Ещё про холеру. Еще про холеру. Методические указания методы контроля. Биологические и микробиологические факторы
 Скачать 1.24 Mb.
|
|
Приготовление чашек с питательной средой К качеству питательных сред для постановки диско-диффузионного метода выдвигаются те же требования, что и к плотным питательным средам для постановки метода серийных разведений в агаре, соответственно используются и те же методы контроля качества. Плотную питательную среду готовят в соответствии с инструкцией изготовителя. Перед заполнением расплавленной средой чашки Петри устанавливают на строго горизонтальную поверхность (выверенную по уровню, без впадин и выпуклостей). Глубина агарового слоя в чашке должна быть 4,0 мм, что достигается внесением 25-30 мл расплавленного агара в чашку диаметром 100 мм. Размер и форма зоны ингибиции роста зависят от глубины и равномерности агарового слоя. После заполнения чашки оставляют при комнатной температуре для застывания. Свежеприготовленные чашки перед инокуляцией культуры необходимо подсушить при 37 °С в течение 10-20 мин с приоткрытой крышкой. Чашки с агаром можно хранить в запаянных полиэтиленовых пакетах при 4-8 °С в течение 7-10 суток. Перед использованием их также необходимо подсушить в течение 10-20 мин при 37 °С с приоткрытой крышкой. Перед инокуляцией необходимо проконтролировать отсутствие конденсата жидкости на внутренней поверхности крышек. Приготовление инокулята и инокуляция Для приготовления инокулята используют 18-20-часовую агаровую или 3-4-часовую бульонную культуру холерного вибриона. Суспензию или бульонную культуру доводят до концентрации 10  м.к./мл по отраслевому стандартному образцу ГИСК им. Л.А.Тарасевича - ОСО-42-25-59-86П и разводят в 10 раз изотоническим раствором хлорида натрия до конечной концентрации 10 м.к./мл. Приготовленный таким образом инокулят наносят в количестве 1-2 мл на поверхность питательной среды, равномерно распределяют по поверхности покачиванием и удаляют избыток жидкости пипеткой. Приоткрытые чашки подсушивают при комнатной температуре в течение 10-15 мин. Наложение дисков и инкубация Не позднее, чем через 15 мин после инокуляции, на поверхность питательной среды наносят диски с антибиотиками. Диски наносят с помощью автоматического диспенсора или стерильным пинцетом. Расстояние от диска до края чашки и между дисками должно быть 15-20 мм. Таким образом, на одну чашку диаметром 100 мм следует помещать не более 6 дисков. Диски должны равномерно контактировать с поверхностью агара, для чего их следует аккуратно прижать пинцетом. Непосредственно после наложения дисков чашки помещают в термостат кверху дном и инкубируют 14-18 ч при 37 °С. Увеличение интервала между нанесением дисков на поверхность среды и началом инкубации, а соответственно и пролиферации микроорганизма, приводит к "преддиффузии" антибиотика и увеличению диаметра зоны ингибиции роста. Учет и интерпретация результатов После окончания инкубации чашки помещают кверху дном на темную матовую поверхность так, чтобы свет настольной лампы падал на них под углом в 45° (учет в отраженном свете). Диаметр зон задержки роста с учетом диаметра самого диска измеряют с точностью до 1 мм, при этом предпочтительнее пользоваться штангенциркулем или кронциркулем. При измерении зон задержки роста следует ориентироваться на полную ингибицию видимого роста. Не следует обращать внимания на очень мелкие колонии, выявляемые в пределах зоны задержки роста только при особых условиях освещения или увеличении, и на едва заметный налет у края зоны. Крупные колонии, выявляемые в пределах четкой зоны ингибиции роста, свидетельствуют о наличии посторонней микрофлоры или о гетерорезистентности популяции, в этом случае необходима повторная идентификация и повторение исследования на антибиотикочувствительность. При оценке чувствительности к сульфаниламидам и их комбинации с триметопримом границу зоны ингибиции роста следует учитывать на уровне ингибиции роста на 80%. Это связано с тем, что под действием этих препаратов перед полной ингибицией роста возможно завершение 1-2-х циклов пролиферации микроорганизма. Интерпретация результатов производится по табл.9. 6.7.3. Контроль качества питательных сред для определения антибиотикочувствительности Качество питательной среды является одним из критических параметров для корректной оценки антибиотикочувствительности. Важнейшими показателями качества питательной среды являются концентрации двухвалентных катионов Са  и Mg , влияющих на активность аминогликозидных антибиотиков и тетрациклинов, а также тимина и тимидина, являющихся антагонистами сульфаниламидных препаратов и триметоприма. Перед использованием в экспериментах по оценке антибиотикорезистентности каждая новая партия среды (MueIler-Hinton или какой-либо другой) должна пройти контроль качества в соответствии с описанным ниже методом. А. Определение рН среды Определение рН среды проводят после автоклавирования и охлаждения до комнатной температуры 25 °С, приемлемый диапазон 7,2-7,4. При величине рН среды, выходящей за указанные пределы, возможны существенные изменения в величине МПК. Б. Контроль катионного состава Для получения воспроизводимых результатов оценки антибиотикорезистентности питательная среда должна содержать Са 20-25 мг/л и Mg 10,0-12,5 мг/л. Наиболее доступным интегральным методом оценки качества сред (как жидких, так и агаризованных) является сопоставление экспериментально полученной величины МПК референтных штаммов микроорганизмов с этим показателем, приведенным в их паспортной характеристике. Наиболее подходящим штаммом для оценки качества жидких и плотных питательных сред, предназначенных для изучения антибиотикорезистентности, является штамм Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. Среду следует считать удовлетворительной по качеству, если величина МПК гентамицина находится в пределах 0,5-2,0 мкг/мл. Выбор гентамицина для контроля качества связан с тем, что аминогликозидные антибиотики наиболее чувствительны к колебаниям концентрации двухвалентных катионов. В. Для контроля на наличие антагонистов сульфаниламидных препаратов и триметоприма рекомендуется использовать штамм Enterococcus faecalis ATCC 29212. При величине МПК триметоприма/сульфаметоксазола <0,5/9,5 мкг/мл среду следует признать удовлетворительной по качеству. Определение величины МПК антибиотиков (или диаметров зон ингибиции роста) в отношении референтных штаммов в целях контроля качества среды проводят в соответствии с описанными выше методами. Категорическим требованием является использование антибиотиков с предварительно известной активностью. Таблица 10 Значения величин МПК (мкг/мл) для референтных штаммов
Таблица 11 Значения величин диаметров зон ингибиции роста (мм) для референтных штаммов
| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||