МФА_7_ВЭЖХ. Методы фармакопейного анализа Высокоэффективная жидкостная хроматография (вэжх)
 Скачать 0.88 Mb.
|
|
Методы фармакопейного анализа Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) ОФС.1.2.1.2.0005.15 ВЭЖХ Метод колоночной хроматографии, в котором подвижной фазой служит жидкость, движущаяся через хроматографическую колонку, заполненную неподвижной фазой. Способ разделения, препаративного выделения и проведения качественного и количественного анализа нелетучих термолабильных соединений как с малой, так и с большой молекулярной массой. ВЭЖХ В зависимости от механизма разделения Адсорбционная Распределительная Ионообменная Эксклюзионная Хиральная Разделение происходит за счет различной способности веществ адсорбироваться и десорбироваться с поверхности сорбента Разделение происходит за счет различия коэффициентов распределения между неподвижной и подвижной фазами Разделение происходит за счет различной силы взаимодействия определяемых ионов с ионными группами сорбента Разделение происходит за счет различной способности молекул веществ проникать в поры неподвижной фазы (разделение по размеру) Разделение оптически активных соединений на отдельные энантиомеры ВЭЖХ В зависимости от типа подвижной и неподвижной фазы Нормально-фазовая Обращенно-фазовая Неподвижная фаза – полярная (силикагель или силикагель с привитыми NH 2 - и CN- группами), подвижная фаза – неполярная (гексан, гексан+хлороформ, гексан+спирты и др.) Удерживание веществ растет с увеличением их полярности. Элюирующая способность подвижной фазы увеличивается с увеличением полярности. Неподвижная фаза – неполярная (гидрофобные силикагели с привитыми группами С4, С8, С18 и др.), подвижная фаза – полярная (вода+полярные растворители: ацетонитрил, метанол, тетрагидрофуран и др.). Удерживание веществ растет с увеличением их гидрофобности (неполярности). Элюирующая способность подвижной фазы увеличивается с увеличением содержания органического растворителя. Оборудование • Узел подготовки подвижной фазы (емкости с подвижной фазой и система дегазации); • Насосная система; • Смеситель подвижной фазы; • Система ввода пробы (инжектор); • Хроматографическая колонка; • Термостат; • Детектор; • Система управления хроматографом, сбора и обработки данных Режимы хроматографирования Изократический режим – на протяжении всего хроматографического процесса состав подвижной фазы и параметры хроматографирования остаются постоянными Градиентный режим – состав подвижной фазы и параметры хроматографирования меняются в ходе анализа Хроматографическая колонка Трубка из нержавеющей стали, стекла или пластика, заполненная сорбентом и закрытая с обеих сторон фильтрами. Длина – 5-60 см Внутренний диаметр – 2-10 мм Неподвижная фаза силикагель, оксид алюминия (нормально-фазовая хроматография, механизм - адсорбция); силикагель, смолы, полимеры с привитыми кислотными и основными группами (ионообменная и ионная хроматография); силикагель или полимеры с заданным распределением размеров пор (эксклюзионная хроматография); химически модифицированные сорбенты (механизм – адсорбция или распределение между подвижной и неподвижной фазами); химически модифицированные хиральные сорбенты (хиральная хроматография) Детекторы Спектрофотометрические (оптическая плотность элюата измеряется в специальной микрокювете при выбранной длине волны); Флуориметрические (для определения флуоресцирующих соединений, принцип действия основан на измерении флуоресцентного излучения поглощенного света); Рефрактометрические (для соединений, слабопоглощающих в УФ и видимой областях спектра, низкая чувствительность, невозможность использовать в градиентном режиме); Испарительные детекторы лазерного светового рассеяния (принцип работы основан на различии давления паров растворителей, входящих в состав подвижной фазы и анализируемых веществ) Амперометрические (для определения электроактивных соединений, которые могут быть окислены или восстановлены на поверхности твердого электрода); Кондуктометрические (для детектирования анионов и катионов в ионной хроматографии, принцип работы основан на измерении электропроводности подвижной фазы в процессе элюирования); Масс-спектрометрические (высокая чувствительность). Детекторы Условия хроматографирования, подлежащие указанию в нормативной документации размеры колонки (длина и внутренний диаметр); типы сорбента (с указание размера частиц); температура колонки; объем вводимой пробы; состав подвижной фазы и способ ее приготовления; скорость подачи подвижной фазы; тип и условия детектирования; описание градиентного режима; время хроматографирования; подробное описание методики; формулы расчета; описание приготовления стандартных и испытуемых растворов. Модифицированные виды ВЭЖХ 1. Ион-парная хроматография. Разновидность обращенно-фазовой хроматографии, позволяет определить ионизированные соединения. В составе подвижной фазы имеются гидрофобные органические соединения с ионогенными группами (ион парные реагенты) 2. Хроматография гидрофильного взаимодействия. Используется для разделения полярных соединений, слабо удерживаемых в обращенно-фазовой ВЭЖХ. Подвижная фаза – водно-ацетонитрильные смеси с добавлением солей, кислот или оснований. Неподвижная фаза – силикагели, модифицированные полярными группами 3. Ионообменная и ионная ВЭЖХ Разделение основано на обратимом взаимодействии ионов определяемого вещества с ионогенными группами сорбента (катиониты и аниониты). Подвижная фаза – водные растворы кислот, оснований и солей. Ионная хроматография – вариант ионообменной хроматографии, в котором используется кондуктометрический детектор. 4. Эксклюзионная ВЭЖХ Гель-хроматография, разделение молекул по их размерам. 5. Ионо-эксклюзионная хроматография. Соединения в ионизированной форме не удерживаются на сорбенте- ионообменнике, соединения в молекулярной форме удерживаются внутри пор ионообменного сорбента. Модифицированные виды ВЭЖХ 6. Хиральная хроматография Разделение оптических изомеров. Неподвижная фаза – сорбенты с поверхностью, модифицированной веществами, имеющими хиральные центры (хитозаны, циклодекстрины, полисахариды) 7. Ультраэффективная жидкостная хроматография. Размер частиц сорбента – 1,5 – 2 мкм, размер колонки - 50-150 мм длина, 1-4 мм внутренний диаметр Модифицированные виды ВЭЖХ Применение ВЭЖХ Подлинность Посторонние примеси Растворение Однородность дозирования Количественное определение Вещество или вещества являются летучими соединениями? Да Нет ГХ ЖХ Газовая смесь имеет постоянный состав? Да Нет ГАХ ГЖХ Молекулярная масса разделяемых соединений больше 3000 Нет Да Вещества способны растворяться в полярных растворителях? Гель- хроматография Да Нет Прямофазная ЖХ Разделяемые компоненты слабые электролиты? Нет Да Ионные методы анализа Обращенно- фазовая ВЭЖХ Параметры удерживания в колоночной хроматографии Время удерживания вещества (t, мин, с) – время пребывания вещества в хроматографе. Время удерживания несорбируемого вещества – время пребывания несорбируемого вещества в хроматографе. Удерживаемый объем или объем удерживания компонента – объем элюента или газа-носителя, который проходит через хроматографическую колонку от момента ввода пробы до момента выхода максимальной концентрации компонента. Объем удерживания несорбируемого компонента – объем подвижной фазы, необходимый для элюирования несорбируемого компонента. Относительные параметры удерживания относительное время удерживания – отношение времени удерживания определяемого компонента ко времени удерживания вещества, принятого за стандарт: 𝒕 𝒓 ′ = 𝒕 𝒕 𝒔 относительный объем удерживания – отношение объема удерживания определяемого компонента к объему удерживания вещества, принятого за стандарт: 𝑽 𝒓 ′ = 𝑽 𝑽 𝒔 Относительные величины удерживания не зависят от количества сорбента в колонке, от ее объема, занятого подвижной фазой, перепада давления, от скорости подачи подвижной фазы и др. Они зависят от природы анализируемого вещества , от природы вещества-стандарта, сорбента и температуры колонки При установлении относительных параметров удерживания в качестве стандартных могут быть использованы различные вещества. Как правило, это соединения, относящиеся к этому же классу соединений, что и определяемое вещество, с известными значениями параметров удерживания. Относительные параметры удерживания Целесообразным является определение параметров удерживания относительно 2 стандартных веществ. Первый стандарт должен иметь меньшее, а второй – большее значение времени удерживания, чем анализируемое вещество. |