МЕТОДИЧЕСКИЕ_РЕКОМЕНДАЦИИ_ПО_ИММУНОЛОГИИ_ПОТАТУРКИНА-НЕСТЕРОВА_Н. Методические рекомендации для студентов к лабораторным занятиям по иммунологии учебное пособие Ульяновск
 Скачать 1.19 Mb.
|
|
Общий вывод. 33 ЛАБОРАТОРНОЕ ЗАНЯТИЕ №5 ТЕМА ПАТОЛОГИИ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ. ИММУНОДЕФИЦИТЫ Цель формирование знаний об иммунодефицитных состояниях человека Задачи: 1. Рассмотреть понятия иммунопатология, иммунодефицит. 2. Изучить основные типы иммунодефицитов, их причины и клинические проявления. Основные вопросы темы занятия 1. Понятие иммунодефицита, классификация иммунодефицитов. Причины развития врожденных иммунодефицитных состояний. 2. Первичные иммунодефициты: характеристика, классификация. Комбинированные иммунодефициты. 3. Вторичные иммунодефициты: характеристика, классификация. 4. Причины развития приобретенных иммунодефицитов. 5. Клинические проявления иммунодефицитных состояний. Факторы, влияющие на иммунный статус. 6. Иммунокоррекция, иммуномодуляторы: понятие, классификация. Иммунодефицитами называется большая разнородная группа заболеваний, проявляющихся нарушением иммунитета вследствие разнообразных первичных или вторичных дефектов иммунной системы. Дефекты могут затрагивать отдельные компоненты иммунных взаимодействий или быть комбинированными, могут развиваться в отношении его специфических составляющих, или касаться фагоцитоза или системы комплемента. 34 Большинство первичных иммунодефицитов – наследственные заболевания. Водной только Х-хромосоме локализованы гены, по меньшей мере, шести разных иммунодефицитов – агаммаглобулинемия, недостаточность антител с избытком IgM, синдром Вискотта-Олдрича, сцепленная с Х-хромосомой лимфопролиферативная иммунопатия, хроническая гранулѐматозная болезнь и тяжѐлый комбинированный иммунодефицит. Тяжелый комбинированный иммунодефицит характеризуется полным врождѐнным отсутствием всех специфических иммунологических функций. Так как это тяжелейшая из всех форм первичных иммунодефицитов, редко кто из больных без лечения доживает до двух лет. Вторичные иммунодефициты распространены во много раз больше, чем первичные. Естественными периодами пониженной иммунологической резистентности являются младенчество, старость и беременность. Основные причины патологической вторичной иммунологической недостаточности – постнатальные патогенные воздействия на систему иммунитета. К ним относятся инфекции (особенно, поражающие лимфоциты и макрофаги - цитомегаловирусная, герпетическая, гепатит В, корь, мононуклеоз, сифилис) и инвазии паразитов (малярия, токсоплазмоз, лейшманиоз, трихинеллез и др. Задание на самостоятельную работу 1. Заполните таблицу Классификация иммунодефицитных состояний Наследуемость Иммунодефицитные состояния первичные вторичные Врожденные 35 Приобретенные 2. Дайте определение Иммунопатология –_________________________________________________ Иммунодефицит –__________________________________________________ 3. Решите тестовые задания 1. Вторичные иммунодефициты могут возникать при а) гемолитической анемии б) некоторых лечебных воздействиях (рентгеновском облучении, кортикостероидной терапии, тимэктомии) в) сывороточной болезни г) уремии д) отеке Квинке 2. К первичным иммунодефицитам относится а) отсутствие стволовых кроветворных клеток б) синдром приобретѐнного иммунодефицита в детском возрасте в) синдром Шедьяка-Хигаси с парциальным поражением гранулоцитов г) синдром Клайнфельтера 3. К болезням, обязательным звеном патогенеза которых являются аутоиммунные реакции, относится а) атопическая форма бронхиальной астмы б) посттравматическое "симпатическое" воспаление глазного яблока 36 в) поллиноз г) сывороточная болезнь 4. К вторичным иммунодефицитам относятся а) ВИЧ-инфекция б) синдром Ди Джоржи в) агаммаглобулинемия Брутона г) агаммаглобулинемия швейцарского типа 5. Какие клетки иммунной системы являются основной мишенью ВИЧ- инфекции а) В-лимфоциты б) Т-лимфоциты киллеры в) Т-лимфоциты хелперы г) лимфоциты 6. В чем одно из важных отличий антигенпредставляющих клеток иммунной системы от других клеток, обладающих фагоцитарной активностью а) неспособны к завершенному фагоцитозу б) обладают более высокой фагоцитарной активностью в) обладают фагоцитарной активностью только в кооперации с Т- и В- лимфоцитами г) способны передавать информацию о чужеродном Аг Т- и В-лимфоцитам 7. Направление изменения хелперно-супрессорного коэффициента при иммунодефицитах а) увеличение б) уменьшение в) без изменений г) значительное увеличение д) увеличение или уменьшение 8. Следствие активной иммунизации - это а) иммунологическая толерантность б) образование полноценного антигена из гаптена 37 в) активация Т-супрессоров г) первичный иммунный ответ – иммунологическая память – вторичный иммунный ответ 9. Основные условия формирования забарьерных антигенов а) наличие общих антигенов с микроорганизмами б) развитие аутоиммунного ответа в) сенсибилизирующее действие ксенобиотиков г) отсутствие контакта с иммунной системой вследствие наличия анатомических барьеров д) усиление Т-хелперной активности в период эмбриогенеза 10. Т-клеточная цитотоксичность наиболее выражена при а) антибактериальном и противовирусном иммунитете б) болезнях иммунных комплексов в) индукции иммунологической толерантности г) клеточных врожденных иммунодефицитах д) противовирусном, противоопухолевом и трансплантационном иммунитете Общий вывод. ЛАБОРАТОРНОЕ ЗАНЯТИЕ №6 ТЕМА ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ИММУНОПАТОЛОГИЧЕСКИХ СОСТОЯНИЙ У ДЕТЕЙ И ВЗРОСЛЫХ МЕТОДЫ, КРИТЕРИИ ОЦЕНКИ, ИНТЕРПРЕТАЦИЯ Цель формирование знаний о лабораторной диагностики иммунопатологических состояний у детей и взрослых Задачи Рассмотреть методы лабораторной диагностики иммунопатологий. 2. Изучить критерии оценки иммунологического статуса. 38 Основные вопросы темы занятия 1. Лабораторная диагностика иммунопатологических состояний у детей и взрослых методы, критерии оценки, интерпретация. 2. Методы оценки иммунного статуса. 3. Уровни оценки иммунного статуса. 4. Общие правила оценки иммунограмм. Иммунный статус – это структурное и функциональное состояние иммунной системы индивидуума, определяемое комплексом клинических и лабораторных иммунологических показателей. Таким образом, иммунный статус характеризует анатомо-функциональное состояние иммунной системы, те. ее способность к иммунному ответу на определенный антиген в данный момент времени. На иммунный статус оказывают влияние следующие факторы климато-географические; социальные экологические физические, химические и биологические медицинские (влияние лекарственных веществ, оперативные вмешательства, стресс и т. д. Иммунный статус характеризуют концентрация иммуноглобулинов, количество лимфоцитов и лейкоцитов, соотношение Т- и В-клеток и функциональные показатели, в частности способность иммунокомпетентных клеток отвечать на стимуляцию. Иммунодиагностика – раздел иммунологии, изучающий и разрабатывающий методы диагностики инфекционных и неинфекционных болезней, связанных с функцией иммунной системы. Многие инфекционные заболевания в настоящее время претерпели существенные изменения, что выражается в увеличении удельного веса легких, стертых и бессимптомных форм, росте аллергического компонента, высокой частоте микст-инфекций. Это затрудняет традиционную диагностику заболеваний, поэтому значимость иммунодиагностики, направленной на поиск антигенов возбудителя или специфических иммунных сдвигов в организме больного, возрастает. Оценка иммунного статуса (наиболее распространенные тесты 39 1. Общий анализ крови определение соотношении нейтрофилы/лимфоциты/моноциты. СОЭ, СРБ, белковые фракции сыворотки крови (глобулины. 2. Определение количества Т-лимфоцитов (процент и абсолютное число) методами с моноклональными антителами (мАТ) антителами к CD2, CD3, CD4, CD8, CD25. Отношения CD4/CD8. 3. Определение В-лимфоцитов — CD19, CD21, CD22, CD72 или Ig+B. 4. Определение иммуноглобулинов классов G, МАЕ в сыворотке крови и sIgA слюне. Соотношения их количества (G/M/A). 5. Поглотительная активность нейтрофилов крови, частиц латекса и/или стафилококков, кандид (фагоцитарное число, фагоцитарный индекс оценка киллинга кандид, бактерий. 6. НСТ-тест. 7. Определение циркулирующих иммунных комплексов (методом ПЭГ- осаждения. Другие тесты по показаниям. 8. Антитела против стрептококка, дифтерийного токсина, гемофильной палочки, столбнячного токсина, стафилококка, его токсина и вирусов (кори, гриппа. Определение гемолитической активности комплемента и/или его компонентов. 10. Внутрикожные пробы (после забора крови) с распространенными антигенами (туберкулин, стрептокиназа-стрептодерназа, антигены бактерий и грибов. 11. По показаниям – определение ферментов, отсутствующих при первичных иммунодефицитах (АДА, пуриннуклеозидфосфорилазы, альфафетопротеин при атаксии гранулы лейкоцитов при гранулематозной болезни. 12. Оценка интерферонового статуса концентрация интерферона в сыворотке крови уровень интерферона ив культуре лимфоцитов крови после стимуляции вирусом болезни Ньюкастла и стафилококковым энтеротоксином соответственно. 40 13. типирование (при необходимости. 14. Выявление цитокинов (по показаниям, в крови методом иммуноферментного анализа (ИФА) ив клетках системы иммунитета (СИ) методами проточной цитометрии. 15. Определение общей цепи рецепторов цитокинов при тяжелом комбинированном иммунодефиците (ТКИД) методом проточной цитометрии. Задание на самостоятельную работу 1. Методы оценки Т-системы а) количественная оценка Определение количества Т-лимфоцитов Принцип метода На первом этапе методом центрифугирования в градиенте плотности из крови выделяют лимфоциты. На втором этапе с помощью реакции розеткообразования с эритроцитами барана определяют процент Т-лимфоцитов от общего числа лимфоцитов. Реакция розеткообразования основана на наличии на поверхности Т-лимфоцитов рецепторов, способных фиксировать эритроциты барана. Поэтому при добавлении к суспензии лимфоцитов эритроцитов барана, последние адсорбируются Т-лимфоцитами. Образующиеся при этом структуры называются розетками. Подсчитывают под микроскопом общее количество лимфоцитов и количество розеток. Выявление Т-лимфоцитов в реакции розеткообразования с эритроцитами барана б) качественная (функциональная) оценка 1. Оценка способности к пролиферации в реакции бластной трансформации лимфоцитов 41 Принцип метода Т-лимфоциты под воздействием некоторых биостимуляторов, например, фитогемагглютинина (ФГА), в культуре in vitro способны превращаться в большие бластоподобные клетки с разрыхленным ядром и базофильной цитоплазмой, активно синтезирующие ДНК. Реакция бластной трансформации На рисунке обозначить 1. Лимфоцит 2.Лимфобласт. 2. Методы оценки В-системы а) количественная оценка Определение количества В-лимфоцитов методом розеткообразования с эритроцитами мыши Принцип метода Аналогичен реакции розеткообразования для выявления Т-лимфоцитов, но вместо эритроцитов барана используются эритроциты мыши. б) качественная (функциональная) оценка Определение концентрации иммуноглобулинов в реакции преципитации по Манчини Принцип метода образцы исследуемой сыворотки помещают в лунки агаров геля, который содержит антитела против иммуноглобулина определенного класса. Иммуноглобулины, диффундирующие в агар, при взаимодействии с соответствующими антителами образуют кольца преципитата, диаметр которых пропорционален концентрации иммуноглобулинов соответствующего класса в исследуемой сыворотке. Концентрацию иммуноглобулина определяют по заранее построенному с помощью эталонных сывороток графику (калибровочной кривой. Определение концентрации IgG Исследуемый материал – сыворотка обследуемого. Диагностический 42 препарат – преципитирующая сыворотка против IgG человека, внесенная в расплавленный агар. Концентрация = _______________________ гл 3. Методы выявления сенсибилизации in vitro Определение количества Е определенной специфичности или их общего количества с помощью радиоимунного или иммуноферментного методов. Реакция дегрануляции Принцип метода При фиксации на наружных мембранах клеток- мишеней (базофилов, нейтрофилов) комплексов аллерген+Ат наблюдается их повреждение. На их поверхности появляется корона из гранул, которые можно выявить при микроскопии. Степень дегрануляции коррелирует со степенью сенсибилизации. корона из гранул 4. Показатель повреждения нейтрофилов (ППН) Принцип методов Тест основан на снижении подвижности лейкоцитов под действием аллергена. Амебоидная реакция 43 5. Решите задачу Убольного К. 35 лет в иммунограмме выявлены следующие изменения Показатель В норме У обследуемого лимфоциты в % 60-80 73 CD4+ лимфоциты в % 33-50 40 CD8+ лимфоциты в % 16-39 29 CD16+ лимфоциты в % 3-10 7 лимфоциты в % 6-23 21 Индекс CD4+/ CD8+ 1,5-2,0 1,5 Фагоцитарная активность 50-90 68 Фагоцитарное число 2-9 5 Ig G, гл 0,9-4,5 6,0 Ig A, гл 8-20 2 Ig Мг л 0,6-2,5 1,8 Вопросы к задаче 1. Какое звено иммунитета нарушено по результатам представленной иммунограммы? 2. Какой иммунологический диагноз Вы поставите больному по измененим в иммунограмме? 3. Какие иммуномодуляторы можно назначить больному для коррекции выявленных изменений 4. Когда необходимо провести повторное иммунологическое исследование после иммунокоррекции? 5. Какие наиболее часто встречаемые жалобы предъвляет больной с диагнозом иммунологической недостаточности 44 6. Опишите кожные иммунологические пробы Принцип метода __________________________________________________ Сфера применения _______________________________________________ Диагностические препараты Токсин Шика – ____________________________________________________ Токсин Дика – ____________________________________________________ Положительный результат кожной иммунологической пробы – ________________________________________________________________ Отрицательный результат кожной иммунологической пробы – _______________________________________________________________ Общий вывод. ЛАБОРАТОРНОЕ ЗАНЯТИЕ №7 ТЕМА ИММУННЫЕ РЕАКЦИИ Цель формирование знаний о видах серологических реакций. Задачи Рассмотреть виды серологических реакций. 2. Изучить механизмы постановки серологических реакций. Основные вопросы темы занятия 1. Серологические реакции - понятие, свойства, применение. 2. Реакция агглютинации – определение, компоненты, применение. 3. Стадии реакции агглютинации, учет результатов (О, Н-агглютинация). 4. Способы постановки реакции агглютинации – ориентировочная и развернутая. Титр реакции агглютинации. 5. Варианты реакции агглютинации – РПГА, РНГА, РТГА, реакция коагглютинации, Реакция Кумбса. 45 6. Реакция преципитации – определение, компоненты, применение. 7. Способы постановки реакции преципитации – кольцепреципитация, преципитация в геле (по Манчини, Оухтерлони), термопреципитация, реакция флоккуляции. 8. Реакция связывания комплемента – компоненты, фазы, применение. 9. Механизм, учет результатов реакции связывания комплемента. Реакция иммуноблотинга, реакция нейтрализации токсина антитоксином (in vivo, in vitro). 11. Реакции с мечеными антигенами и антителами – реакция иммунофлюоресценции, иммуноферментный анализ, радиоиммунный метод. Принцип постановки, механизм. Иммунные реакции используют при диагностических и иммунологических исследованиях у больных и здоровых людей. С этой целью применяют серологические методы, те. методы изучения антител и антигенов с помощью реакций антиген—антитело, определяемых в сыворотке крови и других жидкостях, а также тканях организма. Обнаружение в сыворотке крови больного антител против антигенов возбудителя позволяет поставить диагноз болезни. Серологические исследования применяют также для идентификации антигенов микробов, различных биологически активных веществ, групп крови, тканевых и опухолевых антигенов, иммунных комплексов, рецепторов клеток и др. В иммунологии широко применяются реакции агглютинации, преципитации, нейтрализации, реакции с участием комплемента, с использованием меченых антител и антигенов (радиоиммунологический, иммуноферментный, иммунофлюоресцентный методы. Перечисленные реакции различаются по регистрируемому эффекту и технике постановки, однако, все они основаны на реакции взаимодействия антигена с антителом и применяются для выявления как антител, таки антигенов. Реакции 46 иммунитета характеризуются высокой чувствительностью и специфичностью. Реакция агглютинации бактерий с использованием соответствующей антибактериальной сыворотки относится к наиболее простым серологическим реакциям. Преципитация происходит в результате взаимодействия антител с растворимыми антигенами. Простейшим примером реакции преципитации является образование в пробирке непрозрачной полосы преципитации на границе наслоения антигена на антитело. Широко применяют различные разновидности реакции преципитации в полужидких гелях агара или агарозы метод двойной иммунодиффузии по Оухтерлоню, метод радиальной иммунодиффузии, иммуноэлетрофорез). Иммунофлюоресценция заключается в использовании меченных флюорохромом антител, точнее, иммуноглобулиновой фракции антител lgG. Меченное флюорохромом антитело образует с антигеном комплекс антиген- антитело, который становится доступным наблюдению под микроскопом в УФ-лучах, возбуждающих свечение флюорохрома. Характерным отличием реакции связывания комплемента (РСК) от реакции агглютинации и преципитации есть участие в ней, кроме антигена и антитела, ингредиентов реакции гемолиза, которая выступает в виде индикаторной системы. Взаимодействие антигена с антителом не всегда предопределяет визуальные изменения, которые позволяют определить результат реакции. Однако известно, что при образовании комплекса антиген - антитело к нему всегда присоединяется комплемент. Если антиген и антитело не отвечают друг другу, то комплемент не связывается, остается свободным в системе. При добавлении комплекса эритроциты барана - гемолизины свободный комплемент, связываясь с ним, вызывает гемолиз эритроцитов. Этот принцип и положено в основу РСК. При соответствии антигена антителу с ним связывается комплемент. Чтобы убедиться в этом, добавляют эритроциты барана и гемолитическую сыворотку. При отсутствии 47 гемолиза заключают, что реакция положительная, при наличии гемолиза - реакция негативная. Задание на самостоятельную работу 1. Заполните таблицу. Реакции АГАТ протекают в 2 фазы я специфическая Взаимодействуют антиген и антитело с образованием комплекса АГАТ я неспецифическая Проявление этой реакции, видимый эффект Определяемые свойства реакции Фазы реакции я – взаимодействие АГАТ я развитие видимых проявлений Специфичность + Вид реакции + Чувствительность + Скорость + 2. Напишите определение и зарисуйте результат реакции агглютинации. Реакция агглютинации ____________________________________________ (+) феномен агглютинации – образование агрегатов (крупнохлопчатых при наличии у бактерий жгутиков или мелкозернистых при их отсутствии) (-) феномен агглютинации – равномерная муть 48 Напишите определение и зарисуйте результат реакции преципитации. Реакция преципитации – _____________________________________________ (+) феномен преципитации – помутнение (-) феномен преципитации – отсутствие помутнение Преципитирующие сыворотки получают _______________________________ Титром преципитирующей сыворотки называется _________________________________________________________________ 4. Опишите реакцию связывания комплемента (РСК) Ингредиенты АГАТ Комплемент – _____________________________________________________ Титр комплемента – ________________________________________________ Гемолитическая система Эритроциты барана Гемолитическая сыворотка |