Микробиология стандарт. стандарт. Лабораторная работа 1 дезинфекция и стерилизация цель работы Ознакомиться с методами дезинфекции и стерилизации
 Скачать 76.79 Kb.
|
|
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 1 ДЕЗИНФЕКЦИЯ И СТЕРИЛИЗАЦИЯ Цель работы: Ознакомиться с методами дезинфекции и стерилизации. Материалы и оборудование: чашки Петри, пробирки, пипетки, парафильм или пищевая пленка, спиртовка Теоретическая часть: В естественных условиях микроорганизмы подвергаются воздействию разных по своей природе факторов внешней среды, которые могут либо стимулировать (стимулирующее действие), либо замедлять и прекращать их развитие, тормозя метаболические процессы (бактериостатическое действие), либо вызывать гибель микроорганизмов (бактерицидное действие). В зависимости от своей природы все факторы делятся на физические, химические и биологические. Наиболее сильное воздействие на микроорганизмы оказывают следующие физические и химические факторы: температура, влажность, осмотическое давление, ультрафиолетовые лучи, ионизирующая радиация, ультразвук, различные химические вещества и рН среды. Многие из этих факторов используются для подавления жизнедеятельности микроорганизмов. Дезинфекция широко применяется не только в лабораториях микробиологии, но и на различных пищевых предприятиях. В качестве дезинфицирующих веществ наибольшее практическое применение находят хлорная известь (0,5–5%-ные водные растворы), хлорамина (1–5%-ные водные растворы), йод (2%-ный раствор), фенол и его производные (1–5%-ные растворы), этиловый и изопропиловый спирт (70%-ные растворы). Выбор дезинфицирующего вещества, его концентрация, продолжительность срока дезинфекции зависят от конкретных условий: от того, что именно подвергается дезинфекции, степени предполагаемого микробиального загрязнения, устойчивости обеззараживаемых микроорганизмов. Стерилизация (обеспложивание) – это полное уничтожение всех микроорганизмов (вегетативных и споровых, патогенных и непатогенных) в обрабатываемом объекте. При проведении микробиологических исследований для получения правильных результатов необходимо обеспечить стерильность работы, т. е. не допустить попадания и развития посторонних микроорганизмов. Это достигается в результате проведения работ только при строго определенных условиях (определенных требованиях к помещению, оборудованию, посуде, питательным средам и т. д.). Посуда, инструменты, питательные среды, используемые для работы в лаборатории микробиологии, должны быть стерильными, поэтому стерилизация является одной из важнейших операций в практике проведения микробиологических исследований. Стерилизацию можно проводить различными способами: прокаливанием, паром под давлением, текучим паром, сухим жаром, кипячением, фильтрацией и др. Выбор способа стерилизации зависит от свойств стерилизуемого объекта, так как стерилизация не должна приводить к изменению его физического или химического состояния. Так, например, питательные среды никогда не будут стерилизовать сухим жаром, так как в их состав входит вода, которая при этом испарится. Ход работы: Подготовить посуду к стерилизации. Перед стерилизацией лабораторную посуду моют и сушат. Новую посуду вначале кипятят в воде, в которую добавляют соляную кислоту так, чтобы получился 1%-ный раствор, затем промывают холодной водой и, не вытирая, высушивают. Посуду, бывшую в употреблении, выдерживают в 20%-ном растворе серной кислоты в течение суток, затем моют в горячей воде, тщательно прополаскивают и высушивают. Чашки Петри, пробирки и пипетки перед стерилизацией закрывают пленкой. Чашки Петри стерилизуют, завернув их в бумагу по 1–5 штук. В бумагу заворачивают и пипетки. 2. Приготовить к стерилизации 3–5 пробирок и 1–2 колбы. Для этого чистые пробирки и колбы закрывают пленкой. 3. Подготовить к стерилизации 3–5 пипеток. В верхнюю часть каждой пипетки вставляют кусочек ваты, чтобы ее содержимое при работе не могло попасть в рот. 4. Подготовить к стерилизации вату и марлю. Перед стерилизацией марлю нарезают кусочками, а вату сворачивают в виде шариков, после чего заворачивают их в плотную бумагу по 1–3 штуки так, чтобы она не разворачивалась. Удобно из бумаги сделать кулечки, положить туда вату или марлю и хорошо закрыть кулечки. 5. Провести стерилизацию посуды. Подготовленную к стерилизации посуду и вату загружают в сушильный шкаф. Их кладут не слишком плотно, для того чтобы воздух мог хорошо циркулировать по всей камере и обеспечивался равномерный нагрев. После этого дверцу шкафа закрывают и включают нужную температуру. 6. Провести стерилизацию бактериальных петель. Бактериальные петли стерилизуют в пламени спиртовки. Петли делают из нихромовой или платиновой проволоки, чтобы при прокаливании на них не появлялась окалина. Если петля сухая, то ее в вертикальном положении вносят в верхнюю, самую горячую часть пламени и прокаливают до красного каления сначала ее нижнюю, а затем верхнюю часть. ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №2 Исследование степени загрязненности воздуха помещений методом оседания Коха Воздух – это среда, содержащая огромное количество микроорганизмов, которые могут с воздухом переноситься на значительные расстояния. В воздухе микроорганизмы сохраняются лишь некоторое время, после чего гибнут из-за воздействия ряда факторов: солнечной радиации, перепада температуры, отсутствия необходимых питательных веществ. Наиболее устойчивые микроорганизмы могут долго сохраняться в воздухе. К такой постоянной микрофлоре воздуха относятся споры грибов и бактерий, сарцины и др. В воздухе закрытых помещений могут содержаться загрязнения бактериальной и химической природы. Они являются следствием физиологических обменных процессов человека, бытовых действий (напр., приготовления пищи). В воздух помещений может поступать также комплекс продуктов деструкции полимерных отделочных материалов и т. д. Наконец, газовый состав воздух закрытых помещений определяется газовым составом приточного атмосферного воздуха и химическими веществами-загрязнителями, выделяемыми внутри помещений. В воздухе закрытых помещений обнаруживаются микроорганизмы, постоянно обитающие в больших количествах на слизистых оболочках верхних дыхательных путей человека. Они выделяются в окружающую среду при чиханье, кашле, смехе и разговоре с мельчайшими частицами слюны и носоглоточной слизи. Основная причина загрязнения воздуха помещений жилых и общественных зданий – накопление углекислого газа, аммиака, сероводорода, летучих жирных кислот и др. В воздухе закрытых помещений находится много бактерий, так как в большинстве таких помещений неизбежно массовое хождение, сопровождающееся поднятием в воздух пыли. Цель работы: Исследование степени загрязнённости воздуха школьных помещений методом оседания Коха. Материалы и оборудование: стерильные чашки Петри (5 шт.), алюминиевая фольга, стаканы с питательной средой, лупа, термостат. Стержень, основание штатива, марлевые повязки, перчатки, иглы, петли Ход работы: Основной этап работы включает проведение опыта. Опыт проводится 2 раза: первый раз – в конце учебного дня, второй раз – через 2 в начале учебного дня. После проведения основной части каждого опыта (поверхностный посев), чашки Петри помещаются в термостат при t = +37°C на неделю, после чего регистрируются результаты исследования. Заключительный этап работы включает подсчёт колоний микроорганизмов и количественный учёт микробов в 1 м3 воздуха каждого исследуемого помещения, составление выводов по работе, обсуждение итогов исследования, подготовку фотоотчёта и презентации. Культивирование бактерий Культивирование (выращивание) микробов, в частности, бактерий проводится на питательных средах. Методика проведения исследования Метод заключается в том, что чашку Петри с МПА оставляют на некоторое время открытой (поверхностный посев), а затем закрывают крышкой и ставят в термостат при t = 37°C. О степени загрязнённости воздуха судят по количеству выросших колоний. Метод даёт приблизительные результаты количества микроорганизмов в единице объёма воздуха. Чашки Петри с агаром ставим в разные помещения. Открываем на 5 минут, а затем закрываем. На крышке отмечаем место, где был проведён анализ. Чашки помещаем в термостат при + 37°С. (или в холодильник) Выдерживаем не более недели. Подсчитывает под лупой число колоний, выросших на МПА. Определяем площадь дна чашки Петри. Зная число колоний, рассчитываем количество бактерий в 1 м3 воздуха. На поверхности питательной среды в 100 см3 в течение 5 минут при спокойном состоянии оседает количество микроорганизмов, содержащихся в 100 л воздуха. Например, в чашке Петри диаметром 10 см выросло 25 колоний. Площадь питательной среды в чашке Петри равна 78,5 см2. Вычисляем количество колоний на 100 см2: 25 колоний – 78,5 см2 Х колоний – 100 см2 Х = 32 колонии Вычисляем количество бактерий в 1м3 воздуха (1000 л): 32 – 10 л Х – 1000 л Х = 3200 спор Следовательно, в 1м3 воздуха содержится 3200 спор клеток микроорганизмов. Критерии для оценки загрязнённости помещений по числу микроорганизмов в 1 м3 воздуха. Оценка воздуха Летний режим Зимний режим Количество микроорганизмов Количество микроорганизмов Чистый 1500 4500 Грязный 2500 7000 Результаты работы (как образец) В ходе исследования для микробиологической оценки воздуха каждого помещения использовалось по 1 чашке Петри. На основании подсчёта колоний, выросших в чашках Петри, была проведена оценка содержания микроорганизмов в 1 м3 воздуха помещения. ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 3 Выращивание на питательной среде микроорганизмов зубного налета Цель работы: Вырастить и изучить микроорганизмы находящиеся в зубном налете. Материалы и оборудование: чашка Петри, питательная среда Чапека, агар, шпатели, иглы, парафильм или пищевая пленка, зубочистки, марлевая повязка, перчатки. Практическая часть: Приготовить питательную среду и разлить ее по чашкам Петри, накрыть пленкой до опыта. В чашке Петри на питательной среде оставить мазок с зубов Наблюдать за ростом микроорганизмов Охарактеризовать колонии микроорганизмов, использую теоретическую часть практикума. Сделать выводы. ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №4 Изучение морфологии бактерий, грибов и дрожжей Цель работы: Ознакомиться с морфологическим разнообразием бактерий и основными признаками, используемыми при их идентификации. Материалы и оборудование:Микроскоп; пипетка; предметные стекла; спиртовка; иммерсионное масло; фильтровальная бумага; набор красок для окраски по Граму (фильтровальные бумажки с генцианвиолетом, растворы Люголя и фуксина рабочего) и окраски спор по Шефферу-Фултону (растворы бриллиантовой зелени и сафранина); 96 %-ный этиловый спирт; поднос для предметных стекол; промывалка; питательные среды с заранее выращенными бактериями и грибами; марлевая повязка, перчатки Теоретическая часть: Морфологические признаки бактерий Бактерии объединяют обширную группу в основном одноклеточных микроорганизмов, разнообразную по форме, размерам и обмену веществ. Они являются прокариотными микроорганизмами. При дифференциации бактерий путем микроскопии учитывают размеры и формы клеток, их взаимное расположение, химический состав и строение клеточных стенок, способность образовывать споры и капсулы, подвижность. Основными формами бактерий, которые присутствуют в пищевом сырье, а также в продуктах растительного и животного происхождения, являются сферические бактерии (кокки) и палочковидные бактерии (палочки). К основным морфологическим признакам кокков относятся их размеры (диаметр кокков в среднем составляет 1…2 мкм) и взаимное расположение. Взаимное расположение кокков определяется направлением образования перегородок при делении клеток. Если после деления клетки расходятся и располагаются поодиночке, то такие формы называются монококками или микрококками. Если при делении образуются скопления, напоминающие виноградные грозди, их относят к стафилококкам. Кокки, остающиеся после деления в одной плоскости связанными парами, называются диплококками, а образующие разной длины цепочки – стрептококками. Сочетания из четырех кокков, появляющиеся после деления клетки в двух взаимно перпендикулярных плоскостях представляют собой тетракокки. Если кокки делятся в трех взаимно перпендикулярных плоскостях, то они образуют скопления кубической формы - сарцины. Как выглядят различные скопления кокков под микроскопом изображено на рис. 3. Рис. 3 Взаимные расположения кокков: а - микрококки; б - диплококки; в - стрептококки; г - тетракокки; д - стафилококки; е - сарцины Основными морфологическими признаками палочковидных бактерий, которые определяются путем микроскопии,являются размеры палочек (средняя длина палочек – 2…7 мкм, диаметр в поперечнике - 0,5…1 мкм), взаимное расположение клеток, способность образовывать споры, подвижность. Палочковидные бактерии могут располагаться поодиночке, попарно (диплобактерии) и цепочками (стрептобактерии). При микроскопии легко можно определить спорообразующие и не спорообразующие формы палочковидных бактерий. Вегетативные клетки хорошо адсорбируют красители на своей поверхности и полностью окрашиваются. Оболочка споры малопроницаема, краски в них почти не проникают и под микроскопом споры имеют вид округлых или овальных блестящих зерен. Палочки, образующие споры называются бациллами и клостридиями. У бацилл размер споры не превышает ширину клетки и поэтому при образовании споры форма клетки не меняется. У клостридий диаметр споры больше толщины клетки и поэтому при созревании споры клетка приобретает форму веретена (если спора располагается в центре клетки) или барабанной палочки (если спора располагается на одном из полюсов клетки). На рис. 4 представлены морфологические разновидности палочковидных бактерий. Рис. 4 Морфология палочковидных бактерий: а - диплобактерии; б - стрептобактерии; в - бациллы; г - клостридии При идентификации палочек диагностическое значение имеют также расположение спор в клетках бацилл и клостридий, наличие и расположение жгутиков, способность образовывать капсулы. Морфологические признаки грибов Грибы относятся к царству Fungi (Mycetes, Mycota). Это многоклеточные или одноклеточные нефотосинтезирующие (бесхлорофилльные) эукариотические микроорганизмы с клеточной стенкой. Грибы имеют ядро с ядерной оболочкой, цитоплазму с органеллами, цитоплазматическую мембрану и многослойную, ригидную клеточную стенку, состоящую из нескольких типов полисахаридов, а также белка, липидов и др. Некоторые грибы образуют капсулу. Цитоплазматическая мембрана содержит гликопротеины, фосфолипиды и эргостеролы. Грибы являются грамположительными микробами, вегетативные клетки — некислотоустойчивые. Грибы состоят из длинных тонких нитей (гиф), сплетающихся в грибницу, или мицелий. Гифы низших грибов — фикомицетов — не имеют перегородок. У высших грибов — эумицетов — гифы разделены перегородками; их мицелий многоклеточный. Различают гифальные и дрожжевые формы грибов. Гифальные (плесневые) грибы образуют ветвящиеся тонкие нити (гифы), сплетающиеся в грибницу, или мицелий (плесень). Гифы, врастающие в питательный субстрат, называются вегетативными гифами (отвечают за питание гриба), а растущие над поверхностью субстрата — воздушными или репродуктивными гифами (отвечают за бесполое размножение). Гифы низших грибов не имеют перегородок. Они представлены многоядерными клетками и называются ценоцитными. Гифы высших грибов разделены перегородками, или септами с отверстиями. Дрожжевые грибы (дрожжи), в основном, имеют вид отдельных овальных клеток (одноклеточные грибы). По типу полового размножения они распределены среди высших грибов — аскомицет и базидиомицет. При бесполом размножении дрожжи образуют почки или делятся, что приводит к одноклеточному росту. Могут образовывать псевдогифы и ложный мицелий (псевдомицелий) в виде цепочек удлиненных клеток — «сарделек». Грибы, аналогичные дрожжам, но не имеющие полового способа размножения, называют дрожжеподобными. Они размножаются только бесполым способом — почкованием или делением. Грибы размножаются спорами половым и бесполым способами, а также вегетативным путем (почкование или фрагментация гиф). Грибы, размножающиеся половым и бесполым путем, относятся к совершенным. Несовершенными называют грибы, у которых отсутствует или еще не описан половой путь размножения. Бесполое размножение осуществляется у грибов с помощью эндогенных спор, созревающих внутри круглой структуры — спорангия, и экзогенных спор — конидий, формирующихся на кончиках плодоносящих гиф. Практическая часть: Взять чашки Петри с выращенными колониями грибов и бактерий, с помощью пипетки сделать микропрепараты бактерий и грибов. Рассмотреть препараты под микроскопом. Зарисовать увиденные клетки грибов и бактерий. Сделать выводы. ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 5 Приготовление препаратов микроорганизмов и их окраска Цель работы: Научиться готовить препараты микроорганизмов и проводить их окраску. Задачи: 1. Ознакомиться с приготовлением препаратов бактерий в «раздавленной» и «висячей» каплях. 2. Приготовить три препарата и окрасить их: – первый – простым способом; – второй – сложным способом (по Граму); – третий – способом, при котором окрашиваются споры. 3. Промикроскопировать окрашенные препараты. 4. Оформить отчет, зарисовать увиденное под микроскопом в тетрадь и сделать выводы. Материалы и оборудование: предметные стекла, иглы, петли, спиртовка, пинцет, генцианвиолет, йод, фильтровальная бумага, этиловый спирт, 96%р-р спирта, р-р Люголя, эфир, карболовый фуксин Циля, 0,5% р-р соляной кислоты, 5% р-р серной кислоты, метиленовая синь Лефлера, марлевые повязки, перчатки. Теоретическая часть Микроскопирование микроорганизмов можно проводить на живых видах и в убитых культурах, в окрашенном и неокрашенном состоянии. Микроорганизмы содержат большое количество воды, и свет через них хорошо проходит, поэтому для того, чтобы увидеть их под микроскопом, необходимо правильно приготовить соответствующие препараты. Препараты обычно готовят на предметном стекле. Помимо них, иногда используют и покровные стекла. Все стекла, используемые для приготовления препаратов, должны быть безупречно чистыми. Для этого их предварительно тщательно моют. Для определения формы или выявления подвижности микроорганизмов их микроскопируют в живом состоянии. Для этого готовят препарат типа «раздавленная капля» или «висячая капля». Раздавленная капля. Для приготовления этого препарата на середину предметного стекла наносят каплю воды или другой прозрачной жидкости и вносят в нее немного исследуемых микроорганизмов. Каплю осторожно накрывают («раздавливают») покровным стеклом. Для этого покровное стекло берут за грани, ставят на ребро у края капли и осторожно опускают, постепенно вытесняя воздух между покровным и предметным стеклом, чтобы не допустить образования в жидкости пузырьков воздуха. Жидкость должна тончайшим слоем заполнить все пространство между стеклами, но не выступать за края покровного стекла. Излишек выступившей жидкости удаляют фильтровальной бумагой. Если жидкости недостаточно и между стеклами осталась воздушная полость, воду, наоборот, добавляют, подпуская ее стеклянной палочкой под покровное стекло, или заново переделывают препарат. При исследовании бактерий и дрожжей, выращенных на плотной среде, берут небольшое их количество бактериологической иглой, предварительно прокаленной в пламени спиртовки и охлажденной. Затем вносят их в каплю воды, которую нанесли на предметное стекло, и тщательно перемешивают. При исследовании грибов берут небольшой комочек мицелия с помощью двух препаровальных игл (вставленных в пластмассовые или деревянные палочки). Мицелий помещают на предметное стекло в каплю смеси спирта и глицерина и осторожно расщепляют иглами, стараясь как можно лучше разъединить гифы. Если исследуемые микроорганизмы (бактерии, дрожжи, споры грибов) находятся в жидкой среде, то на предметное стекло наносят каплю микробной суспензии (взвеси) без добавления воды или другой жидкости. Суспензию берут стеклянной палочкой или бактериологической петлей. Бактерии и дрожжи микроскопируют с объективом 40х, грибы – с объективами 8х или 10х и 20х или 40х. Можно микроскопировать их и с объективом 90х или 100х, используя при этом особо тонкое покровное стекло, на поверхность которого наносят иммерсионное масло. Микроорганизмы, находящиеся в препарате «раздавленная капля», можно изучать и в темном поле зрения. В этом случае толщина предметных стекол не должна превышать 1,2 мм, а покровных – 0,2 мм. Микроскопирование в темном поле проводят на обычном световом микроскопе, заменив в нем конденсор на темнопольный. В таком конденсоре центральная часть затемнена и свет проходит только через периферийную часть линзы. Он проходит его под углом, и поэтому в глаза исследователя прямые лучи света не попадают. Виден только свет, отраженный от микроорганизмов. Поэтому микроорганизмы видны на темном фоне как ярко освещенные частицы. Для изучения подвижности микробов, процесса прорастания спор и т. д. готовят препарат типа «висячая капля». Для этого на середину необезжиренного покровного стекла наносят каплю жидкости с микроорганизмами. Края стекла смазывают вазелином, осторожно переворачивают и кладут на предметное стекло, которое посередине имеет углубление, так, чтобы капля находилась в углублении. Она должна свободно свисать, не касаясь краев или дна углубления. В подавляющем большинстве под микроскопом рассматривают окрашенные препараты микроорганизмов. Окраска микроорганизмов зависит от физико-химических особенностей микробной клетки и взаимодействия ее структур и веществ с используемыми реактивами. Способы окрашивания делятся на простые и сложные. При простых способах окраски используют один краситель, например фуксин. Такая окраска применяется для ознакомления с морфологией бактерий. При сложных способах окраски применяют два или более красителя и используют различные обесцвечивающие вещества(чаще всего спирт). Такое окрашивание позволяет выявить детали строения микроорганизмов (споры, запасные питательные вещества и т. д.) и провести их дифференциацию (различить бактерии, сходные по внешнему виду, но принадлежащие к разным видам.) Окраска спор бактерий производится с применением притравы (кислот, щелочей) для разрыхления оболочки спор, что облегчает проникновение в них краски. Независимо от того, каким способом будет вестись окраска микроорганизмов, предварительно надо приготовить, высушить и зафиксировать мазок. Фиксацию надо проводить для того, чтобы закрепить микроорганизмы на стекле. Только в этом случае микроорганизмы хорошо окрасятся, при окрашивании останутся на стекле и не будут смыты водой. Ход работы: Приготовить препараты. На середину чистого предметного стекла наносят каплю воды. В нее вводят немного бактерий, взятых с плотной питательной среды кончиком стерильной бактериологической иглы. Тщательно перемешивают петлей полученную суспензию (она должна быть слабомутной) и равномерно распределяют (размазывают) ее тонким слоем по поверхности предметного стекла на площади 2−3 см2. Полученный мазок высушивают при комнатной температуре на воздухе или (для ускорения) в токе теплого воздуха пламенем спиртовки, не допуская перегрева стекла (стекло надо держать мазком вверх). После этого мазок фиксируют, для чего стекло с сухим мазком проводят 3−4 раза над пламенем спиртовки, прикасаясь к нему той стороной, где мазок отсутствует. Мазки бактерий можно фиксировать этиловым спиртом, смесью этилового спирта и эфира, а также другими веществами (фиксаторами). 2.Окрасить препараты. 2.1. Окраска простым способом. На охлажденный фиксированный мазок наносят на 20–40 с 2–3 капли карболового фуксина Циля, после чего краску смывают водой из промывалки. Промывание заканчивают, когда вода станет бесцветной. Промытый препарат просушивают на воздухе. Для более быстрого высыхания нижнюю часть стекла и края, на которых нет препарата, можно промокнуть фильтровальной бумагой. 2.2. Окраска спор бактерий. Для окраски спор готовят мазок бактерий так, как описано в п. 2.1, но не фиксируют его. 2.2.1. На сухой мазок наносят 1–2 капли 0,5%-ного раствора соляной кислоты и нагревают его в течение 1–2 мин над пламенем спиртовки (до выделения паров). 2.2.2. Остатки кислоты сливают, мазок промывают водой, высушивают на воздухе и фиксируют в пламени спиртовки (как указано в п. 4.1). 2.2.3. На охлажденный фиксированный мазок наносят 1–2 капли фуксина Циля и нагревают над пламенем спиртовки до появления пара. При этом необходимо следить, чтобы раствор краски не подсох. 2.2.4. Краситель смывают водой и погружают препарат в стаканчик с 5%-ным раствором серной кислоты на 20–40 с, после чего его сразу же промывают водой. При погружении в кислоту протоплазма клеток обесцвечивается, а споры остаются окрашенными. 2.2.5. На промытый препарат наносят на 3–5 мин метиленовую синь Лефлера (2–3 капли), после чего препарат тщательно промывают водой и высушивают. При этом способе окраски споры окрашиваются в красный цвет, а клетки – в голубой. 3. Окрасить бактерии по методу Грама. Сущность метода заключается в том, что бактерии последовательно окрашиваются красителем генцианвиолетом и йодом, а затем обрабатываются спиртом. При этом одни бактерии – грамположительные – остаются окрашенными, а другие – грамотрицательные – обесцвечиваются. Это связано с тем, что у грамположительных бактерий образовавшееся окрашенное соединение при обработке спиртом удерживается в протоплазме клетки, а у грамотрицательных оно вымывается из клетки. Приготовить мазок так, как указано в п. 1. 3.1. На фиксированный мазок кладут полоску фильтровальной бумаги, наносят на нее в том месте, под которым находится мазок, 3–4 капли раствора генцианвиолета, и при помощи пинцета разглаживая бумагу, плотно прижимают к стеклу. Через 2 мин бумагу снимают, а излишки краски смывают водой. 3.2. На мазок наносят 3–4 капли раствора Люголя (раствор йода в йодистом калии) и по истечении 2 мин сливают его. 3.3. Препарат погружают в стаканчик с 96%-ным спиртом на 30–40 с и сразу же после этого промывают водой. 3.4. На препарат наносят на 2 мин разбавленный раствор фуксина. После этого промывают его водой и просушивают. При данном способе окраски грамположительные бактерии будут фиолетовыми, а грамотрицательные – красными, так как после обесцвечивания спиртом они окрашиваются фуксином. Внимание! При недостаточной обработке мазка спиртом все клетки сохраняют свою окраску, а при избыточной все обесцвечиваются. Микроскопировать окрашенные препараты. Все окрашенные препараты последовательно микроскопируют сначала с объективом 8х или 10х, а затем наносят на них каплю иммерсионного масла и микроскопируют с объективом 90х или 100х. Увиденное в микроскоп при большом увеличении (объектив 90х или 100х) зарисовывают в тетради. Делают выводы о наличии у разных микроорганизмов спор и об их отношении к окраске по Граму. |