Биотех. Лекция (Слайд 1) Основы технологии производства антибиотиков, пробиотиков, ферментов и витаминов
 Скачать 254.5 Kb.
|
|
Выпускаются Пробиотики на основе метаболитов B. Subtilis. В составе данных препаратов, помимо собственно бактерий-антагонистов, содержатся также различные биологически активные вещества (БАВ), являющиеся продуктами метаболизма этих базовых (производственных) штаммов микробов при их росте, развитии и размножении на плотных и в жидких питательных средах, используемых для накопления биомассы. В числе таких метаболитов могут идентифицироваться различные БАВ: бактериоцины, антибиотикоподобные субстанции и, даже, антибиотики, аминокислоты, ферменты, пептиды и полипептиды, полисахариды, витамины и провитамины, нуклеотиды и др. Бактерии B. Subtilis (кроме B.anthracis и B.cereus), и что важно их метаболиты, как правило, являются безвредными для организма животных даже в высоких концентрациях. К пробиотикам на основе метаболитов бактерий рода B. Subtilis относят: бактистатин, бион, хилак форте, биоспорин, бактерин-СЛ, биоплюс. (Слайд 27) Пример привести. Бактистатин относится к этому классу препаратов, в частности, к метаболитным пробиотикам. Это комбинированный пробиотический препарат, имеющий многокомпонентный состав, включающий метаболиты B.subtilis штамм ТПИ 13, иммобилизованные на природном ионообменнике цеолите, в смеси с питательным компонентом – гидролизатом соевой муки и аэросилом. (Слайд 28) Так же пробиотические препараты разделяются по количеству и соотношению штаммов микроорганизмов.
(Слайд 29) Перейдем к рассмотрению какие же микроорганизмы используют при производстве молочнокислых продуктов. Кисломолочные продукты (таки как сметана, простокваша, кефир, различные йогурты и т.д.) в питании люди стали использовать очень давно. Многие кисломолочные продукты наряду с молочной кислотой содержат специфические антибиотические вещества, подавляющие вредную микрофлору кишечника, в том числе и возбудителя туберкулёза. Причём, подобным действием обладают молочнокислые продукты, полученные с использованием ацидофильных бактерий, которые, как известно, являются сильнейшими антагонистами гнилостной микрофлоры и, что очень важно, приживаются в кишечнике как типичные его представители. Кисломолочные продукты широко применяются как для лечебного питания, для лечения людей и животных при ряде заболеваний. Так, например, кумыс, ацидофильно-дрожжевое молоко применяются при лечении туберкулёза. Ацидофильное молоко, простокваша, ацидофильная паста применяются как лечебно-диетические продукты при ряде ЖК заболеваний. Эти же кисломолочные продукты могут быть использованы и для лечения животных, особенно молодняка, при различных ЖК заболеваниях. Кроме того, для лечения молодняка животных, заболевших с признаками кишечных расстройств, применяются чистые ацидофильно-бульонные культуры (АБК), для людей и животных препараты биобактон, лактобактерин, бифидобактерин и другие чистые культуры молочнокислых микробов. Особенно важным является применение молочнокислых микробов на фоне интенсивного лечения людей и животных антибиотиками. Как известно, антибиотики в большинстве своём не имеют избирательного действия на микробы. Наряду с возбудителями заболеваний они вызывают гибель и другой, в том числе и нормальной микрофлоры кишечника. В ряде случаев это приводит к дисбактериозам, а иногда и к заболеваниям типа кандидомикоза и других. Применение же молочнокислых бактерий даёт возможность восстановить нормальную микрофлору кишечника. (Слайд 30) В настоящее время установлено, что наряду с молочной кислотой, молочнокислые бактерии способны продуцировать другие антибиотические вещества, подавляющие рост гнилостных и других нежелательных, кишечных микроорганизмов. Так, Str. lactis образуют антибиотик низин, Str. cremoris – образует антибиотик диплококкцин, и.т.д. Lbm. plantarum - лактолин. A Lbm. acidophilum продуцирует антибиотические вещества, подавляющие рост не только кишечной палочки, но и всех гнилостных бактерий, а также возбудителей дизентерии, брюшного тифа, сальмонеллёза. Некоторые молочнокислые бактерии обладают способностью расщеплять молочный жир. Но эта способность проявляется при высоких концентрациях клеток и длительной выдержки посевов. Кроме того, следует иметь в виду, что кисломолочные продукты содержат разнообразные витамины, особенно жирорастворимые А, Д, Е, накапливающиеся в результате жизнедеятельности молочнокислых бактерий. Они также богаты солями кальциями, фосфора, магния, входящими в состав костей и других тканей организма человека и животных. (Слайд 31) Продукты смешанного молочнокислого и спиртового брожения (кумыс, кефир, айран) содержат молочную кислоту, углекислоту, следы спирта (до 0,4-0,6 %), которые вызывают сильное сокоотделение пищеварительными железами, что улучшает процесс пищеварения и усвоения человеком пищи или корма животными. (Слайд 32) Производство пробиотиков. Селекция молочнокислых бактерий Выделяют молочнокислые бактерии из природных источников. Для каждого вида молочнокислых бактерий выделены наиболее подходящие источники выделения и разработаны методики изучения их свойств. Сырое молоко и молочные продукты издавна используются как источники выделения молочнокислых бактерий. Но молоко не является первоисточником этих бактерий. Обычно в молоко они попадают в процессе его получения с поверхности вымени, из сосковых канальцев, с частичками кала, навоза, корма, травы, почвы, из доильной посуды, из воздуха и т. д. При хранении и транспортировке наблюдается их размножение. Молочнокислые бактерии постоянно встречаются в почве, на растениях (цветах, листьях, стеблях, корневой системе). Чаще они сосредотачиваются в прикорневой зоне растений, а затем поднимаются на их надземную часть. Культурные растения обсеменены молочнокислыми бактериями больше, чем дикие. Обсеменённость растений зависит от фазы их развития, погодных условий и времени года. Впервые выделил молочнокислые бактерии из природных источников растительного происхождения и изучил их свойства В. М. Богданов (1959). Это послужило началом широкого использования этих источников для получения производственно-полезных штаммов молочнокислых бактерий. (Слайд 33) Питательные среды для молочнокислых бактерий и технология их получения Для селекции молочнокислых бактерий очень важным является правильный выбор питательных сред и условий культивирования. Чаще всего для выделения молочнокислых бактерий из природных источников используют стерильное обезжиренное молоко. При культивировании гетероферментативных молочнокислых бактерий, для которых характерно сбраживание солей лимонной кислоты, в питательные среды добавляются лимоннокислый натрий (1 %), а в отдельных случаях и дрожжевой гидролизат (2%). На таких же средах осуществляют культивирование молочнокислых бактерий с целью получения заквасок для производства различных молочнокислых продуктов - творога, сметаны, йогурта, простокваши и др. Кроме обезжиренного молока, для культивирования молочнокислых бактерий в промышленных условиях с целью получения препаратов, используемых в медицине и ветеринарии, применяют гидролизованное молоко. Пример. Для приготовления из гидролизата молока (срок хранения 1 - 2 недели) питательной среды его разводят деминерализованной водой в отношении 1:1, 1:2, устанавливают рН 6,8 - 7,0. При необходимости вводят различные добавки. Питательную среду стерилизуют при более мягком режиме (110°С в течение 30 минут). Это делается для предотвращения образования в среде белково-сахарных комплексов, отрицательно влияющих на рост молочнокислых бактерий. (Слайд 34) Производство бифидумбактерина Бифидумбактерин представляет собой лиофилизорованную микробную массу живых бифидобактерий. Бифидобактерии являются антагонистами для патогенной кишечной микрофлоры. Бифидумбактерин предназначен для лечения и профилактики дисбактериозов различной этиологии у детей и взрослых. По внешнему виду препарат представляет собой кристаллическую или пористую массу бежевого или беловато-серого цвета. В состав препарата входят сахароза и желатин, которые являются компонентами стабилизирующей среды высушивания. Препарат выпускают в виде сухой биомассы, лиофилизированной в ампулах (флаконах). Массовая доля влаги сухого препарата должна быть не более 3,5 %. Препарат не должен содержать посторонних микроорганизмов. Все работы, связанные с пересевом, разведением, определением физико-химических характеристик бифидумбактерина, требуют соблюдения стерильности и проводятся с соблюдением правил асептики в вытяжных шкафах или на лабораторных столах над кюветами, на дно которых помещены коврики, смоченные 10 %-ным раствором перекиси водорода. Технология производства бифидумбактерина включает стадии; приготовление питательных сред, выращивание посевного материала, культивирование, сублимационное высушивание, приготовление лекарственных форм, контроль готового препарата. 1 .Приготовление питательных сред. Для культивирования бифидобактерий готовится питательная среда на основе гидролизата обезжиренного молока. Срок хранения среды не более 72 часов при температуре (20 ± 5)°С. 2.Стадия выращивания посевного материала. ч Посевы бифидобактерий инкубируют при температуре (38 + 1)°С в течение (60 ±12) часов. 3 .Культивирование. На стадии технологического процесса культивирования идет получение биомассы в ферментаторе типа БИОР-0Д (0,25). Засев питательной среды проводят бифидобактериями 2 - 3-ей генерации из двух бутылей через линию ввода добавок. После этого проводят контроль биомассы. Затем готовят среду высушивания (сахароза, желатин) и вводят в ферментер. 4.Сублимационное высушивание биомассы. После окончания процесса высушивания производится запайка ампул. 5. Получение готовой лекарственной формы. Пятой стадией является маркировка и упаковка препарата. В помещении контроля производят проверку герметичности ампул и визуальный контроль. Контроль герметичности проводят в специальном аппарате с подкрашенной водой, в котором создается давление. 6. Контроль готового препарата. Шестой стадией технологического процесса является контроль готового препарата. Контроль препарата осуществляется по следующим показателям: физические свойства, внешний вид, количество, отсутствие посторонней микрофлоры, количество живых бифидобактеий в одной дозе препарата, активность кислотообразования, остаточная влажность, рН, герметичность. (Слайд 35), (Слайд 36) Технология производства лактобактерина. (рассказать) (Слайд 37) Производство Биод -5 Биод -5 - пробиотик нового поколения, разработанный на основе ассоциации двух штаммов аэробных непатогенных спорообразующих бактерий B.subtilis ТПИ 13 и B.licheniformis ТПИ 11. Микробы рода Bacillus распространены во внешней среде и обладают более выраженными полезными биологическими свойствами (прежде всего, антагонистической активностью и ее спектром) по сравнению с бифидо-, коли- и лактобактериями. с добавлением сахарозо-желатиновой среды и молока сухого обезжиренного. Технология предусматривает раздельное культивирование бактерий В. Subtilisи B.Licheniformis. Смешивание их осуществляется после стадии концетрирования перед высушиванием. Схема технологического процесса Приготовление гидролизата казеина Приготовление среды Гаузе № 2 Приготовление питательной среды Приготовление посевного материала Процесс культивирования Концентрирование микробной суспензии Приготовление жидкой рецептурной массы и розлив ее в ампулы Лиофильное высушивание, герметизация ампул (флаконов) Маркировка, упаковка и хранение препарата      (Слайд 38) . Показать упаковки пробиотических препаратов. (Слайд 39) Особое место в современной биотехнологии занимает биотехнология микробных ферментов - область, которая охватывает круг вопросов от отбора и селекции микроорганизмов-продуцентов ферментов, их биосинтеза, методов выделения ферментов до получения и производственного использования ферментных препаратов. Ферменты - это органические вещества белковой природы, которые синтезируются в клетках и во много раз ускоряют протекающие в них реакции, не подвергаясь при этом химическим превращениям. Ферменты (от латинского fermentum - брожение, закваска) иногда называют энзимами ( от греческого en - внутри, zyme - закваска). (Слайд 40) Основные источники ферментов - ткани и органы животных, растения и микроорганизмы. Преимущество микроорганизмов как источников ферментов в том, что они быстро растут на дешевых питательных средах и синтезируют большое количество разных ферментов. Выделенные из природных источников микроорганизмы синтезируют одновременно комплекс различных ферментов, а мутантные штаммы способны продуцировать только какой-нибудь один промышленно важный фермент, причем в больших количествах. В России расширяется выпуск ферментов разных наименований. Основными сферами их использования являются пищевая, мясная, текстильная и кожевенная промышленность, а также сельское хозяйство. Применение ферментных препаратов в указанных отраслях промышленности во много раз ускоряет производственные процессы, обеспечивает более экономичное использование сельскохозяйственного сырья, увеличивает выход из него продукции высокого качества. При этом достигается существенное снижение себестоимости продукции и улучшение показателей использования основных фондов и оборотных средств. Так, например, обработка ферментными препаратами мяса позволяет увеличить выход высших сортов с 13-15 до 25-27 % от его общего веса. Добавка ферментных препаратов в корма в количестве 0,01-0,03% от сухого вещества рациона увеличивает привесы скота на 5-10% и птицы на 10-20%. Затраты кормов на получение единицы привеса снижаются при этом на 6-12%, и повышается калорийность мяса. Переходим к рассмотрению получения ферментных препаратов (Слайд 41) Первый этап при выборе продуцентов ферментов, как и других биологически активных веществ - скрининг из природных источников (образцов почв, воды, различных биоматериалов) и (или) коллекционных штаммов. Существует Три вида посевного материала микроорганизмов - продуцентов ферментов 1.В виде культуры гриба 2. В виде мицелия 3. В виде спор Скрининг продуцентов проводится в два этапа. На первом этапе выделяют микроорганизмы, которые потенциально обладают полезными свойствами. Для этого необходимы быстрые, достаточно чувствительные и недорогие методы. За первичным скринингом следует вторичный, в результате которого отбирают микроорганизмы, характеризующиеся достаточным уровнем биосинтеза нужного фермента. Отбор осуществляется различными методами. Исследования по отбору и целенаправленной селекции продуцентов играют важную роль в создании технологического процесса получения высокоочищенных ферментов. Получение штамма, синтезирующего в основном целевой продукт, в значительной мере упрощает схему дальнейшего выделения и очистки фермента. (Слайд 42) Субстраты, используемые при культивировании продуцентов ферментов (на твердых питатетельных средах) 1. Пшеничные отруби ( 20-25% крахмала, 12% белков, 10-15% клетчатка, 13% влаги) 2. Свекловичный жом (20-30% клетчатки) 3. Солодовые ростки – корешки проросшего ячменя ( витамины и аминокислоты) 4. Древесные опилки – разрыхлитель 5. Шелуха сельскохозяйственных культур (рис, гречиха, подсолнух) (Слайд 43) Схема получения посевного материала в виде культуры гриба (Слайд 44) Схема получения посевного материала в виде мицелия (Слайд 45) Получение посевного материала в виде спор (Слайд 46) Технология переработки культуральной жидкости при производстве ферментов Основы культивирования продуцентов ферментов. Важную роль в биосинтезе ферментов играют условия культивирования продуцентов, в первую очередь кислотность среды условия аэрации, температура. Имеется ряд работ, в которых указывается на возможность регуляции биосинтеза целевого фермента в зависимости от рН среды культивирования. Описывается преимущественный биосинтез кислотоустойчивой глюкоамилазы Aspergillus awamori при одновременном ингибировании синтеза других амилолитических ферментов. С понижением рН среды усиливается биосинтез кислотоустойчивого компонента амилолитического комплекса у грибов рода Aspergillus и Rhyzopus. путем строгого регулирования рН можно изменять состав пектолитического комплекса Clostridium pectinofermentas. Продуценты бетта-галактозидазы наиболее интенсивно синтезируют фермент в кислой среде. Практически все современные ферментеры предусматривают возможность достаточно строгого контролирования и регулирования рН в заданном интервале, что свидетельствует о важности данного параметра для биосинтеза (целевого) фермента. Продуценты ферментов, относящиеся к строгим анаэробам, требуют полностью бескислородных условий культивирования и очень богатых, полноценных сред. |