17. Методы исследования. Методы исследования
 Скачать 78.2 Kb.
|
|
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Основными методами изучения биологических микрообъектов являются световая и электронная микроскопия, которые широко используются в экспериментальной и клинической практике. Основными объектами исследования являются гистологические препараты, приготовленные из органов лабораторных животных (крыс, собак, кроликов и т.д.), реже из объектов, взятых во время оперативного вмешательства или от трупов людей. Изготовление гистологических препаратов складывается из следующих основных этапов: Взятие и фиксация биологических объектов; Промывка, обезвоживание и заливка биологических объектов; Приготовление срезов; Окрашивание и заключение срезов. 1 - взятие и фиксация биологических объектов. Главное требование: максимальное сокращение сроков взятия материала, минимальное травмирование тканей и создание оптимальных условий для фиксации. Для умерщвления лабораторных животных применяется наркоз, декапитация, электрический ток и т.д. Затем следует быстрое вскрытие животного, извлечение необходимых органов и тканей, из которых острым инструментом вырезают небольшие кусочки (5-10 мм3) и помещают их в фиксатор. Объем фиксатора должен превышать объем фиксируемого объекта в 20-40 раз. Фиксация предупреждает развитие посмертных изменений в тканях, прекращая в них биохимические процессы. В основе действия любого фиксатора лежат сложные физико-химические процессы, в первую очередь, коагуляция (свертывание) белков. В гистологической практике применяют различные фиксаторы: простые, содержащие один компонент (формалин, спирт, ацетон) и сложные, содержащие два и более компонентов (жидкость Карнуа: абсолютный спирт, хлороформ, ледяная уксусная кислота; жидкость Ценкера: двухромовокислый калий, сернокислый натрий, сулема, формалин, дистиллированная вода). 2 - промывание, обезвоживание и заливка биологических объектов. Для получения тонких срезов зафиксированные биологические объекты необходимо подготовить соответствующим образом: сделать его достаточно плотным, но не хрупким. После фиксации кусочки промывают под проточной водой в течение 12-24 часов для освобождения от излишков фиксатора. Для объектов, фиксированных в спирте или жидкости Карнуа, этот этап пропускают. После промывания объекты необходимо обезводить и уплотнить в спиртах возрастающей крепости, для чего последовательно используют 50, 60, 70, 90, 96 и 100о спирт. Далее кусочки просветляют, для чего их помещают сначала в смесь абсолютного спирта (100о) и О-ксилола (1:1), затем в две-три порции чистого О-ксилола. После просветления материал готов к пропитыванию в парафинах. Для этого объекты помещают в термостат сначала в кашицу (смесь равных частей О-ксилола и парафина) при температуре 37оС, а затем в две-три порции чистого парафина, расплавленного при температуре 56оС. Пропитанные парафином кусочки наклеивают на деревянные блоки. Подготовленные таким образом биологические объекты могут длительное время храниться на открытом воздухе. Для обработки твердых тканей (кости, зубы) сразу же после фиксации и промывки материала используют методику декальцинации при помощи 5-7% раствора азотной кислоты. По мере вымывания солей кальция под действием кислоты, твердые ткани становятся мягкими, при этом их гистологическая структура сохраняется за счет оставшихся органических веществ. После декальцинации необходимо повторно промыть кусочки под проточной водой, затем обезводить, просветлить и залить в парафин.
3 - приготовление гистологических срезов. Для приготовления срезов используют специальные приборы – микротомы. Их три типа: санный, ротационный и замораживающий. Санный микротом позволяет получать ступенчатые срезы, ротационный – серийные, замораживающий дает возможность получать срезы фиксированного и нефиксированного биологического материала без предварительной заливки в парафин. Все микротомы снабжены механизмом подачи микрообъекта и специальным микротомным ножом. Полученные парафиновые срезы наклеивают на предметное стекло, смазанное смесью белка с глицерином (1:1) и подсушивают на воздухе, либо в термостате при 37оС. Срезы, приготовленные на замораживающем микротоме помещают в чашку с дистиллированной водой, после чего сразу же окрашивают. 4 - окрашивание и заключение срезов. Окрашивание срезов применяется для того, чтобы отчетливо видеть под микроскопом строение органа, и основано на неодинаковом химическом составе тканевых структур. Для окрашивания применяется большое количество красителей. Все их можно разделить по происхождению: растительные (гематоксилин), животные (кармин), синтетические (эозин и др.); а также по химическим свойствам: кислые, основные, нейтральные. Способность структур окрашиваться основными красителями называется базофилией. В клетке базофильной структурой является ядро, содержащее нуклеиновые кислоты. К базофильным красителям относятся гематоксилин, кармин, тионин. Структуры, окрашивающиеся кислыми красителями, называются оксифильными, например, цитоплазма клеток. Кислыми красителями являются производные кислот или их соли (эозин, кислый фуксин). Нейтральные красители (трипановая синь, нейтральный красный). Существуют, кроме того, специфические красители. Например, эластические волокна окрашиваются орсеином в красно-коричневый цвет, резорцин-фуксином – в темно-синий, альдегид-фуксином – в темно-пурпурный. Жиры и жирорастворимые вещества в клетках окрашиваются суданом III в оранжевый цвет, осмий же окрашивает жиры в черный цвет. Для выявления элементов нервной системы применяется метод импрегнации азотнокислым серебром. Перед любым окрашиванием со срезов удаляют парафин, этот процесс называется депарафинизация. Для этого срезы последовательно проводят через три порции О-ксилола, спирты нисходящей крепости (от 100о до 70о), затем помещают в дистиллированную воду. Замороженные срезы не требуют депарафинизации. Подготовленные таким образом срезы могут быть окрашены практически любым красителем. Наиболее часто применяется окраска гематоксилином и эозином. Для чего срезы помещают в раствор гематоксилина на 3-5 мин, затем в водопроводную воду – для промывания и дифференцировки. После приобретения ядрами клеток фиолетового цвета (контролируется под микроскопом), производят окрашивание в растворе эозина в течение 0,5-1,5 мин, промывают в дистиллированной воде и обезвоживают в спиртах восходящей крепости (от 70о до 100о). Далее, для удаления спирта и просветления срезов помещают последовательно в три порции О-ксилола и заключают в канадский бальзам. В некоторых случаях препарат по условиям обработки не может соприкасаться со спиртами, О-ксилолом (например, при окраске на жир), что вызывает необходимость заключать в среды, смешивающиеся с водой: глицерин, глицерин-желатина и др.
?
спехи фундаментальной иммунологии, основанные на достижениях молекулярной биологии и генной инженерии, позволили уточнить иммунопатогенез аллергических, аутоиммунных, онкологических и инфекционных заболеваний. В то же время возросшие возможности проточной цитометрии расширили представления о необходимом перечне популяций лимфоцитов, исследование которых целесообразно при оценке клеточного звена иммунитета. Процесс развития иммунного ответа организма на проникновение инфекции или какие-либо другие воздействия сопровождается значительными изменениями субпопуляционного состава иммунокомпетентных клеток. Это относится как к изменению абсолютного количества иммунокомпетентных клеток, их субпопуляций, так и к появлению на клеточной поверхности определенных функциональных молекул. Под воздействием различных агентов клетки приспосабливаются и отвечают на это изменением экспрессии тех или иных мембранных и внутриклеточных маркеров. Таким образом, одним из эффективных механизмов иммунорегуляции является модуляция экспрессии функционально значимых молекул. Не менее важным является и изменение абсолютного количества иммунокомпетентных клеток в периферической крови. Определение субпопуляционного состава, или фенотипа, лимфоцитов как одной из основных популяций иммунокомпетентных клеток в настоящее время является важным диагностическим признаком, позволяющим судить о течении процессов, происходящих в организме. Под фенотипом следует понимать совокупность функционально значимых маркеров, характерных для определенных стадий дифференцировки, пролиферации, активации или программируемой клеточной гибели (апоптоза). Абсолютное и относительное количество клеток, имеющих тот или иной фенотип, является конечным результатом иммунофенотипирования. Разработка современных цитометров, успехи в химии флюоресцентных красителей, открытие новых CD-маркеров, усовершенствование программного обеспечения позволили проводить анализ фенотипа иммунокомпетентных клеток как рутинную процедуру и получать наиболее полную и достоверную информацию.
Иммуногистохимия, иммуноцитохимия (игх) ИГХ — комплекс методов, позволяющих выявлять (визуализировать) определенные антигены в составе естественного клеточного или тканевого микроокружения в норме и при патологии. ИГХ основана на тИФА, который проводится in situ, т. е. на гистологических срезах (иммуногистохимия) или мазках, цитопрепаратах (иммуноцитохимия). Образующийся не- растворимый окрашенный продукт локализуется в месте экспрессии антигена и учитывается с помощью световой микроскопии.Постановка ИГХ предусматривает следующие этапы: забор материала; приготовление гистологических (цитологических) препаратов; фиксацию, подготовку антигенов (зависит от природы антигена и антител); собственно окрашивание (тИФА: прямой, непрямой, непрямой с усилением сигнала); _ учет: микроскопия, фотографирование, выдача заключения. ИГХ позволяет существенно улучшить специфичность и чувствительность патоморфологического метода исследования, что весьма актуально для диагностики опухолей (метастазов), их тканевого происхождения, степени дифференцировки и т. д. (рис. 5).  =»я*Г..-'.' .','"•• Т*,- *'-.. -'■;*, ^ . 'ЙЭ^.'"'- Гистологический срез опухолевой ткани молочной железы, окрашенный антителами к PCNA — антигену, ассоциированному с клеточной пролиферацией. Антиген локализуется в ядрах клеток. Помимо онкологии, ИГХ находит применение для диагностики аутоиммунной патологии, некоторых инфекционных заболеваний, фенотипи-рования клеток крови и костного мозга и научных целей. | |||||||||||||||||||||||||