Микробиология стандарт. стандарт. Лабораторная работа 1 дезинфекция и стерилизация цель работы Ознакомиться с методами дезинфекции и стерилизации
 Скачать 76.79 Kb.
|
|
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №6 Строение плесневых грибов и дрожжей Цель работы: Изучить морфологию плесневых грибов и дрожжей и научиться определять по ключу принадлежность грибов. Материалы и оборудование: предметное стекло, покровное стекло, микроскоп, р-р Люголя, судан III, этиловый спирт, иглы, питательные среды с выращенными микроорганизмами. Теоретическая часть Дрожжи являются одноклеточными неподвижными организмами. Клетки дрожжей могут иметь округлую, овальную, элипсоидальную или цилиндрическую форму. Длина клеток колеблется от 5–6 до 10–15 мкм, а ширина – от 2 до 5 мкм. Форма и размеры дрожжей изменяются в зависимости от условий. Дрожжи относятся к истинно ядерным организмам. Их клетка снаружи покрыта оболочкой, внутри которой находится цитоплазма с различными органоидами и ядро. В цитоплазме находятся запасные питательные вещества (гликоген, волютин, капли жира) и заполненные клеточной жидкостью вакуоли. Наиболее характерным способом размножения у дрожжей является почкование. Этому предшествует деление ядра. Затем на материнской клетке образуется небольшая выпуклость (иногда их может быть несколько) – почка, в которую переходит одно ядро с частью цитоплазмы и органоидами, после чего почка отшнуровывается от клетки. Иногда почки, еще не отделившись, в свою очередь начинают почковаться, образуют скопление дрожжевых клеток – сростки почкования. Истинным дрожжам свойственно размножение при помощи спорообразования. Споры у дрожжей обычно возникают бесполым путем. Образующиеся споры находятся в клетке как в сумке (аскоспоры). Количество спор в одной дрожжевой клетке колеблется от 1 до 12, но чаще всего бывает 4 споры. Некоторые дрожжи могут размножаться простым делением пополам. При этом посредине клетки образуется перегородка, в результате чего клетка делится на две обычно равные части. Дрожжи широко используются в пищевой промышленности (хлебопечении, молочной промышленности и др.). Плесневые грибы. Строение плесневых грибов более сложное, чем дрожжей. У них различают клетку гриба и его тело. Клетка гриба по своему строению похожа на растительные клетки, только лишена хлорофилла. Тело состоит из тонких (5–15 мкм) длинных нитей – гифов. Гифы ветвятся и переплетаются, образуя тело гриба, которое называется мицелием. Гифы растут своей вершиной или концами разветвлений. Снаружи гифы покрыты оболочкой. В состав оболочки некоторых грибов входит хитин. Внутри гифа находится цитоплазма с органоидами и одним или несколькими ядрами. Среди грибов распростронена многоядерность клеток. Среди грибов встречаются как одноклеточные, так и многоклеточные. У одноклеточных гифы не имеют поперечных перегородок и мицелий представляет собой одну клетку (несептированный мицелий). У многоклеточных грибов гифы разделены поперечными перегородками на отдельные клетки (септированный мицелий). Часть мицелия обычно развивается в субстрате, а часть – на поверхности, образуя воздушный мицелий. На воздушном мицелии образуются особые гифы, несущие споры. Отличительной особенностью грибов является разнообразие способов размножения. У большинства грибов любая часть мицелия может дать начало новому грибу. Но наиболее распространенным способом размножения грибов является спорообразование. При этом споры могут образовываться как бесполым, так и половым путем. При половом размножении спорообразованию предшествует половой процесс – слияние двух клеток. При бесполом процессе спорообразования споры чаще всего образуются на особых гифах, отличающихся строением и положением от других гифов мицелия, реже – прямо на мицелии. У одних грибов споры образуются на вершине гифов снаружи (экзоспоры). Такие споры называются конидиями. Они могут находиться или на особых гифах – конидиеносцах, или прямо на мицелии. Конидии могут располагаться как непосредственно на верхушке конидиеносцев, так и на особых клетках –стеригмах, покрывающих верхушку конидиеносцев. Конидии могут располагаться поодиночке, образовывать цепочки и т. д. У других грибов споры образуются внутри особой клетки на конце гифа (эндоспоры). Эти клетки называется спорангием. Гиф, на котором расположены спорангии, называется спорангиеносцем. От гифа спорангий отделен перегородкой. Внутри спорангия образуется большое количество спор. Они называются спорангиеспорами. Спорангиеспоры образуются путем расщепления многоядерной цитоплазмы молодого спорангия на отдельные части. У некоторых грибов в спорангиях образуются подвижные споры – зооспоры. При полом размножении спорообразованию предшествует половой процесс, при котором две клетки соединяются и образуют одну – зиготу. У низших грибов редукционное деление наступает сразу после слияния клеток, поэтому диплоидной является только зигота. У высших грибов ядра двух соединившихся клеток могут не сливаться длительное время. В результате этого возникают двуядерные клетки – дикарионы, которые могут многократно делиться. Затем происходит слияние ядер отцовского и материнского организмов. После этого наступает редукционное деление и образуются гаплоидные споры. Таким образом, у грибов, в отличие от высших организмов, клетки гаплоидные, а диплоидная фаза непродолжительна. Один и тот же гриб может размножаться и бесполым, и половым путем. Происходит чередование способов размножения, при этом половое обычно наступает при недостатке питания. Способы и органы размножения грибов характерны для каждого вида, по-этому именно они положены в основу классификации грибов. Для жизнедеятельности грибов нужны готовые органические вещества и кислород, так как они являются аэробными организмами. Отличительной особенностью грибов является то, что они способны развиваться при очень низкой влажности (до 11–13%). Ход работы: 1. Изучить морфологию дрожжей. 1.1. Приготовить препарат дрожжей типа «раздавленная капля». Для этого на предметное стекло нанести каплю суспензии дрожжей и осторожно накрыть покровным стеклом. Препарат типа «раздавленная капля» быстро высыхает, поэтому его микроскопирование следует проводить сразу же после приготовления. 1.2. Промикроскопировать препарат дрожжей сначала на увеличении 8х или 10х, а затем на увеличении 20х или 40х. Рассмотреть и зарисовать форму клеток дрожжей и их строение, выявив оболочку, цитоплазму, вакуоли и включения запасных питательных веществ. Цитоплазма под микроскопом видна как более темная зернистая масса, гликоген выявляется при виде плотных темных зерен, вакуоли – при виде светлых прозрачных пятнышек, капли жира – при виде светлых и блестящих пятнышек, так как они сильно преломляют свет. Убедиться в том, что дрожжи не могут активно двигаться, поскольку не обладают специальными органами передвижения – жгутиками. Для них характерно только пассивное броуновское движение с током жидкости, которым обладают все взвешенные частицы. В отличие от него активное движение имеет различные характер и направление. 1.3. Установить химическую природу внутриклеточных включений. Для этого применяют микрохимические реакции. Для определения гликогена к капле дрожжей добавляют каплю раствора Люголя. Препарат закрывают покровным стеклом и микроскопируют с увеличением 20х или 40х. Наблюдают зерна гликогена, который окрасился в красно-бурый цвет. Надо учитывать, что в молодых и старых клетках дрожжей содержание гликогена обычно очень мало. Для определения жира к капле дрожжей добавляют каплю 0,5%-ного спиртового раствора краски судан-III. Препарат закрывают покровным стеклом и микроскопируют с увеличением 20х или 40х. Наблюдают капли жира, который окрасился в красно-желтый цвет. 1.4. Найти и зарисовать почкующуюся клетку. 2. Изучить морфологию плесневых грибов и по ключу определить их вид. 2.1. Приготовить препарат плесневых грибов типа «раздавленная капля». Для этого на чистое, обезжиренное предметное стекло наносят каплю этилового спирта или смеси равных объемов этилового спирта и глицерина. Двумя препаровальными иглами берут небольшой кусочек воздушного мицелия плесневого гриба так, чтобы на нем обязательно были органы размножения (конидии или спорангии), и помещают в приготовленную каплю. Иглой осторожно расправляют гифы, стараясь не повредить мицелий и особенно органы размножения. После этого накрывают препарат покровным стеклом. Старые культуры для исследования брать не рекомендуется, так как при приготовлении из них препарата органы размножения легко разрушаются. 2.2. Промикроскопировать препарат плесневых грибов. Сначала его рассматривают при увеличении объектива 8х или 10х, затем при увеличении 20х. Найти органы размножения грибов и определить, что это: конидии или спорангии. Затем найти гифы, на которых они находятся, определить их вид и расположение на мицелии и относительно друг друга. 2.3. По ключу определить видовое название гриба. Найти на препарате один из признаков, соответствующий первому пункту ключа, и в соответствии с ним переходить к следующему, на который указывает цифра, стоящая в конце предложения. Например, если при микроскопировании установлено, что грибы размножаются спорангиоспорами, находящимися внутри спорангиев, то переходят к пункту 2. На это указывает цифра 2. Если же грибы размножаются конидиями, образующимися снаружи на особых конидиеносцах, реже прямо на мицелии, то переходят к пункту 5. Микроскопирование препарата в соответствии с пунктами ключа продолжают до тех пор, пока не придут к родовому названию гриба. 2.4. Записать в тетради все пункты ключа, которые проходили при определении названия. 2.5. Зарисовать в тетрадь все признаки, увиденные под микроскопом, по которым определено видовое название гриба, и дать к ним пояснения. Приложение 2. Ключ к определению родового названия грибов 1. Грибы размножаются спорангиоспорами, находящимися внутри спорангиев – 2. Грибы размножаются конидиями, образующимися снаружи на особых конидиеносцах, реже прямо на мицелии – 5. 2. Спорангиеносцы, несущие спорангии, обычно простые, реже – просто ветвящиеся. Спорангии все одинаковые – 3. Спорангиеносцы ветвящиеся. Спорангии двух видов: крупные – на главной оси и мелкие (спорангиоли) – на боковых ветвях – 4. 3. Спорангиеносцы одиночные, простые, иногда ветвящиеся. Спорангии мелкие или крупные, всегда однородные, бесцветные или окрашенные. Споры округлые или эллипсоидальные, гладкие бесцветные или сероватые. – Мукор. Спорангиеносцы расположены кустиками, вырастающими на стлонах из одного центра, с большими черными головками. Споры округлые, яйцевидные, морщинистые. – Ризопус. 4. Кустовидные ветви расположены мутовчато на главной оси спорангиеносца в один или несколько ярусов. Места ответвления нераздуты. Споры цилиндрические и эллипсоидальные, бесцветные. – Тамнидиум. Кустовидные ветви отходят от вздутий на главной оси спорангиеносца. Ветви второго порядка также отходят от вздутых мест. Спорангиоли сидят на вздутиях мелких конечных ветвей. Споры эллипсоидальные или шаровидные, бесцветные. – Хетостилум. 5. Конидии образуются на особых конидиеносцах, отличных от обыкновенных вегетативных гифов – 6. Конидиеносцы или мало отличаются от обыкновенных гифов, или их нет вовсе, и конидии образуются прямо на мицелии – 14. 6. Конидиеносцы обильно ветвятся различным образом – 7. Конидиеносцы не ветвятся или иногда ветвятся, но слабо. Ветвление простое, вильчатое или кустообразное – 9. 7. Ветвление древовидное – 8. Ветвление кистевидное или многократновильчатое, конидии располагаются цепочками, гладкие, бесцветные или окрашенные, округлые. – Пенициллиум. 8. Конидиеносцы древовидно-разветвленные, большие. Ветви располагаются беспорядочно, конидии на концах ветвей развиваются кустиками, бесцветные, яйцевидные, гладкие. – Ботритис. Конидиеносцы древовидно-разветвленные. Ветви располагаются мутовчато. Конидии образуются пачками или поодиночке, вытянуто-яйцевидные или эллипсоидальные, бесцветные или слабоокрашенные. – Вертициллиум. 9. Конидиеносцы неветвящиеся, длинные, с кустиками больших грушевидных конидий на конце. Конидии двуклеточные, бесцветные или розоватые. Колонии гриба желтоваторозовые. – Трихотециум. Конидиеносцы и конидии иной формы – 10. 10. Конидиеносцы ветвятся. Ветвление простое, реже – вильчатое – 11. Простые (как исключение, просто ветвящиеся) конидиеносцы имеют на конце булавовидное или пузыревидное вздутие. Иногда такое вздутие отсутствует – 12. 11. Конидии крупные, неправильной формы, усеяны бородавочками, расположены цепочками, окрашены в коричневый цвет. Колонии вначале пушистые, потом слизистые, с сильным неприятным запахом мышьяковистого водорода. – Акаулиум. Конидии бесцветные, длинные, серпообразные, многоклеточные (с поперечными перегородками), иногда расположены цепочкой одна за другой или появляются прямо на мицелии. Дерновинки гриба окрашены в розовый цвет (особенно нижняя сторона). – Фузариум. 12. Концы конидиеносцев булавовидно или пузыревидно раздуты и покрыты стеригмами, несущими цепочки конидий – 13. Расширение на конце часто отсутствует, стеригмы располагаются только на вершине конидиеносцев, но не растут по сторонам. Конидии мелкие, округлые, гладкие, бесцветные, на стеригмах располагаются цепочками. – Цитромицес. 13. Стеригмы, покрывающие булавовидные вздутия, простые, неветвящиеся, несут цепочки конидий. Конидии округлые, гладкие или шиповатые, окрашенные или бесцветные. – Аспергиллус. Стеригмы ветвящиеся, образуют на пузыревидном вздутии конидиеносца два яруса. Верхний несет цепочки конидий. Конидии округлые, гладкие, окрашенные. – Стеригматостис. 14. Конидии образуются прямо на мицелии – 16. Конидии образуются на конидиеносцах, мало отличающихся от обыкновенных вегетативных гифов – 15. 15. Конидиеносцы видны лишь при культуре «висячая капля». Конидии легко рассыпаются – 17. Места образования конидий видны в обычном микроскопическом препарате – 18. 16. Одноклеточные конидии, бесцветные, веретеновидные или округло-удлиненные. Конидии слизистые, черные. – Дематиум. Конидии одноклеточные, яйцевидные, дрожжеобразные. Молодые колонии похожи на дрожжевые, потом становятся лохматыми. – Монилия. 17. Конидии получаются простым делением мицелия и легко отпадают, бесцветные, прямоугольные, иногда соединены в короткие цепочки. – Оидиум. Конидиеносцы длинные, многоклеточные. Конидии неправильной формы (длинные, округлые или лимонообразные), окрашены в светлый оливково-зеленый цвет. – Кладоспориум. 18. На медленно растущих колониях нет настоящих конидиеносцев. Мелкие, блестящие, желто-коричневые конидии образуются очень длинными цепочками на концах обыкновенных гифов. – Катенулария. Крупные, многоклеточные, округло-грушевидной или заостренно-вытянутой формы конидии образуются в одиночку или короткими цепочками на коротких боковых ветвях вегетативных гифов, играющих роль конидиеносцев. – Альтернария. ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №7 МИКРООРГАНИЗМЫ ВРЕД или ПОЛЬЗА?! Цель работы: Изучить способы определения бактерий; Познакомиться с полезными и вредными свойствами бактерий; Обосновать необходимость гигиенических процедур. Материалы и оборудование: чашки Петри 4 шт, питательная среда Чапека, шпатели, игла, молоко, монета, парафильм или пищевая пленка, марлевые повязки, перчатки Ход работы: Приготовить питательную среду и разлить ее по чашкам Петри, В чашку Петри №1 капнуть каплю молока В чашке Петри №2 оставить отпечаток не мытых рук В чашке Петри №3 оставить отпечаток помытых рук В чашке Петри №4 слегка дотронуться монеткой до питательной среды Наблюдать за ростом микроорганизмов Сделать выводы. ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 8 Влияние факторов внешней среды на развитие микроорганизмов Цель работы: Изучить влияние факторов внешней среды (рН среды, температуры и концентрации) на развитие микроорганизмов. Задачи: Занятие 1 1. Сделать посев бактерий на питательных средах с различным значением рН. 2. Сделать посев бактерий на питательных средах с различной концентрацией хлорида натрия. 3. Воздействовать на спорообразующие и неспорообразующие бактерии высокой температурой и сделать их посевы. 4. Сделать посевы плесневых грибов на питательных средах и вырастить их при различных температурах. 5. Сделать посев плесневых грибов или дрожжей на питательных средах с различной концентрацией глюкозы. Занятие 2 6. Провести оценку интенсивности роста бактерий на питательных средах с различным значением рН. 7. Провести оценку интенсивности роста бактерий на питательных средах с различной концентрацией хлорида натрия. 8. Провести оценку интенсивности роста бактерий после воздействия на них высокой температуры. 9. Из выросших культур приготовить мазки и окрасить их по Граму. 10. Промикроскопировать препарат и установить форму бактерий. 11. Провести оценку интенсивности роста и спорообразования плесневого гриба при различных температурах выращивания. 12. Провести оценку интенсивности роста плесневого гриба или дрожжей на питательных средах с различной концентрацией глюкозы. 13. Определить по ключу родовое название изучаемого плесневого гриба. Материалы и оборудование: Стерильные пробирки, термостат, микроскоп, водяная баня, пипетки Пастера, штатив, сухое горючее, 60%р-р глюкозы, 5%,10%, 20%р-ры хлорида натрия, рН метр, чашки Петри, питательная среда. Теоретическая часть В естественных условиях микроорганизмы подвергаются воздействию разных по своей природе факторов, которые могут как стимулировать, так и тормозить их развитие (замедлять метаболические процессы) и даже приводить их к гибели. Температура является одним из наиболее мощных факторов, воздействующих на микроорганизмы. И хотя в целом развитие микроорганизмов происходит в очень широком диапазоне температур, для каждого конкретного вида существуют определенные температурные границы, в которых происходит их жизнедеятельность. Эта температурная зависимость характеризуется тремя точками: – минимальной температурой развития (t minimum). Это такая температура, при незначительном снижении которой скорость роста стремится к нулю (V роста → 0); – оптимальной температурой развития (t optimum). Это такая температура, при которой скорость роста является максимальной (V роста = mах); – максимальной температурой развития (t maхimum). Это такая температура, при незначительном увеличении которой скорость роста стремится к нулю (V роста → 0). В зависимости от отношения к той или иной температуре все микроорганизмы делятся на три основные группы: психрофилы, мезофилы и термофилы. Психрофилы (греческое «психрос» – холод, «филео» – люблю) развиваются при низких температурах. Минимальной температурой развития у них является температура замерзания среды (около – 2 °С), оптимальная – 15…20 °С, а максимальная – 30…35 °С. К ним относятся обитатели холодных источников северных морей и океанов. Их часто обнаруживают на поверхности рыб. Многие из них, относящиеся к родам Рseudomonas, Аchromobacter, способны быстро вызывать микробиальную порчу рыбы, хранящейся при температуре 0 °С. К психрофилам относится большинство светящихся бактерий рода Photobacterium. Их развитие в морской воде вызывает ее свечение. Мезофилы («мезос» – средний) – наиболее распространенная группа микроорганизмов, развивающихся в температурных пределах от 5–10 до 40–50 °С. Температурный оптимум для них составляет 25–30 °С. К этой группе относятся многие гнилостные бактерии, вызывающие порчу пищевых продуктов при положительных температурах, а также все патогенные и токсичные формы бактерий. Вместе с тем большинство промышленных процессов (получение органических кислот, ферментов и т. д.) осуществляется с помощью мезофилов. Термофилы («термос» – теплый) развиваются в температурных пределах от 30–35 до + 80 и даже до + 90 °С с оптимумом 50–60 °С. Они присутствуют в почве, навозе, иле. Среди них есть как споровые, так и неспоровые бактерии. Наибольшее количество термофилов наблюдается в местах, постоянно испытывающих действие высоких температур (например, в горячих источниках). Термофилия широко распространена среди анаэробов. В большинстве это споровые формы (например, представители рода Clostridium), причем споры у них отличаются особой термоустойчивостью. Поэтому они могут переносить стерилизацию и вызывать плоско-кислую порчу консервов. Отрицательное воздействие на микроорганизмы оказывают как низкие, так и высокие температуры, но механизм их действия различен. Низкие температуры оказывают в основном бактериостатическое действие вследствие замедления протекания биохимических процессов (замедления метаболизма). Гибель микроорганизмов (бактерицидное действие) наблюдается в случае чисто механического разрыва клеток образующимися в них кристаллами льда. Чем меньше образующиеся кристаллы льда и чем равномернее они распределены в клетке, тем меньше гибель микроорганизмов. И наоборот, чем крупнее кристаллы, тем больше клеток погибнет. Поэтому наиболее губительны для микроорганизмов температуры, которые соответствуют криоскопической точке цитоплазмы (от – 2 до – 5,6 °С). Чем дальше температура отстоит от криоскопического значения, тем меньше гибель микроорганизмов. Наиболее губительны для микроорганизмов высокие температуры. Повышение температуры приводит к ускорению биохимических реакций, но скорость реакций в клетке изменяется непропорционально, что приводит к дисбалансу и нарушению протекания метаболических процессов. Высокие температуры (70–80 °С и выше) оказывают бактерицидное действие. Под их воздействием происходит денатурация белка, приводящая к нарушению проницаемости клеточных стенок, потере активности ферментов, изменению структуры цитоплазмы и, как следствие всего этого, гибели клетки. Разные группы микроорганизмов проявляют разную чувствительность к действию высоких и низких температур. Наиболее чувствительны к действию низких температур термофилы и мезофилы, а к действию высоких – психрофилы и мезофилы. Наибольшей устойчивостью к действию высоких температур обладают споры. Воздействие высоких температур широко используется для подавления развития микроорганизмов. Реакция среды рН определяется концентрацией ионов водорода. Хотя в целом микроорганизмы развиваются в очень широком диапазоне рН, каждой физиологической группе и даже отдельным видам соответствуют определенные значения рН (оптимальная зона рН), в пределах которых происходит их развитие. Плесневые грибы, дрожжи и бактерии рода Acetobacter лучше всего развиваются в кислой среде при рН = 3–5. Такие микроорганизмы называются ацидофильными. Для большинства бактерий наиболее благоприятна нейтральная или слабощелочная среда с оптимумом рН 7,0–7,3. Изменение рН в кислую сторону губительно отражается на гнилостных бактериях. Наоборот, уксуснокислые бактерии к кислой среде устойчивы. Особенно чувствительны к изменению реакции среды азотфиксирующие бактерии, в частности азотобактер. Он лучше всего развивается при рН 7,4–7,6, поэтому в кислых почвах его практически нет. Клубеньковые бактерии тоже лучше развиваются при слабощелочной реакции среды, хотя зона рН, при которой они могут развиваться, значительно шире, чем у азотобактера. Влияние рН на развитие микроорганизмов основано на том, что реакция среды влияет на активность ферментов, так как каждый фермент проявляет свою активность только при определенных значениях рН. От концентрации ионов водорода зависит также поступление питательных веществ внутрь клетки и физическое состояние белков. Так, денатурация и выпадение большинства белков в осадок под действием высоких температур наиболее быстро и полно происходит в слабокислой среде. Увеличение кислотности среды наряду с температурой широко используется для подавления развития микроорганизмов при консервировании пищевых продуктов. Ход работы: Занятие 1 Провести посев бактерий на питательные среды с различным значением рН. Посев проводят в четыре пробирки на МПА (агар) с различным значением рН: в одной из них рН равно 3, во второй – 5, в третьей – 7 и в четвертой – 9. Перед началом посева каждую пробирку подписывают: указывают значение рН и ставят свой номер. Для посева используют бактерии или из чистой бульонной культуры, или из плотной питательной среды. Посев производят бактериальной петлей или бактериальной иглой с соблюдением правил асептики. При посеве на плотную среду пользуются иглой, а на жидкую – петлей. Петлю или иглу стерилизуют перед каждым посевом в пламени сухого горючего (фламбирование). После посева пробирки с засеянными средами помещают в штатив и ставят в термостат. Термостатирование проводят в течение 24–48 ч при температуре 37 °С. После этого выращенные культуры микроорганизмов переставляют в холодильник и хранят там до следующего занятия. Провести посев бактерий на питательные среды с различной концентрацией хлорида натрия. Посев проводят в четыре пробирки напитательную среду с различной концентрацией хлорида натрия: 5, 10, 20% и без него (контрольный посев). Все пробирки предварительно подписывают и нумеруют. Посевы проводят бактериальной петлей, которую каждый раз стерилизуют в пламени спиртовки. Пробирки с засеянными средами помещают в штатив и ставят в термостат. Посевы термостатируют в течение 24 ч при температуре 37 °С. После этого выращенные культуры переставляют в холодильник и хранят там до следующего занятия. Провести посев бактерий на косой агар после воздействия на них высокой температуры. Сначала готовят взвеси из культур бактерий, образующих и не образующих споры. Для этого берут две пробирки со стерильным изотоническим раствором. В одну вносят культуру сенной палочки (образует споры), а во вторую – молочнокислого стрептококка (не образует споры). Обе пробирки помещают в кипящую водяную баню на 10 мин. После кипячения пробирки охлаждают и из каждой делают посев при помощи петли на косой агар. Перед каждым посевом петлю стерилизуют. Пробирки с посевами подписывают, указав культуру, которая в них посеяна, и свой номер, помещают в штатив и ставят в термостат. Посевы термостатируют 24 ч при температуре 37 °С. После этого выращенные культуры переставляют в холодильник и хранят там до следующего занятия. Провести выращивание плесневых грибов при различных температурах. Посеять споры плесневого гриба в три чашки Петри на сусло-агар (СА) или среду Сабуро с агаром. Предварительно готовят водяную суспензию спор. Для этого берут культуру плесневого гриба со зрелыми органами размножения (конидиями или спорангиями) и проводят по ним бактериальной петлей, предварительно смоченной в воде (чтобы споры лучше к ней прилипали). Затем вносят петлю в стаканчик или пробирку с водой (перенося туда споры) и тщательно перемешивают. Переносить споры в пробирку можно несколько раз. После этого стерильной бактериальной петлей берут каплю водяной суспензии спор плесневого гриба и осторожно наносят ее на СА, прикасаясь ребром петли в центр каждой чашки. При повторных посевах петлю можно не стерилизовать. Все чашки необходимо подписать, указав на каждой из них температуру выращивания, и поставить свой номер. Все надписи делаются только на дне чашек. Засеянные чашки переворачивают вверх дном и ставят посевы на выращивание. Выращивание микроорганизмов при температурах 5 °С проводят в холодильнике, а при температуре 25 °С – в комнатных условиях, недалеко от батарей центрального отопления (при этом чашки надо накрыть темным материалом, чтобы на них не попадал свет), при 40 °С – в термостате. Через 48–72 ч все чашки переставляют в холодильник и хранят там до следующего занятия. 4.5. Провести посев плесневых грибов или дрожжей на питательные среды с различной концентрацией глюкозы. Посев проводят в четыре пробирки на пивное сусло или среду Сабуро с 20, 40 и 60%-ой концентрацией глюкозы и без нее (контрольный опыт). Все пробирки предварительно подписывают, указав концентрацию глюкозы и поставив свой номер. Для посева используют суспензию спор плесневого гриба, приготовленную для предыдущего опыта. Кроме этого, готовят суспензию дрожжей. Для этого небольшое количество сухих дрожжей помещают в стаканчик или пробирку с водой и тщательно перемешивают. Посевы проводят стерильной бактериальной петлей или микропипеткой. Пробирки с засеянными средами ставят в штатив и помещают в термостат, где их термостатируют в течение 48 ч при температуре 25 °С. В случае необходимости можно на это же время оставить пробирки на столике вблизи батареи центрального отопления. При этом предварительно они должны быть тщательно закрыты плотным темным материалом, не пропускающим свет. Через двое суток выращенные культуры переставляют в холодильник и хранят там до следующего занятия. Занятие 2 Выполненные на предыдущем занятии посевы достают из холодильника и проводят их анализ. 1. Провести оценку роста бактерий на средах с различными значениями рН. Интенсивность роста бактерий на средах с различными значениями рН определяется по степени мутности среды. Перед этим содержимое каждой пробирки, на которой был проведен посев на предыдущем занятии, тщательно перемешивают (вращая пробирки между ладонями) и затем сравнивают друг с другом. 2.Провести оценку роста бактерий на средах с различной концентрацией NaCl и без нее. Интенсивность роста бактерий, как и в предыдущем опыте, определяется по степени мутности среды. Для ее проведения содержимое каждой пробирки тщательно перемешивают и сравнивают его с содержимым других пробирок, определяя степень мутности, которая оценивается визуально и обозначается следующим образом: отсутствие роста (–); слабый рост (+); умеренный рост (++); обильный рост (+++). 3.Провести оценку роста бактерий после воздействие на них высокой температуры. Действие высоких температур на спорообразующие и неспорообразующие бактерии определяют по характеру роста микроорганизмов на косом агаре (сплошной, в виде отдельных колоний или обильный, слабый, умеренный, отсутствие роста). 4. Приготовить мазки, окрасить их по Граму и промикроскопировать. Для распознавания изучаемых бактерий (микрококки, сарцины, бациллы или неспороносные палочки) из двух пробирок с рН 7 и нулевой концентрацией соли готовят мазки, высушивают и фиксируют их, а затем окрашивают по Граму и микроскопируют с увеличением объектива 90х или 100х. Увиденное под микроскопом зарисовывают в тетрадь и формулируют выводы. 5. Провести оценку роста плесневого гриба, растущего при разных температурах. Показателями влияния температуры на рост плесневых грибов служат величина колоний и интенсивность их спороношения. Для определения этих показателей чашки Петри, на которых росли грибы, переворачивают и со стороны дна чашки измеряют при помощи линейки диаметр выросших при разной температуре колоний. Полученные результаты записывают в табл. 4 и делают выводы. Для оценки интенсивности спороношения, как и в предыдущих опытах, пользуются следующими условными обозначениями: спороношение отсутствует (–); спороношение слабое (+); спороношение умеренное (++); спороношение сильное, или обильное (+++). Полученные данные заносят в табл. 4 и делают выводы о влиянии различных температур на рост и спороношение плесневого гриба. Определить родовое название гриба Для определения родового названия выросшего гриба готовят препарат типа «раздавленная капля» и микроскопируют его. Препарат готовят обычным способом. Внимание! Для того чтобы органы размножения грибов не нарушились и споры не осыпались, кусочек мицелия берут очень аккуратно на границе участка с заметным спороношением. Приготовленный препарат микроскопируют на увеличение объектива 10х. При микроскопировании надо найти и зарисовать органы размножения гриба и по ключу определить его родовое название. Провести оценку роста плесневого гриба и дрожжей, растущих при различной концентрации глюкозы. Влияние концентрации глюкозы в среде на рост плесневого гриба определяют по интенсивности развития мицелия и спорообразования. Для этого просматривают пробирки с посевами, сделанными на предыдущем занятии, и сравнивают их друг с другом. При сравнении полученных результатов пользуются условными обозначениями: отсутствие роста или спорообразования (–); слабый рост или спорообразование (+); умеренный рост или спорообразование (++); обильный рост или спорообразование (+++). Полученные данные заносят в табл. 5 и формулируют выводы. Интенсивность развития дрожжей на средах с различной концентрацией глюкозы определяется по степени мутности сусла. Перед определением содержимое каждой пробирки, на котором был проведен посев на предыдущем занятии, тщательно перемешивают (вращая пробирку между ладонями) и затем сравнивают ее с содержимым других пробирок. Интенсивность развития дрожжей по мутности среды характеризуют, используя указанные выше условные обозначения. Полученные данные заносят в табл. 5 и делают выводы. Определение родового названия изучаемого гриба ведут так, как указано в приложение 2. |