, новокаин, дибазол).

3) При взаимодействии с 10% раствором уксуснокислого свинца – (CH₃COO)₂Pb дубильные вещества гидролизуемой группы образуют хлопьевидный осадок.

4) Дубильные вещества конденсированной группы образуют хлопьевидный осадок в реакции с бромной водой.

Цветные реакции:

1) Дубильные вещества гидролизуемой группы с раствором железоаммонийных квасцов образуют черно-синие окрашенные соединения, а конденсированной группы - черно-зеленые.

2) Если в растении одновременно содержатся дубильные вещества и гидролизуемой и конденсированной группы, то вначале гидролизуемые таниды осаждают 10% раствором ацетата свинца, осадок отфильтровывают, а затем проводят реакцию фильтрата с раствором железоаммонийных квасцов. Появление темно-зеленой окраски свидетельствует о наличии веществ конденсированной группы.

Групповые качественные реакции на дубильные вещества представлены в таблице 2 [10, 18, 21]: 

Таблица 2. Реактивы и эффекты реакций на дубильные вещества различных групп

№	Реактив	Гидролизуемые танниды (эффект)	Конденсированные танниды (эффект)
1	разбавленная кислота серная	Гидролиз	Красно-коричневые флобафены (красени)
2	бромная вода (5г брома в 1 л воды)	Отсутствует	Оранжевый или желтый осадок
3	1 % раствор квасцов железоаммонийных (железа окисного хлорид не используют, т.к. его раствор имеет кислую реакцию среды)	Черно-синее окрашивание или осадок	Черно-зеленое окрашивание или осадок
4	10 % раствор свинца среднего ацетата (одновременно добавляют 10 % раствор кислоты уксусной)	Белый осадок, нерастворимый в кислоте уксусной (осадок отфильтровывают и в фильтрате определяют содержание конденсированных таннидов, с 1 % раствором квасцов железоаммонийных - черно-зеленое окрашивание)	Белый осадок, растворимый в кислоте уксусной
5	проба Стиасни (40 % раствор формальдегида с концентрированной кислотой хлористоводородной)	Отсутствует	Осадок кирпично-красного цвета (осадок отфильтровывают и в фильтрате определяют содержание гидролизуемых таннидов, в нейтральной среде с 1 % раствором квасцов железоаммонийных - черно-синее окрашивание)
6	1 % раствор ванилина в концентрированной кислоте хлористоводородной	Отсутствует	Оранжево-красное окрашивание (катехины)

2. 
   Методики количественного определения дубильных веществ
   

Согласно ОФС.1.5.3.0008.18 «Определение содержания дубильных веществ в лекарственном растительном сырье и лекарственных растительных препаратах» определение содержания дубильных веществ проводят титриметрическим (перманганатометрическим) и/или спектрофотометрическим методами [8].

Титриметрический метод заключается в определении суммы дубильных веществ в пересчете на танин, а спектрофотометрический метод позволяет определять сумму дубильных веществ в пересчете на пирогаллол или (+)-катехин в зависимости от группы дубильных веществ (гидролизуемые или конденсируемые соответственно), если в фармакопейной статье не указан другой стандартный образец [4, 8, 27].

Арбитражным методом определения содержания дубильных веществ в лекарственном растительном сырье и лекарственных растительных препаратах является спектрофотометрический метод.

Метод 1. Определение суммы дубильных веществ в пересчете на танин:

Около 2 г (точная навеска) измельченного лекарственного растительного сырья или лекарственного растительного препарата, просеянного сквозь сито с отверстиями размером 3 мм, помещают в коническую колбу вместимостью 500 мл, заливают 250 мл нагретой до кипения воды и кипятят с обратным холодильником на электрической плитке с закрытой спиралью в течение 30 мин при периодическом перемешивании. Полученное извлечение охлаждают до комнатной температуры и фильтруют через вату в мерную колбу вместимостью 250 мл так, чтобы частицы сырья/препарата не попали в колбу, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. 25,0 мл полученного водного извлечения помещают в коническую колбу вместимостью 1000 мл, прибавляют 500 мл воды, 25 мл раствора индигосульфокислоты и титруют при постоянном перемешивании 0,02 М раствором калия перманганата до золотисто-желтого окрашивания.

Параллельно проводят контрольный опыт: в коническую колбу вместимостью 1000 мл помещают 525 мл воды, 25 мл раствора индигосульфокислоты и титруют при постоянном перемешивании 0,02 М раствором калия перманганата до золотисто-желтого окрашивания.

1 мл 0,02 М раствора калия перманганата соответствует 0,004157 г дубильных веществ в пересчете на танин.

Содержание суммы дубильных веществ в пересчете на танин в абсолютно сухом сырье в процентах (Х) вычисляют по формуле, указанной на рисунке:



Рисунок 16. Расчет количественного содержания дубильных веществ, Х% (в пересчете на танин) перманганатометрическим методом.

Метод 2. Определение суммы дубильных веществ спектрофотометрическим методом – арбитражный метод [4, 8, 21]:

Около 2,0 г (точная навеска), если иное не указано в частной фармакопейной статье, измельченного лекарственного растительного сырья или лекарственного растительного препарата, просеянного сквозь сито с отверстиями размером 1 мм, помещают в коническую колбу вместимостью 500 мл, заливают 250 мл воды и кипятят с обратным холодильником на электрической плитке с закрытой спиралью в течение 30 мин при периодическом перемешивании. Полученное извлечение охлаждают до комнатной температуры и фильтруют через вату в мерную колбу вместимостью 250 мл так, чтобы частицы сырья не попали в колбу, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. Полученный раствор фильтруют через бумажный фильтр диаметром около 125 мм, отбрасывая первые 50 мл фильтрата.

Раствор А. 1,0 мл фильтрата помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. Измеряют оптическую плотность раствора А (А₁) на спектрофотометре при длине волны 266 нм (для гидролизуемых дубильных веществ) или 278 нм (для конденсированных дубильных веществ), если иное не указано в фармакопейной статье, в кювете с толщиной слоя 10 мм относительно раствора сравнения. В качестве раствора сравнения используют воду.

Раствор Б. К 5,0 мл фильтрата прибавляют 0,05 г кожного порошка, перемешивают полученную смесь в течение 30 мин и фильтруют через бумажный фильтр диаметром около 125 мм. 1,0 мл полученного фильтрата помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. Измеряют оптическую плотность раствора Б (А₂) на спектрофотометре при длине волны 266 нм (для гидролизуемых дубильных веществ) или 278 нм (для конденсированных дубильных веществ), если иное не указано в фармакопейной статье, в кювете с толщиной слоя 10 мм относительно раствора сравнения. В качестве раствора сравнения используют воду.

Раствор СО. 0,1 г (точная навеска) СО пирогаллола (для гидролизуемых дубильных веществ) или (+)-катехина (для конденсированных дубильных веществ), если иное не указано в фармакопейной статье, помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в воде, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. 2,0 мл полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. Раствор используют свежеприготовленным. Измеряют оптическую плотность раствора СО (А₃) на спектрофотометре при длине волны 266 нм (для гидролизуемых дубильных веществ) или 278 нм (для конденсированных дубильных веществ), если иное не указано в фармакопейной статье, в кювете с толщиной слоя 10 мм относительно раствора сравнения. В качестве раствора сравнения используют воду.

Содержание суммы дубильных веществ в пересчете на пирогаллол или (+)-катехин в абсолютно сухом лекарственном растительном сырье или лекарственном растительном препарате в процентах (Х) вычисляют по формуле, указанной на рисунке 17, где:

A₁ – оптическая плотность раствора А;

A₂ – оптическая плотность раствора Б;

A₃ – оптическая плотность СО пирогаллола или (+) – катехина;

a – навеска лекарственного сырья или лекарственного растительного препарата, г;

a_o – навеска СО пирогаллола или (+) – катехина, г;

P – содержание основного вещества в СО пирогаллола или (+) – катехина,%

W – влажность лекарственного растительного сырья или лекарственного растительного препарата, %.



Рисунок 17. Формула расчета количественного содержания дубильных веществ спектрофотометрическим методом

Согласно литературным данным, развивающимся и перспективным методом анализа дубильных веществ является кулонометрия. Сущность данного способа описана на примере количественного определения исследуемой группы БАВ дубровника белого (Teucrium polium) [1, 22].

Описание: В электролитическую ячейку на 50,0 мл вводят 20-25 мл фонового электролита, помещают рабочий (платиновый), вспомогательный (платиновый) и индикаторные электроды (платиновые игольчатые электроды). Включают генераторную и индикаторную цепи.

При достижении индикаторным током определенного значения в ячейку вводят аликвоту исследуемого образца (0,4-0,5 мл) и одновременно включают секундомер. Величина разности потенциалов, накладываемая на индикаторные электроды, составляет 300 мВ. Конечную точку титрования фиксируют по достижению индикаторным током первоначального значения. Выключают секундомер и отключают индикаторную цепь. Определение проводят при комнатной температуре.

Электрогенерацию йода проводили из 0,1 М раствора йодида калия в фосфатном буферном растворе (рН = 9,8) на платиновом электроде при постоянной силе тока 5,0 мА.

Содержание дубильных веществ в лекарственном растительном сырье в пересчете на танин (X, %) рассчитывают по формуле, отраженной на рисунке:



Рисунок 18. Формула расчета кулонометрического определения содержания дубильных веществ в растительных объектах

Условные обозначения:

I - сила тока, A;

t - время достижения конечной точки титрования, с;

41,57 - условная величина молярной массы эквивалента танина, г/моль; а - навеска сырья, г;

Va - объем аликвоты, вводимый в кулонометрическую ячейку, мл;

250 - объем водного извлечения из лекарственного растительного сырья, мл;

W - потеря в массе при высушивании, %;

F - постоянная Фарадея 96485 Кл/моль.

Глава 3. Перспективные источники дубильных веществ из лекарственного растительного сырья

3.1. Исследование содержания дубильных веществ корней шиповника собачьего

Шиповник собачий - Rosa canina (L.): густой кустарник, с дугообразными ветвями, высотой 1,5-2 метра. Шипы редкие, у основания весьма широкие, серповидно-изогнутые. Листья непарноперистые, 6-9 см длины, с 5-7 листочками продолговато-яйцевидной формы. Длина листочков 1,5-5 см, край зубчатый, снизу они серо-зелёного цвета. Плоды ягодообразные, сочные, светло-красного цвета. Чашелистики перисто-рассечённые, после цветения отгибаются вниз и опадают вниз, оставляя после себя пятиугольную площадку. Установлены внешние признаки цельного сырья: корневища узловатые, ветвистые, длиной 20-25 см, толщиной 10-12 см, с гладкой, блестящей поверхностью, красновато-бурого цвета. Корни по форме цилиндрические, изогнутые и слабоветвистые, цвет - коричневато-серый с бурым оттенком, на изломе желтовато-белый. Длина корней достигает 30 см, толщина - 0,3 -1,0 см. Запах слабый, терпкий [11, 24].



Рисунок 19 Внешний вид шиповника собачьего - Rosa canina

Содержание дубильных веществ определяли в водном извлечении. Количественное определение органических кислот (фенолокислот) устанавливали титриметрическим методом, используя пермангонатометрическое титрование, определяли содержание дубильных и легко окисляемых веществ.

Для определения танина в исследуемом сырье использовали микроколоночный жидкостный хроматограф «Милихром А-02», снабжённый колонкой из нержавеющей стали размером 2х75 мм, заполненный адсорбентом Prontosil 120-5CAQ.

Анализ проводили методом изократического элюирования при комнатной температуре. В качестве подвижной фазы использовали систему растворителей кислота муравьиная 2% - ацетонитрил (60:40). При хроматографировании в предложенных условиях раствора РСО танина 0,1% фиксировались два симметричных пика со временем удерживания 1,85 и 2,45 мин, коэффициент разделения пиков составил 2,1.

Содержание дубильных и легко окисляемых веществ, определяемые фармакопейным методом, составило 10,77±0,03%. Относительная ошибка при доверительной вероятности не превышает ±0,28%. В связи с тем, что фармакопейный перманганатометрический метод позволяет определить в растительном сырье не только содержание дубильных веществ, а сумму всех легко окисляемых соединений, переходящих в водное извлечение, нами для стандартизации сырья был использован метод высокоэффективной жидкостной хроматографии, как более точный и информативный метод качественного и количественного анализа, которым определили содержание в ЛРС танина, что в количественном соотношении равно (1,46±0,026%). На рисунке 20 представлены метрологические характеристики метода ВЭЖХ для определения дубильных веществ (ДВ) в корнях шиповника собачьего (в пересчете на танин) (рис.20) [24].


Рисунок 20. Метрологические характеристики метода ВЗЖХ для определения ДВ


3.2. Исследование содержания дубильных веществ растений семейства Hydrocharitaceae
Материалом для исследования послужили образцы побегов растений семейства Hydrocharitaceae: Hydrocharis morsus - ranae L. (Водокрас лягушачий), Stratiotes aloides L. (Телорез алоевидный), Elodea canadensis Mich. (Элодея канадская), Egeria densa Planch. (Эгерия густая), Hydrilla verticillata Royle (Гидрилла мутовчатая) [19].

Для исследования компонентного состава отбор проб растений проводили в фазу цветения - начала плодоношения/вегетации после цветения (в июле-августе) из нескольких участков одного местонахождения. Отобранные рандомизированным путем, средние пробы высушивались до воздушно-сухого состояния и хранились при комнатных условиях до проведения испытаний.

Полученные, путем экстрагирования горячей водой, водные извлечения (1:10) были подвергнуты количественному анализу пермагантометрическим методом, результаты которого представлены на рисунке 21 [19].

Рисунок 21. Результаты определения содержания дубильных веществ в растительных объектах

Таким образом, результаты количественного анализа позволили обнаружить гидролизуемые дубильные вещества у Hydrocharis morsus-ranae, а у Stratiotes aloides, Elodea canadensis, Egeria densa, Hydrilla verticillata - смесь гидролизуемых и конденсированных дубильных веществ. Наибольшим содержанием дубильных веществ отличается Stratiotes aloides, содержаний 3.1±0.1%, и Hydrilla verticillata, содержащая - 2.8±0.1%, минимальным - Elodea canadensis 1.1±0.1%.  В качестве возможной фармакологической активности предложена – антиоксидантное действие.

Также, были проведены исследования качественных характеристик выделенных дубильных веществ из растений рода Hydrocharitaceae путем проведения серии качественных реакций с 1% раствором железоамммонийных квасцов и 0,5% раствором бромной воды.