Технология получения антибиотиков. Лекции Технология получения антибиотиков. Лекции Лабораторный и промышленный регламент. Методы культивирования продуцентов антибиотиков
 Скачать 141.5 Kb.
|
|
Лекция 1 Общие сведения о производстве антибиотиков. План лекции Лабораторный и промышленный регламент. Методы культивирования продуцентов антибиотиков. Характеристика биореакторов, используемых в производстве антибиотиков. Общая технологическая схема производства антибиотиков. Лабораторный и промышленный регламент Лабораторный регламент – это технологический документ, завершающий лабораторные исследования по выработке метода получения антибиотика. Он служит основой для разработки промышленного регламента. Задачей лабораторного регламента является определение оптимального метода промышленного производства антибиотического вещества. Лабораторный регламент используется при проектировании и эксплуатации опытно-промышленной установки, создаваемой для отработки новой технологии производства лекарственного средства и наработки нового вещества для клинических испытаний. Опытно-промышленный регламент - технологический документ, которым завершается отработка новой технологии производства лекарственного средства на опытно-промышленной установке. ОПР используется для изготовления и испытания опытных образцов (партий) новых лекарственных средств в полупроизводственных условиях, отработки качественных показателей нового лекарственного средства, вводимых в нормативную документацию (ФСП, ТУ) и при составлении данных для проектирования промышленного производства новой продукции. При выпуске небольших партий нового лекарственного средства (от нескольких сот граммов до 1 кг в год) и сохранении этого количества в течение длительного периода допускается работа на основе ОПР с пересмотром документа каждые 3 года. Пусковой (временный) регламент - технологический документ, на основании которого осуществляют ввод в эксплуатацию и освоение вновь созданного промышленного производства лекарственного средства. Пусковой регламент составляют на основе опытно-промышленного регламента и проектной документации на производство этой продукции, а также на основе действующих производств, в технологию которых вносятся принципиальные изменения. Срок действия пускового регламента в производстве - до 3-х лет. Промышленный регламент - технологический документ действующего серийного производства лекарственного средства. Промышленный регламент составляют на основе пускового регламента, после внесения в него изменений и дополнений, принятых при освоении производства. Промышленный регламент должен состоять из следующих разделов: - характеристика готового продукта; - химическая схема производства, - технологическая схема производства; - аппаратурная схема производства и спецификация оборудования; - характеристика сырья, вспомогательных материалов и полупродуктов; - изложение технологического процесса; - материальный баланс; - переработка и обезвреживание отходов производства; - контроль производства; - безопасная эксплуатация производства; - охрана окружающей среды; - перечень производственных инструкций; - технико-экономические нормативы; - информационные материалы. Характеристика готовой продукции производства должна содержать: - наименование продукции; - категорию и номер действующего нормативного документа и регистрационный номер; - основное назначение продукции; - краткое описание внешнего вида и потребительских свойств продукции: - нормативные требования к упаковке, маркировке, транспортированию, условиям хранения; - срок годности. Методы культивирования продуцентов антибиотиков Наиболее перспективным методом выращивания микроорганизмов-продуцентов антибиотиков признан метод глубинного культивирования. Существует следующие модификации глубинного способа выращивания микроорганизмов: периодическое культивирование; отъемно-доливной метод; метод подпитки; батарейный способ; непрерывное культивирование. Характеристика биореакторов, используемых в производстве антибиотиков Биосинтез антибиотиков включает комплекс взаимосвязанных биохимических, физико-химических и диффузионных процессов, интенсивность протекания которых во многом определяется режимом работы диффузионного аппарата-ферментера и его гидродинамической характеристикой. Применительно к культуральным жидкостям антибиотиков, где наличие трехфазной системы (жидкость — твердое тело — воздух) и меняющиеся во время биосинтеза физико-химические параметры среды (в первую очередь вязкость) чрезвычайно затрудняют протекание процессов массообмена, конструктивное оформление ферментера приобретает особо важное значение. Глубинное культивирование микроорганизмов-продуцентов антибиотиков, осуществляемое при интенсивных аэрации и перемешивании среды, проводится в в специальных аппаратах-ферментерах, представляющих собой закрытые цилиндрические сосуды со сферическим днищем, снабженные мешалкой, барботером для подачи воздуха, отбойниками, рубашкой или змеевиками для нагрева и охлаждения среды, а также запорной арматурой и контрольно-измерительными приборами. Размеры биореакторов определяются соотношением внешнего диаметра к высоте, которая варьирует обычно в пределах от 1:2 – 1:6. В зависимости от характера проводимых работ используют ферментеры различного типа: лабораторные, полупроизводственные, производственные. Лабораторные ферментеры изготавливаются из стекла и нержавеющей стали, они имеют, как правило, емкость 0,5 – 100 л. Обычно стерилизацию таких ферментеров производят в автоклаве. Питательные среды, как правило, стерилизуют отдельно, а затем переносят в стерильный ферментер. Полупроизводственные ферментеры имеют емкость 100 л - 10 м3 и выполнены из нержавеющей стали. Производственные ферментеры имеют емкость от 10 до 100 м3 и более. (на ОАО «Биохимик» в 10 А цехе пос. аппарат-10 м3, ферментатор- 73 м3). В Дании в 1987 г. изготовлен промышленный ферментер для производства пенициллина емкостью 200 м3. Общая продуктивность процесса в биореакторе определяется количеством целевого продукта в ЕД активности или в кг, получаемого с 1 м3 ферментационной емкости в час. Общая технологическая схема производства антибиотиков Промышленный способ получения антибиотиков - сложный многоступенчатый процесс, который включает ряд технологических стадий. Стадия биосинтеза антибиотика - основная биологическая стадия в процессе получения антибиотика. Задача этой стадии - обеспечение для продуцента антибиотика таких условий развития, которые бы способствовали максимальному уровню биосинтеза антибиотика. Стадия предварительной обработки и фильтрации культуральной жидкости. Стадия выделения и химической очистки антибиотика. Стадия получения готовой продукции. Лекция 2 Стадия биосинтеза. План лекции 1.Вспомогательные технологические операции на стадии биосинтеза. 2.Основные условия развития продуцента в биореакторе. 1.Вспомогательные технологические операции на стадии биосинтеза. Стадия биосинтеза антибиотика включает ряд вспомогательных технологических операций. 1.1 Приготовление и стерилизация питательных сред Стерилизацию в промышленных условиях осуществляется двумя методами: периодическим и непрерывным. Периодический метод стерилизации применяется при использовании небольших объемов среды. Метод состоит в том, что среда нагревается до температуры 120-130˚С в ферментерах или в специальных котлах-стерилизаторах в течение 30-60 мин и затем охлаждается до 27-30˚С. Непрерывный метод применяется при использовании больших объемов среды. Подготовленная среда из специального сосуда насосом подается в стерилизационную колонку, через которую пропускается острый пар давлением 0,5 МПа. Пар подается сверху по внутренней трубе, которая имеет щелевидные прорези, благодаря чему пар поступает в среду и быстро ее нагревает. Среда в колонку подается снизу и движется по спирали вокруг внутренней трубы. Нагретая до 130˚С среда поступает в аппарат -выдерживатель, где она выдерживается в течение 5-10 мин. Из выдерживателя стерильная среда поступает в змеевиковый холодильник, где она охлаждается до 30-35˚С и поступает в ферментатор. Этот метод имеет ряд преимуществ перед периодическим методом: возможность автоматического регулирования процесса; быстрый и равномерный нагрев среды; обеспечение более полной стерильности среды. 1.2 Получение стерильного сжатого воздуха Воздух для технологического процесса забирается из атмосферы. При заборе он проходит через всасывающий фильтр, где очищается от грубых механических примесей (пыли). Из всасывающего фильтра воздух поступает в нагнетатель, где он сжимается до давления 0,25 – 0,26 МПа, нагреваясь при этом до 140 – 170 ˚С. Затем воздух через воздухоохладитель, где он охлаждается до 70 ˚С при снижении давления до 0,18 – 0,20 МПа, поступает на головной воздушный фильтр. Здесь он проходит предварительную очистку от микроорганизмов, однако очищается от них не полностью. Фильтрующим материалом головного фильтра является стекловолокно, которое набивается в специальные маты. Из головного фильтра воздух поступает в индивидуальные фильтры биореакторов, где полностью очищается от микроорганизмов. 1.3 Подготовка посевного материала Подготовка посевного материала одна из ответственных операций в цикле биологического метода получения антибиотиков. Качество и количество посевного материала определяют развитие культуры в ферментаторе и биосинтез антибиотика. Продуцент антибиотика обычно выращивается на богатых по составу средах, способных обеспечить наивысшую физиологическую активность микроорганизмов. Подготовка посевного материала - процесс многоступенчатый. Микроорганизм предварительно выращивают на агаризированной среде в пробирке, затем из пробирки высевают в колбы с жидкой питательной средой и проводят две генерации при глубинном выращивании на качалках в течение 2-3 суток для каждой генерации. Из второй генерации культуры (в колбе) делают посев в инокулятор. Затем хорошо развившуюся культуру переносят в посевной аппарат, откуда и производят посев в основной ферментатор. 1.4 Подготовка оборудования Прединокулятор, инокулятор и ферментатор сначала тщательно промывают обессоленной водой от остатков посевного материала, а затем проводят технический осмотр аппарата и арматуры. Проверяют исправность мешалки, перенабивают сальник вала мешалки. При необходимости меняют прокладки люка. Затем в аппарат загружают обессоленную воду. Эту воду нагревают до 100оС и выдерживают в течение 1 часа. Затем охлаждают её до 65оС и выдавливают стерильным сжатым воздухом в канализацию. После этого в аппарат снова загружают такое же количество обессоленной воды, нагревают её до 125оС под давлением 0,13 – 0,15 МПа, выдерживают 1 час, охлаждают до 65оС и выдавливают стерильным сжатым воздухом в канализацию. Затем проверяют аппарат на герметичность. Основные условия развития продуцента в биореакторе Процесс культивирования продуцента антибиотика в биореакторе проходит при строгом выполнении условий его развития. Большое внимание уделяется поддержанию заданной температуры культивирования, активной кислотности среды рН, степени аэрации и скорости работы мешалки. Основными условиями культивирования продуцентов антибиотиков являются: Использование оптимальной среды. Отсутствие посторонней микрофлоры (чистая культура микроорганизма-продуцента). Поддержание необходимой температуры. Оптимальное значение рН. Повышенное давление в аппаратах. Обеспечение культуры достаточным количеством кислорода. Отсутствие интенсивного вспенивания. Для максимального образования антибиотика необходимо, чтобы все параметры процесса культивирования имели оптимальное значение. 2.1 Физико- химические факторы Температура. Для биосинтеза каждого антибиотика требуется определенная оптимальная температура. Для биосинтеза пенициллина грибом Pen. chrysogenum – это 25-26 ˚C. Для образования антибиотиков актиномицетами поддерживается более высокая температура (27-28 ˚C , 26-30 ˚С). Для продукта эритромицина Streptomyceserythreus наиболее благоприятной является температура 31-33 ˚С. В процессе культивирования вследствие интенсивно протекающих окислительных процессов выделяется значительное количество тепла. Поэтому для поддержания температуры на оптимальном уровне необходимо непрерывное охлаждение среды. Для отвода теплоты ферментации в ферментёрах применяются рубашки и змеевики. pH. Для биосинтеза большинства известных антибиотиков opt значение рН близко к нейтральному. При значительном закислении или защелачивании среды процесс биосинтеза тормозится. Многие антибиотики в щелочных или кислых условиях неустойчивы и быстро инактивируются. Изменение рН среды в процессе культивирования зависит, в основном, от состава питательной среды и характера процессов метаболизма. Для регулирования рН в питательные среды для получения антибиотиков часто добавляют мел. Это соединение практически нерастворимо в воде и почти нейтрально. Оно реагирует с возникающими в процессе метаболизма кислотами, образуя нейтральные соли и СО2, который удаляется из среды. Поэтому, мел предотвращает нежелательное закисление среды. Давление воздуха. Процесс биосинтеза всех антибиотиков ведут при повышенном давлении в аппаратах (до 0,3-0,4 атм), т.к. избыточное давление позволяет избежать подсос воздуха извне и заражение культуры посторонней микрофлорой. Кроме того, повышение давление усиливает растворимость О2 , что оказывает благоприятное влияние на процесс ферментации. Аэрация в процессе культивирования продуцентов антибиотиков Продуценты антибиотиков являются аэробными м/о и требуют для роста и развития наличия растворенногокислорода в среде. Он является одним из компонентов питательной среды, выполняющим функцию акцептора водорода окислительно-восстановительной реакций обмена веществ и используется в конструктивном метаболизме. Аэрирование культур в ферментёре осуществляется в основном путем продувания воздуха через к.ж. с одновременным перемешиванием ее или без него. Степенью аэрации, равной единице является такая аэрация, при которой через определенный V среды за 1 минуту продувается такой же V воздуха. Известно, что максимальное образование большинства антибиотиков (пенициллин, стрептомицин) происходит при степени аэрации, близкой к единице. 2.2 Причины пенообразования и методы пеногашения Аэрация и перемешивание среды культивирования продуцентов антибиотиков вызывают образование слоя пены. Основная причина появления большого количества пены – наличие белковых веществ в среде и ее высокая вязкость, обусловленная обильным накоплением биомассы. Питательные среды, применяемые при получении антибиотиков, содержат вещества (ПАВ), способные образовывать весьма стойкие пены: белки соевой кукурузной муки, кукурузного экстракта. Аналогичные вещества могут возникать в процессе культивирования микроорганизмов (продукты жизнедеятельности). Образование слоя пены мешает соблюдению режима ферментации. Пена может проникнуть в различные узлы коммуникаций, связанных с ферментёром, где может развиться посторонняя микрофлора. Возникает возможность выброса к.ж. из аппарата через трубопровод для выхода воздуха или сальник мешалки, что связано с потерями антибиотика, заражением культуры постоянной микрофлоры. Предложено большое разнообразие средств, как для разрушения пены, так и для предупреждения ее образования. К числу первых относятся химические, физические и механические способы, к числу вторых как наиболее эффективных следует отнести методы разработки состава малопенящихся сред, варьирование количества посевного материала и т.п. Наибольшее распространение получили химические пеногасители – ПАВ, способствующие снижению пены и дальнейшему ее разрушению. Особенное место среди химических пеногасителей занимают природные жировые пеногасители – подсолнечное, соевое, оливковое масло и животные жиры. Они являются не только пеногасителями, но и источниками углеродного питания м/о и в ряде случаев - специфическими стимуляторами биосинтеза. Поэтому, несмотря на относительно слабое иногда действие, их применение почти во всех случаях целесообразно. Однако добавление их в процессе биосинтеза в количествах, превышающих 0,5-0,7% к массе среды за операцию, когда они не являются питательным субстратом, нецелесообразно. Увеличение расхода жира ухудшает газообмен, а непотребленный в процессе биосинтеза жир затрудняет в дальнейшем фильтрацию к.ж. Значительно более эффективны синтетические пеногасители. Применение синтетических пеногасителей позволяет снизить расход более дорогих и дефицитных жиров. Эффективность их во много раз выше, чем у жиров. Широко используется пропинол Б-400 (полиэфир), лапрол полиэтиленгликоль. В производственных условиях осуществляется автоматический контроль за пенообразованием. Наиболее широко распространенным является устройство, работа которого основана на непосредсвенном контакте образующейся пены с введенным в ферментёр электродом. Когда пена поднимается и соприкасается с электродом, специальное электронное реле замыкает электрическую цепь, вследствие чего приводится в действие клапан, установленный на линии трубопровода, соединяющего резервуар пеногасителя с ферментёром. Пеногаситель обычно подается до тех пор, пока пена не спадет ниже электрода. Можно удалять вспениватели из исходной питательной среды с помощью добавления адсорбентов (активированного угля, ионитов, коллоидной глины), связывающих белковые пенообразователи. Хорошие результаты дает метод, основанный на взаимном связывании вспенивателей. Этот метод основал на таком подборе соотношений компонентов питательных сред, при котором содержащиеся в них вспениватели взаимно ослабляют друг друга. В случае образования трудногасимых пен наилучшие результаты дает комбинирование химических пеногасителей с механическими. Используются механические пеногасители различных конструкций. Пузырьки пены можно разрушать ударной силой струи жидкости, для чего внутри ферментёра устанавливается центробежный насос, забирающий жидкость из нижней или верхней части аппарата и впрыскивающий ее на слой пены. В качестве механических пеногасителей могут быть использованы лопасти, укрепленные на верхней части вала мешалки, вращающейся над поверхностью жидкости. Могут быть использованы специальные выносные устройства – пеноотделители. Конструкции их многообразны, начиная от сепараторов, в которых пена разрушается вращающимися лопостями, дисками и, кончая специальными устройствами с использованием акустических колебаний. Акустические методы пеногашения за последние годы стали широко использоваться за рубежом. Лекция № 3 Предварительная обработка и фильтрация культуральной жидкости. План лекции 1.Состав и фильтрационные характеристики культуральной жидкости. 2. Предварительная обработка культуральной жидкости. Фильтрация культуральной жидкости. Мембранная фильтрация. 1. Состав и фильтрационные характеристики культуральной жидкости. Культуральная жидкость (к. ж.), образующаяся в процессе ферментации, представляет собой сложную многофазную систему: в водной фазе содержатся: 1. клетки продуцента; 2.продукты их жизнедеятельности; 3. непотребленные компоненты питательной среды; 4. мельчайшие капельки жира; 5. пузырьки воздуха; 6. мел. В свою очередь водная фаза к.ж. (нативный р-р) включает большое количество органических и неорганических веществ, коллоидных фракций белков. Сухой остаток к.ж.– до 17% Содержание биомассы в к.ж. – 8% - 10%. Концентрация целевого продукта чаще всего < 1,5%. Большое влияние на фильтрационные характеристики к.ж. оказывают условия проведения биосинтеза: Состав и качество сырья. Например: применение соевой муки, гидрола снижает скорость фильтрации. Содержание в жидкости непотребленных питательных веществ. Значительные количества непотребленных питательных веществ замедляют фильтрацию. Наличие в жидкости жиров. Применение жиров как пеногасителей на последних этапах ферментации также значительно ухудшает фильтрационные характеристики к.ж. 4.Длительность процесса биосинтеза. Большое значение для фильтрации биомассы имеет правильный выбор момента прекращения процесса, который должен завершаться до наступления автолиза, т.к. фильтрация автолизированной к.ж., содержащей продукты распада клеток, протекает плохо. Фильтруемость к.ж. определяется содержанием взвешенных веществ, характером осадка и т.д. Характер осадка зависит от используемого продуцента. 1. К.ж., получаемые при культивировании грибов (пенициллин), содержащие сравнительно грубодисперсный мицелий, который, как правило, легко отделяется при фильтрации, такие жидкости обычно не требуют спец. обработки для улучшения фильтрации. 2. К.ж., получаемые при культивировании актиномицетов (стрептомицин, тетрациклины, эритромицин и т.д.), как правило, содержат липкий, слизистый мицелий. В жидкости наряду с крупными мицелиальными скоплениями присутствуют фракции тонкодисперсных белковых частиц, затрудняющих фильтрацию. Эти жидкости обычно подвергаются обработке для коагуляции белковых коллоидов. 3. К.ж., получаемые при культивировании бактерий (полимиксин, грамицидин), содержат довольно тонкую взвесь микробных тел, более однородную по степени дисперсности чем в случае актиномицетных жидкостей. 2. Предварительная обработка культуральной жидкости Технологическое назначение предварительной обработки и фильтрации к.ж. заключается: 1) в отделении нативного раствора от биомассы продуцента и взвешенных частиц; 2) в начальной очистке антибиотика, поскольку на стадии фильтрации отделяется большая часть примесей. Одной из основных задач предварительной обработки к.ж. является улучшение их фильтруемости. Для улучшения фильтрации к.ж. используются следующие способы (индивидуально для каждого антибиотика): 1.Кислотная коагуляция . Применяется в производстве антибиотиков, которые сравнительно устойчивы при низком значении pH (стрептомицин, тетрациклин и др.) Например, если требуется удалить ионы Са из раствора, коагуляция проводится щавелевой кислотой. 2.Обработка электролитами. Обработка высокомолекулярными полиэлектролитами – флоккулянтами (эритромицин). 3.Тепловая коагуляция используется для улучшения фильтрации к.ж. антибиотиков, которые не разрушаются при нагревании в водной среде (стрептомицин). При разработке методов коагуляции жидкостей стремятся, помимо улучшения фильтрационных свойств, добиться также соответствующей очистки нативных растворов: удаления Ca, Mg, белковых примесей, вызывающих эмульгирование при экстракции. 4.Применение фильтрующих добавок – мелкоизмельченных пористых материалов, которые наносятся на фильтр и благодаря высокой проницаемости увеличивают скорость фильтрации. Иногда порошки добавляют прямо в к. ж. перед фильтрацией в качестве структурных наполнителей, увеличивающих пористость слоя мицелия на фильтре. 3.Фильтрация культуральной жидкости. Мембранная фильтрация. Для отделения биомассы используются фильтры периодического и непрерывного действия. По характеру движущей силы фильтрующие аппараты делятся на работающие под давлением и работающие под вакуумом. Нативный раствор подается вакуумным насосом в сборники. Для процесса фильтрации применяют фильтрующие аппараты: фильтр-прессы (для больших объемов, процесс идет под давлением), нутч-фильтры и друк-фильтры (для небольших объемов соответственно под вакуумом и давлением), центрифуги (15000 об/мин), сепараторы (скорость вращения барабана 7000-7500 об/мин). Мембранная фильтрация может применяться для извлечения и очистки различных антибиотиков. Различают следующие виды мембранной фильтрации. 1 Обратный осмос- используется наиболее плотная мембрана. Через нее способны проходить только молекулы воды. 2 Нанофильтрация-через мембраны проходят малые ионы. 3 Ультрафильтрация - проходят соли, сахара, орг. к-ты, низкомолекулярные пептиды. Удерживаются белки, жиры, полисахариды. 4 Микрофильтрация - удерживаются взвешенные частицы, бактерии, споры, глобулы жира. Лекция № 4 Выделение и химическая очистка антибиотиков. План лекции 1. Цели химической очистки антибиотиков. 2. Методы химической очистки антибиотиков. 1. Цели химической очистки антибиотиков Эта стадия включает ряд процессов: от обработки нативного раствора (а иногда нефильтрованной к. ж. или содержащей антибиотик биомассы) до сушки очищенного препарата. Цели химической очистки – извлечение антибиотика из нативного раствора или из клеток, его концентрирование и очистка от примесей. Примесями являются как компоненты питательной среды, не полностью потребленные микроорганизмами, так и продукты их жизнедеятельности, а так же вещества, образовавшиеся при стерилизации среды, тепловой коагуляции и т.д. По химической природе примеси чрезвычайно разнообразны: неорганические соли, углеводы, жиры, белки и др. органические соединения, продукты их распада, окисления. В процессе очистки происходит концентрирование антибиотиков от 1% в начале стадии до 20-30% в конце. 2. Методы химической очистки антибиотиков Для извлечения антибиотиков используют различные методы в зависимости от их локализации. Выделение антибиотиков из жидкой фазы (нативного раствора) производят с помощью экстракции, ионообменной сорбции и осаждения в виде нерастворимого соединения. Выделение антибиотиков из твердой фазы (биомассы) производят путем экстракции органическими растворителями (полиеновые антибиотики, например, нистатин). 2.1 Экстракционный метод, или метод замены растворителей получил промышленное применение в производстве пенициллина, эритромицина, тетрациклина. Этот метод основан на различной растворимости разных химических форм антибиотика в воде и органических растворителях, не смешивающихся с водой. Например, пенициллин в форме кислоты более растворим в органических растворителях при малой растворимости в воде. Соли пенициллина со щелочными металлами, наоборот, очень хорошо растворимы в воде. Перевод пенициллина из солевой формыв кислотную и наоборот достигается изменением рН раствора. В процессе экстракции одновременно с концентрированием антибиотика происходит его очистка, так как только некоторые примеси переходят из исходного раствора в экстракт. Однако достаточная степень освобождения от примесей достигается при многократном переводе антибиотика из одного растворителя в другой. В производстве пенициллина осуществляется 4 последовательные экстракции:1-я бутилацетатная экстракция, бикарбонатная экстракция, 2- бутилацетатная экстракция, выделение бензилпенициллина из бутилацетатного экстракта в виде концентрированного водного раствора соли с последующим упариванием воды с бутанолом под вакуумом, что приводит к кристаллизации соли из бутилового спирта. 2.2 Метод ионообменной сорбции Другим распространенным методом химической очистки антибиотиков является метод ионообменной сорбции. Этот метод удобен для выделения антибиотиков, имеющих характер основания (например, стрептомицина, канамицина). Метод основан на применении ионообменных смол – искусственных полимеров объемной структуры, имеющих функциональные группы (карбоксил – СОО-Н+, сульфогруппа SO3 – H+), способные к электролитической диссоциации и обмену ионов. Изменяя физико-химические условия: pH среды, ее солевой состав, температуру и т.д., можно в известных пределах как бы «вталкивать» в ионит определенные ионы, концентрировать их в нем, а, изменив условия, «извлекать». Процесс поглощения ионов называется сорбцией, а их извлечения – десорбцией (элюцией). Поскольку многие антибиотики, будучи кислотами, основаниями или амфотерными соединениями, в водной среде образуют ионы, они также могут удерживаться (сорбироваться) ионообменными смолами. Уже после однократного проведения адсорбции – десорбции антибиотиков получают значительно очищенные и сконцентрированные растворы (элюаты). Пример: выделение и очищение канамицина. 2.3 Метод осаждения Третий основной метод выделения антибиотиков из нативных растворов – метод осаждение – нашел распространение в производстве тетрациклинов. Осаждение – метод отделения вещества в растворе от жидкости в результате образования нерастворимого осадка. В основе метода осаждения лежит способность антибиотиков образовывать с неорганическими, а также органическими ионами и целыми молекулами комплексы, выпадающие при определенных условиях в осадок. Например: нерастворимые комплексы образуются при взаимодействии тетрациклинов с ионами Ca, Mg в щелочной среде. Выпавший осадок отделяется от обработанного нативного раствора фильтрованием. Затем комплекс подвергают разложению, и выделившийся антибиотик извлекают из смеси путем экстрагирования или кристаллизации. Кристаллизация антибиотиков, как и других веществ, основана на резком уменьшении их растворимости в результате изменения температуры раствора или благодаря переводу антибиотиков в другую (плохо растворимую) химическую форму. Кристаллизация является не только способом получения антибиотика в твердом виде, но и средством его очистки. Лекция № 5 Стадия получения готовой продукции. План лекции Процессы сушки в производстве антибиотиков Дозировка, фасовка, упаковка и оформление готовой продукции. Контроль качества готового продукта. Системы GMP и GLP в связи с качеством антибиотических препаратов. 1.Процессы сушки в производстве антибиотиков После выделения и химической очистки антибиотика, его высушивают – удаляют из полученного препарата свободную и связанную воду. Поскольку большинство антибиотиков термолабильны, для их высушивания необходимо применять методы, не приводящие к потере биологической активности и не изменяющих цвета препарата. Существуют разные методы обезвоживания препаратов: Лиофильная сушка антибиотиков - высушивание предварительно замороженных растворов антибиотиков под вакуумом. Этот метод широко распространен в пищевой и химико-фармацевтической промышленности - сушка плазмы, эндокринных препаратов, фруктовых соков и т.д. Концентрат антибиотика, предварительно профильтрованный через специальные фильтры для освобождения от бактериальных загрязнений, разливают во флаконы, и затем замораживают в холодильных камерах при температуре – 45-60 оС в течение 2-4 часов в зависимости от дозировки. Затем кассеты с флаконами помещают в вакуум-сушильные шкафы. Температура регулируется подачей горячей воды в полки шкафа. Влага конденсируется в конденсаторах, охлаждаемых рассолом или специальной охладительной смесью. Весь процесс протекает в асептических условиях. Первый период сушки растворов антибиотиков методом сублимации льда в вакууме проводят в условиях низких температур материала в пределах – 8-12 оС. В период падающей скорости сушки температура материала приближается постепенно к температуре окружающей среды, и процесс сушки считается законченным, когда эти температуры примерно будут одинаковыми. Сушильные шкафы, используемые в методе, обеспечивают высокую герметичность (доступность осмотра и исправление неисправностей). В производстве антибиотиков, где необходимо соблюдать стерильные условия, обычно применяются малогабаритные прямоугольные сушильные шкафы относительно невысокой производительности. Сушка растворов антибиотиков методом сублимации имеет следующие преимущества. Высушенный препарат сохраняет все первоначальные свойства, не теряют биологической активности. Оборудование для сушки этим методом малогабаритно. Вторым методом является распыление растворов в потоке нагретого воздуха – высушивание с применением распылительной сушилки. Этот метод используется при работе с большими количествами антибиотика. Раствор антибиотика пневматически распыляется до мельчайших капель в камере потоком нагретого воздуха. Преимущества метода: процесс высушивания антибиотика протекает в течение нескольких секунд, при этом даже термолабильные препараты не меняют своих свойств; возможность варьирования технологического режима, несложность обслуживания установки. Выгрузка порошка производится в стерильных условиях с использованием специальных камер типа боксов. Метод взвешенного слоя или сушки в вакуум-сушильных шкафах. Наиболее эффективным методом сушки для зернистых и пастообразных материалов является сушка во взвешенном слое в вакуум-сушильных шкафах. По режиму работы сушильные установки делят на 3 группы: установки непрерывного, периодического и полунепрерывного действия. Наиболее широкое применение в промышленности получили непрерывно действующие сушильные установки. 2. Дозировка, фасовка, упаковка и оформление готовой продукции Выделенные и очищенные антибиотики представляют собой полупродукты для получения лекарственных форм и подвергаются дополнительной обработке. В случае получения инъекционной лекарственной формы – порошка во флаконах фасовка и оформление готовой продукции являются заключительными операциями в цикле технологического процесса производства. Инъекционные препараты (например, бензилпенициллина натриевая соль) выпускаются во флаконах емкостью 10-15 см3, укупоренных пробками. Пробки накрываются алюминиевыми колпачками (которые после обработки прижимают пробку к плоскости венчика флакона). Такая упаковка должна обеспечивать сохранение стерильности антибиотика и его качество на протяжении всего срока годности. Технологический процесс расфасовки и оформления готовой продукции состоит из следующих основных стадий: подготовка флаконов, пробок и колпачков; дозировка порошка во флаконы, их укупорка, просмотр, стерилизация; этикетирование флаконов, укладка в коробки, оформление готовой продукции. Дозирование порошка во флаконы производится на автоматах, которые в одном агрегате совмещают операции дозирования, укупорки и закатки. Закатанные флаконы выходят на загрузочный транспортер, собираясь в кассеты у входа в стерилизатор. Кассеты с инъекционным препаратом во флаконе проходят в стерилизаторе 3 зоны: основной нагрев, 1 зона, 2 зона, 3 зона (охлаждения). Температура стерилизации 160 оС. На выходе из стерилизатора флакон с инъекционным препаратом имеет температуру 30 оС. Перед маркировкой производят визуальный просмотр флаконов с расфасованным в них антибиотиком. После отбраковки, хорошие флаконы поступают на маркировку. На флаконе указывают завод-изготовитель, наименование антибиотика, дозировку, номер серии, срок годности. Флаконы с расфасованным антибиотиком укладываются в коробку по 50 штук, упаковываются и передаются на склад. 3.Контроль качества готового продукта Готовый продукт подвергается тщательному микробиологическому и фармакологическому контролю. Методы микробиологического контроля лекарственных средств: Испытание на стерильность (Контроль стерильности). Испытание на микробиологическую чистоту. Определение антимикробной активности антибиотиков методом диффузии в агар. Испытание на стерильность. Лекарственные средства для инъекций, глазные капли, мази, пленки, др. лекарственные средства, в отношении которых имеются соответствующие указания в НТД, должны быть стерильными. Стерильность лекарственных средств достигается соблюдением необходимых санитарно-гигиенических условий их изготовления и режима стерилизации. Стерильность готового препарата определяется как правило 2 методами: методом прямого посева и методом мембранной фильтрации. Лекарственные средства (таблетки, капсулы, гранулы, растворы, экстракты, сиропы, мази и др.), не стерилизуемые в процессе производства, могут быть контаминированы м/о и поэтому должны быть испытаны на микробиологическую чистоту. Испытание на микробиологическую чистоту включает количественное определение жизнеспособных бактерий и грибов, а также выявление определенных видов м/о, наличие которых недопустимо в нестерильных лекарственных средствах: бактерий семейства Enterobacteriaceae, PseudomonasaeruginosaиStaph. aureus. Испытание проводят в асептических условиях. К антибиотикам предъявляются строгие фармакологические требования. К этим требованиям относятся испытания на токсичность и пирогенность. Испытание на токсичность. Антибиотики и их лекарственные формы исследуются на токсичность для определения степени чистоты препарата. Препарат изучают на разных видах животных в отношении его острой и хронической (т.е. токсичность при многократном, повторном введении) токсичности (влияние на кровь, ЦНС, дыхание). Устанавливают максимально переносимую дозу (МПД), дозу, вызывающую гибель 50% ЛД 50 подопытных животных (мыши) и смертельную дозу ЛД 100. Испытания на токсичность проводят на белых мышах. Раствор препарата вводят в хвостовую вену мыши. Наблюдение за животными ведут в течение 48 ч. Препарат считают выдержавшим испытание, если в течение срока наблюдения не погибла ни одна мышь. Испытание на пирогенность Специальное требование, предъявляемое к парентерально (внутривенно, внутримышечного, подкожное) вводимым в организм растворам, состоит в том, что они не должны содержать пирогенов; практически это означает, что растворы не должны вызывать повышение температуры при введении их подопытному животному по определенной схеме. Этими компонентами могут быть жизнеспособные м/о, но обычно ими являются сложные химические соединения, образующиеся в результате бактериального метаболизма, происходящего до проведения стерилизации. 4.Системы GMP и GLP в связи с качеством антибиотических препаратов GLP- GoodLaboratoryPractice- система требований к лекарственным средствам для предклинических испытаний. В США система действует с июня 1979 г. На систему опираются в случае испытания веществ на микробную обсемененность, на пирогенность, токсичность и т.д. Одобренный препарат после лабороторных предклинических испытаний по системе GLP и последующей клинической прверки разрешается к выпуску в условиях промышленного производства. GMP- GoodManufacturingPractice- правила производства лекарственных средств. Первые правила GMP появились в Европе и США в начале 60-х г. В России в 2004г. Госстандартом России утвержден национальный стандарт ГОСТ Р 52249-2004» Правила производства и контроля качества лекарственных средств». Стандарт является переводом Правил GMP ЕС. ГОСТ содержит 9 основных требований и 18 приложений. Основные требования 1. Управление качеством 2. Персонал 3. Помещения и оборудование 4. Документация 5. Производство 6. Контроль качества 7. Контракты на производство продукции и проведение анализов 8. Рекламации и отзыв продукции 9. Самоконтроль Цель введения GMP- гарантия качества продукции. Качество обеспечивается технологией и организацией производства. |