Ещё про холеру. Еще про холеру. Методические указания методы контроля. Биологические и микробиологические факторы
 Скачать 1.24 Mb.
|
|
Материалы и оборудование - исследуемые сыворотки, инактивированные прогреванием 30 мин при температуре (56,0±0,5) °С; - сухой комплемент или свежеполученная сыворотка морской свинки в разведении 1:20; - 0,9%-й раствор хлорида натрия рН 7,2±0,1; - штаммы холерных вибрионов сероваров Огава и Инаба, типичные в S-форме, не чувствительные к комплементу; - чашки Петри со щелочным агаром; - лоток со льдом; - термостат на (37,0±1,0) °С. Методика постановки реакции Комплемент, разведенный 0,9%-м раствором хлорида натрия 1:20, разливают в два ряда пробирок по 0,9 мл. В первую пробирку вносят 0,1 мл исследуемой сыворотки и после тщательного перемешивания последовательно переносят по 0,1 мл до разведения 10  , получая десятикратные разведения сыворотки в объеме 0,9 мл. Титрацию сыворотки проводят на льду, который помещают в любую емкость. Из односуточной агаровой культуры холерного вибриона готовят взвесь в 0,9%-м растворе хлорида натрия, содержащего в 1 мл 1-2х10  м.к. Стерильной градуированной пипеткой полученную взвесь по 0,1 мл вносят в опытные пробирки с раститрованной сывороткой. Необходимы следующие контроли: а) контроль комплемента (0,9 мл комплемента и 0,1 мл культуры); б) контроль сыворотки (0,8 мл 0,9%-го раствора хлорида натрия, 0,1 мл сыворотки и 0,1 мл культуры); в) контроль культуры (0,9 мл 0,9%-го раствора хлорида натрия и 0,1 мл культуры). Штатив с пробирками на 1 ч помещают в водяную баню или термостат при температуре (37,0±0,5) °С, сделав предварительно высев из пробирки контроля культуры на 2 пластинки щелочного агара для определения фактической концентрации живых вибрионов в опытной суспензии (контроль разведения). Через 1 ч штатив вновь ставят на лед и из каждой пробирки отдельной стерильной пипеткой 0,1 мл культуры высевают на чашку с щелочным агаром рН 7,0±0,1. Посев равномерно распределяют по поверхности чашки покачиванием или шпателем. Чашки помещают на 18-24 ч в термостат при температуре (37,0±0,5) °С, после чего подсчитывают количество выросших колоний. В посевах из контрольных пробирок с культурой должно вырастать количество колоний, близкое к контролю разведения. Вибриоцидным титром считают максимальное разведение сыворотки, которое вызывает гибель не менее чем 50% клеток холерного вибриона, что выявляется при посеве на агаровые пластинки в чашки Петри по сравнению с количеством выросших колоний из пробирки контроля комплемента. Пример вычисления: при посеве из опытных пробирок с разведением сыворотки 10  ; 10 ; 10 ; 10 ; 10 ; 10 ; 10 и т. д. на чашках соответственно выросло 0; 0; 5; 10; 15; 30; 38 и т.д. колоний. При высеве из пробирки контроля комплемента также после часовой инкубации при температуре (37,0±0,5) °С выросло 36 колоний, 50% от этого числа будет составлять 18. Из 5-й пробирки выросло 15 колоний, т.е. меньше 50% от количества колоний в контроле (18), в следующей - 30, т.е. более 50% этого же показателя. Разведение сыворотки в 5-й пробирке составляет 10 , следовательно, вибриоцидный титр в данном примере будет составлять 10 . Определение вибриоцидных антител (ВА) в сыворотке крови на основе ферментации углеводов Об отсутствии или наличии ВА судят по ферментации сахарозы, регистрируемой с помощью индикатора. Материалы и оборудование: - инактивированная сыворотка крови; - штаммы холерного вибриона серовара Огава и Инаба; - комплемент, разведенный 1:20 1%-й пептонной водой, содержащей 1% сахарозы и 1% индикатора Андреде; - термостат на (37,0±1) °С. Методика постановки реакции Комплемент, разведенный 1:20 1%-й пептонной водой с сахарозой и индикатором Андреде разливают в пробирки по 0,45 мл. В первую пробирку добавляют 0,05 мл исследуемой сыворотки и после тщательного перемешивания переносят 0,05 мл смеси во вторую пробирку, из второй в третью и т.д. (до разведения 10 -10 ). Готовят суспензию 18-20-часовой агаровой культуры холерного вибриона и разводят 1%-й пептонной водой до концентрации 10 м.к./мл. Во все пробирки вносят по 0,45 мл суспензии и помещают в термостат. Постановку реакции сопровождают следующими контролями: - 0,45 мл 1%-й пептонной воды, содержащей 1% сахарозы и 1% индикатора Андреде + 0,05 мл исследуемой сыворотки + 0,45 мл взвеси культуры - контроль сыворотки; - 0,45 мл комплемента с сахарозой и индикатором + 0,45 мл культуры - контроль комплемента; - 0,45 мл 1%-й пептонной воды с сахарозой и индикатором + 0,45 мл культуры - контроль культуры; - 0,45 мл 1%-й пептонной воды с сахарозой и индикатором + 0,05 мл исследуемой сыворотки - контроль стерильности сыворотки. Через 5-6 ч проводят учет реакции. При этом в контроле (кроме контроля стерильности сыворотки) цвет содержимого пробирок должен перейти в красный или розовый. Изменение цвета индикатора в пробирках рабочего ряда, связанное с ферментацией сахарозы размножившимися вибрионами, свидетельствует об отсутствии вибриоцидных антител в исследуемой сыворотке. За вибриоцидный титр принимают то наибольшее разведение сыворотки, при котором цвет содержимого пробирок остается неизмененным или интенсивность его значительно отличается от окраски контрольных проб. Результат выражают в виде десятичного логарифма разведения сыворотки, взятого с обратным знаком. Примечание. Для постановки РВА при холере, обусловленной холерным вибрионом О139 серогруппы, не может быть использован выделенный в очаге штамм в связи с возможной чувствительностью его к комплементу. В этих случаях рекомендуется предложенный специалистами Ростовского НИПЧИ, ctx  клон холерного вибриона О139, направленный на депонирование в Государственную коллекцию патогенных бактерий "Микроб" (РосНИПЧИ "Микроб"). 8.3. Определение токсиннейтрализующих антител в сыворотке крови Для выявления токсиннейтрализующих антител в сыворотке крови больных холерой и вибриононосителей предназначена РНГА с эритроцитарным холерным энтеротоксическим диагностикумом (ЭХЭД), у которых инфицирование обусловлено холерными вибрионами О1 и О139 серогрупп. Токсиннейтрализующие антитела появляются на 5-7-й день болезни, достигая максимума на 14-21-й день, затем их титр постепенно снижается, но сохраняется дольше других антител. Иммуноглобулины к холерному токсину, в сравнении с вибриоцидными и другими специфическими холерными антителами, дольше циркулируют в сыворотке крови после перенесенной инфекции (до 8-10 и более месяцев). Условно положительным титром РНГА с ЭХЭД следует считать 1:160 и выше. Целесообразно исследовать парные сыворотки. Результат РНГА с ЭХЭД позволяет сделать заключение о токсигенности (эпидемичности) циркулирующего в очаге штамма холерного вибриона, в том числе и без выделения культуры. Приложение 1 (рекомендуемое) Направление проб от людей
* Регистрационный номер проставляют в лаборатории. ** Указать принимал (а) ли антибиотики; если да, то какие, когда и сколько.
Приложение 2 (рекомендуемое) Направление проб из объектов окружающей среды
* Регистрационный номер проставляют в лаборатории.
Приложение 3 (обязательное) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||