Ещё про холеру. Еще про холеру. Методические указания методы контроля. Биологические и микробиологические факторы
 Скачать 1.24 Mb.
|
|
7. Питательные среды, реактивы, консерванты. Порядок контроля качества питательных сред 7.1. Питательные среды Транспортные среды: 1%-я пептонная вода, рН 8,5±0,1 без ингибиторов роста сопутствующей флоры и с теллуритом калия (см. среды обогащения); 2%-й раствор поваренной соли: 20 г хлорида натрия и 0,1 г едкого натрия растворяют в 1 л дистиллированной воды; жидкость пропускают через бумажный фильтр, разливают по 10 мл в пробирки и стерилизуют в автоклаве 20 мин при 0,7 атм. Среды обогащения а) Основной раствор пептона готовят по следующей прописи:
В холодную дистиллированную воду погружают пептон, хлорид и карбонат натрия. Смесь кипятят при постоянном помешивании до полного растворения пептона, не допуская его пригорания, затем добавляют нитрат калия. Проверяют реакцию среды, если нужно, рН доводят до 8,5±0,1. Раствор фильтруют через миткалевый или бумажный фильтр, разливают в посуду и стерилизуют в автоклаве 20 мин при 1 атм. Основной раствор пептона сохраняется до 2 лет. б) 1%-я пептонная вода. Для получения 1%-й пептонной воды концентрированный раствор разводят в 10 раз дистиллированной водой. После установления рН 8,5±0,1 разливают в пробирки или во флаконы и стерилизуют 20 мин при давлении 0,7 атм. Можно готовить 1%-ю пептонную воду и непосредственно из отдельных компонентов, взяв навески в 10 раз меньше указанных в рецепте основного пептона. Технология приготовления такая же, как и основного пептона. в) Пептонная вода с теллуритом калия. В 1%-ю пептонную воду (рН 8,5±0,1) после автоклавирования добавляют теллурит калия в конечном разведении 1:100000 или 1:200000. Предварительно готовят рабочий 0,1%-й раствор теллурита калия (1:1000). Срок хранения рабочих растворов 7 дней. Плотные среды для выделения холерных вибрионов Щелочной мясо-пептонный агар:
В мясную воду вносят пептон и хлорид натрия. Смесь перемешивают и подщелачивают 20%-м раствором едкого натра до рН 8,3±0,1. Затем добавляют агар-агар и содержимое помещают в автоклав для варки среды вначале текучим паром в течение 30-40 мин, а затем при 1 атм 20 мин. Если мясо-пептонный агар варят на плите, среду кипятят до полного расплавления агар-агара при постоянном помешивании. Для получения прозрачной агаровой среды ее после варки с целью отстоя на 2-3 ч оставляют в автоклаве или помещают в термостатную комнату при температуре (43±2) °С, лучше время отстоя продлить до 18-20 ч. Отстоявшийся агар осторожно, не взбалтывая, сливают с осадка на плотный ватно-марлевый фильтр. В фильтрате уточняют реакцию среды, если требуется, подкисляют ее, но подщелачивать агар на данном этапе не рекомендуется во избежание выпадения осадка при стерилизации готовой среды. Профильтрованный агар разливают в посуду и стерилизуют при 1,0 атм 20 мин. Элективные среды Рекомендуется использовать питательную среду для выделения холерных вибрионов элективно-дифференциальную, сухую (СЭДХ). Среда обладает выраженными элективными свойствами, обеспечивая ингибицию сопутствующей микрофлоры (энтеробактерий, протея, кокков и др.) и практически не влияет на рост вибрионов. Холерные вибрионы О1 и не О1 групп через 12-18 ч формируют на этих средах плоские, прозрачные колонии желтого цвета за счет ферментации сахарозы, диаметром 1,0-2,0 мм; V. parahaemolyticus - мелкие, голубоватые (цвета среды) с уплотненным центром; V. alqinolyticus - крупные, желтые; колонии Pseudomonas, Aeromonas - голубые, Enterobacteriaceae - очень мелкие, плотные или полупрозрачные, иногда окрашены в желтый цвет; колонии протея, как правило, не роятся. Среды для идентификации вибрионов а) Среды с углеводами для отбора колоний:
Среду варят, фильтруют, разливают по 5-7 мл в стерильные пробирки и стерилизуют при давлении 0,5 атм 20 мин. Готовую среду после стерилизации скашивают так, чтобы получить столбик и косяк. Среда светлая. Среду можно готовить на 1,0-1,3%-м питательном агаре, добавляя к нему в соответствующих концентрациях углеводы и индикатор Андреде. Лактозо-сахарозная среда Готовится как и среда Ресселя, но вместо глюкозы берут сахарозу в том же количестве.
Вначале в расплавленном питательном агаре (рН 7,7±0,1) растворяют углеводы, затем к нему добавляют свежеприготовленные растворы железа и солей натрия согласно прописи среды (индикатор на сероводород). Кроме того, для регистрации кислотообразования добавляют индикатор феноловый красный. Среду варят, фильтруют, разливают по 5-7 мл в стерильные пробирки, стерилизуют 20 мин при давлении 0,5 атм и скашивают по типу среды Ресселя; рН готовой среды 7,3±0,1; цвет красный.
После расплавления рН среды довести до 8,0, разлить в пробирки по 5-7 мл и стерилизовать при 0,7 атм 15 мин. Готовую среду после стерилизации скашивают так, чтобы получить столбик и косяк. б) Среды для идентификации. Среды Гисса К 100 мл 1%-й пептонной воды (рН 7,3±0,1) без селитры добавляют 0,5-1,0% необходимого углевода или спирта (L-арабиноза, D-манноза, D-сахароза, D-маннит, L-инозит, D-глюкоза, растворимый крахмал и др.) и 1% индикатора Андреде или 0,1 мл 1,6%-го раствора бромтимолового синего. Среды разливают в стерильные пробирки с поплавками и стерилизуют при 0,5 атм 20 мин; среду с L-арабинозой следует стерилизовать в течение 20 мин при 0,1-0,2 атм. Для приготовления сред Гисса можно применять только перечисленные изомеры углеводов. Готовые среды Гисса с индикатором Андреде светлые, при кислотообразовании краснеют. Среды с бромтимоловым синим зеленого цвета с травянистым оттенком, при кислой реакции - желтого цвета, при щелочной - синего.
К воде добавляют пептон, натрия хлорид и агар-агар. Смесь подогревают до расплавления агара, затем вносят фосфат калия и глюкозу, продолжают кипятить 2-3 мин. Смесь подщелачивают 20%-м раствором едкого натрия до рН 7,4±0,1, доводят объем среды до первоначального и добавляют 3 мл 1%-го водного раствора бромтимолового синего. Затем среду фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают по 4-5 мл в стерильные пробирки и стерилизуют при давлении 0,5 атм 20 мин. Цвет среды до стерилизации синий, а после автоклавирования травянисто-зеленый, рН 7,1±0,1. При кислой реакции среда желтеет.
Смесь ингредиентов нагревают до полного их растворения, затем фильтруют через бумажный фильтр и разливают по 5 мл в стерильные пробирки. Бульон стерилизуют при давлении 0,5 атм 20 мин. Среда Кодама. В 1%-ю пептонную воду добавляют 0,5% растворимого крахмала. Среду разливают в стерильные пробирки и стерилизуют 20 мин под давлением 0,5 атм. Для оценки результатов расщепления крахмала используют реактив Люголя. Среда с желатиной. К мясопептонному бульону или бульону Хоттингера прибавляют мелко нарезанную желатину из расчета 10,0-15,0 г на 100 мл (летом концентрацию желатины увеличивают до 20%). Желатине дают набухать в течение 30 мин и затем растворяют при медленном нагревании в водяной бане при температуре (45,0±5,0) °С. Устанавливают рН 7,1±0,1, прибавляя к расплавленной желатине 10%-й раствор двууглекислого натрия. При более щелочной реакции желатина застывает плохо, а иногда и совсем не застывает. В 1 л растворенной желатины вносят для просветления два взбитых с небольшим количеством дистиллированной воды яичных белка. Смесь перемешивают и прогревают текучим паром в течение 20 мин до полного свертывания белка и просветления среды. Затем среду фильтруют в горячем состоянии через бумажный или ватно-марлевый фильтр с большой поверхностью. Среду, разлитую по 5-8 мл в пробирки, стерилизуют при давлении 0,5 атм 20 мин. После стерилизации среду охлаждают путем погружения пробирок в холодную воду в строго вертикальном положении, чтобы верхняя часть столбика при застывании оставалась совершенно ровной. Среда для определения декарбоксилаз и дигидролаз аминокислот
Все ингредиенты по прописи вышеуказанной среды растворяют при нагревании, устанавливают рН 6,4±0,1, затем добавляют соответствующий индикатор и делят среду на 4 равные части. В одну часть аминокислоты не добавляют, эта порция служит контролем. В остальные порции вносят соответственно: в первую - 1% лизина, во вторую - 1% орнитина, в третью - 1% аргинина. Аминокислоты должны быть в L-форме, если имеются D-аминокислоты, то добавляют 2%, т.к. микроорганизмы активны только в отношении L-форм. После добавления аминокислот перед стерилизацией в случае необходимости реакцию среды исправляют 0,1%-м раствором соляной кислоты. Среду разливают по 1-2 мл в химически чистые стерильные пробирки и стерилизуют при давлении 0,1-0,2 атм 20 мин. Небольшое количество флокулята в средах не имеет значения. Пептонно-дрожжевая среда имеет травянисто-зеленый цвет, при кислой реакции среда желтеет, при щелочной - синеет. Мясо-пептонный бульон: мясная вода с 1% сухого пептона и 0,85% поваренной соли. Смесь кипятят до полного растворения пептона и соли, устанавливают нужную реакцию среды, стерилизуют при 0,7 атм 20 мин. |
)
SО
·5Н