Иммунный статус, тесты 1 уровня. Методика подсчета лейкоцитов в камере Горяева

• Название: Методика подсчета лейкоцитов в камере Горяева
• Анкор: Immunii_status_testi_1_urovnia
• Дата: 13.12.2021
• Размер: 27.42 Kb.
• Имя файла: Иммунный статус, тесты 1 уровня.docx
• Тип: Документы; #301573

Иммунный статус (ИС) – совокупность количественных и функциональных показателей, отражающих состояние иммунной системы человека в данный момент времени. Это понятие введено для объективной оценки состояния иммунной системы человека. Изучение показателей иммунитета при иммунных нарушениях должно включать исследования количества и функциональной активности основных компонентов иммунной системы. Все нарушения функции иммунной системы классифицируют, исходя из проявлений различных заболеваний. Выделяют первичные и вторичные иммунодефициты, аутоиммунные, аллергические и лимфопролиферативные заболевания.

Иммунный статус определяет эффективность и согласованность работы всех систем и звеньев иммунитета - макрофагов, комплемента, интерферонов, Т- и В- лимфоцитов, главной системы гистосовместимости.

• 
  На первом этапе с помощью простых ориентировочных методов выявляют “грубые” дефекты фагоцитоза, клеточного и гуморального иммунитета. К тестам первого уровня относят :
  
• 
  - определение абсолютного и относительного содержания лимфоцитов в периферической крови;
  
• 
  - определение количества Т- и В- лимфоцитов;
  
• 
  - определение уровня иммуноглобулинов основных классов (IgG, IgM, IgA);
  

- определение фагоцитарной активности лейкоцитов;

- определение титра комплемента .

При морфологическом исследовании окрашенных мазков периферической крови производится дифференцированный подсчет различных видов лейкоцитов, основанный на физических и биохимических характеристиках этих клеток. Методика подсчета лейкоцитов в камере Горяева:

Развести образец исследуемой крови в 20 раз 3–5% раствором уксусной кислоты с метиленовым синим (например, 20 мкл крови и 380 мкл р-ра уксусной к-ты). Камеру и покровное стекло насухо протереть марлей. Недопускается использование для протирки ватных тампонов из-за остающихся на стекле волокон. Аккуратно притереть покровное стекло к камере, слегка надавливая на него до появления цветных колец Ньютона. Заполнить камеру разведенной кровью и выдержать 1 минуту для прекращения движения клеток. При малом увеличении (окуляр ×10, объектив ×8) посчитать лейкоциты в 100 больших квадратах. Расчет числа лейкоцитов осуществляют, исходя из разведения крови (20) и числа больших квадратов (100), по формуле: X = (a×250×20) / 100, где Х – число лейкоцитов в 1 мкл крови; а – число лейкоцитов, посчитанных в 100 больших квадратах камеры Горяева. Практически, после сокращений в формуле, количество посчитанных лейкоцитов умножают на 50.

Определение абсолютного и относительного количества Т-лимфоцитов - методом Е-розеток (эритроциты барана, лимфоциты)

Метод E-розеток. Методика

Материалы и оборудование. Для работы необходимы: 0,15 М NaCl, среда Игла-MEM с рН 7,4, подведенная с помощью 1 М NaOH, гепарин без консервантов (например, Gedeon Richter, Будапешт), раствор фиколл — визотраст с плотностью 1,077 г/мл, трипановый синий 0,2% в 0,15 М NaCl.

Также нужно иметь центрифужные пробирки на 10 мл (силиконизированные), пастеровские пипетки, центрифуги, гематокритную центрифугу, камеру для подсчета клеток, микроскоп с фазово-контрастной оптикой, ротор для ресуспендирования клеток.

Получение лимфоцитов.

Для определения РОК необходимы лимфоциты, по возможности минимально загрязненные аутологическими эритроцитами. Для получения лимфоцитов подходит метод Бейюма: 2 мл гепаринизированной крови (100 ЕД гепарина/мл) разводят 6 мл среды Игла-MEM и осторожно наслаивают в центрифужную пробирку на 2 мл сепарирующего раствора. Центрифугируют 40 минут при 600 g. Лимфоциты скапливаются в виде полосы белого цвета над сепарирующим раствором. Их отсасывают пастеровской пипеткой и отмывают средой Игла-MEM, центрифугируют 3 раза по 10 минут при 600 g и еще один раз при 200 g, устанавливают плотность суспензии, равную Зх11⁶ клеток/мл.

Инкубация.

Из трижды отмытых в 0,15 М NaCl ЭБ делают 0,5% суспензию в среде Игла-MEM. Равные объемы суспензии лимфоцитов и ЭБ (например, 0,5 мл) смешивают в центрифужной пробирке, центрифугируют в течение 5 минут при 200 g и сохраняют при 4°С в течение ночи.

Оценка результатов.

Важным этапом является ресуспендирование осадка. Требуется определенный опыт, чтобы при покачивании и вращении центрифужных пробирок не разрушить розетки. В нашей лаборатории для ресуспендирования пользовались ротором (угол качания 45°, 6 об/мин, 15 минут). При помощи пастедовской пипетки заполняют счетную камеру и в условиях фазового контраста подсчитывают по меньшей мере 200 лимфоцитов с целью определения РОК- При подсчете РОК учитывают лимфоциты с 3 и более адгезировавшими эритроцитами. Жизнеспособность клеток определяют окрашиванием 0,2% раствором трипанового синего. Розетки фиксируют 0,8% раствором глутарового альдегида. В течение 1—2 недель розетки можно хранить в 1% агарозе. ;

Также можно воспользоваться методом магнитной иммуносепарации, который основан на добавлении к образцу цельной крови частиц Dynabeads – моноклональных антител с маркерами CD3, 4, 8 и др., иммуномагнитном выделении лимфоцитов из цельной крови, лизировании клеток, окрашивании выделенных ядер генцианвиолетом и подсчете окрашенных ядер на световом микроскопе; - методом проточной цитофлуориметрии – метод оптического измерения параметров клетки (размера, гранулярности) которые провзаимодействовали с меченными флуорохромом МкАт с маркерами CD3, 4, 8 и др.

Для определения количества В-лимфоцитов используется метод EAC-розеток. Методика:

Материалы и оборудование. Для работы необходимы: силиконизированные и центрифужные пробирки (25 и 10 мл), пастеровские пипетки, гематокрит-ная центрифуга, центрифуга Т-23, ротор (10—20 об/мин), пикнометр и аналитические весы, или весы Вестфаля (Johannes-Hammer, Лейпциг), камера для подсчета клеток (Вűrkеr или другой тип), седиментационная камера по Sayk (Dorenburg, Берлин), микроскоп, водяные бани на 37°С и 56°С. Цельную кровь барана, разведенную раствором Олсвера О + О. сохраняют до 8 дней в холодильном шкафу при 4°С. Также необходимо иметь кроличьи гемолизины против эритроцитов барана (Саксонское сывороточное предприятие, Дрезден), свежую мышиную сыворотку, 0, 15М NaCl, среду Игла, изотонический буфер для культивирования клеток (Институт иммунных препаратов и питательных сред, Берлин), гепарин (Gedeon Richter, Будапешт), визотраст 370 (Fahlberg List, Магдебург), декстрансульфат (натриевая соль, отн. мол. масса 500) (Pharmacia, Швеция). рН среды Игла и изотонического раствора для культивирования клеток доводят до 7,3—7,4. Готовят разделяющий раствор следующего состава:

100 мл раствора декстрансульфата в воде (60 г/л)
20 мл визотраста, 30 мл бидистиллированной воды

Устанавливают плотность 1,078—1,081 при помощи пикнометра и аналитических весов (или весы Вестфаля). Разделяющий раствор хранят на холоду в темной склянке с притертой пробкой.

Выделение лимфоцитов

Гепаринизированную кровь в количестве 2—4 мл (100 ЕД гепарина на 1 мл) разводят средой Игла в соотношении 1 : 4 и 1 : 6 и осторожно наслаивают на 3—5 мл разделяющего раствора в центрифужных пробирках на 25 мл, центрифугируют 20—40 мин при 600 g и комнатной температуре. Лимфоциты скапливаются в виде белого слоя на границе разделяющего слоя и среды Игла. Их отбирают пастеровской пипеткой и трижды по 10 мин отмывают средой при комнатной температуре. Центрифугируют дважды при 600 g и 1 раз при 200 g для уменьшения примеси тромбоцитов. Концентрацию суспензии доводят до Зх10⁹ клеток/л (среда Игла). Различные варианты контроля дают в среднем 93°/о лимфоцитов, 4% моноцитов, 3% гранулоцитов. Долю моноцитов можно снизить до 1 % и меньше по методу Gu, однако это для метода ЕАС-розеток не имеет особого значения.

Сенсибилизация эритроцитов барана

ЭБ, смешанные с раствором Олсвера, осаждают центрифугированием и дважды отмывают ФСБ или 0,15 NaCl. Ресуспендируют осадок в среде Игла и доводят гематокрит до 0,05. Сенсибилизацию ЭБ проводят инактивированием гемолизином кролика, разведенным до субагглютинирующей концентрации изотоническим буфером. Для получения оптимальных концентраций амбоцептора проверяют несколько степеней разведения, выраженных в титрах гемолизина. При титре гемолизина 1:12 000 и титре агглютининов 1:50 исследовали разведения 1 : 100, 1 : 200, 1 : 500 и 1 : 1000. Наилучшие результаты получаются при разведении 1 : 500. При использовании инактивированных кроличьих антисывороток к антигену Форссмана или ЭБ необходимые разведения не совпадают. По данным различных авторов, степень разведения колеблется от 1 : 500 до 1 : 2000. Суспензию эритроцитов (гематокрит 0,05) смешивают с равным объемом разведенного амбоцептора и инкубируют в течение 30 мин при 37 °С на водяной бане. Суспензию эритроцитов в ходе инкубации многократно перемешивают. После инкубации сенсибилизированные ЭБ дважды отмывают в изотоническом буферном растворе, ресуспендируют в среде Игла и устанавливают гематокрит 0,05.

Получение комплекса антитела — эритроциты — комплемент

В качестве комплемента используют свежую сыворотку мышей, разведенную средой Игла в соотношении 1 : 10. К 1 мл суспензии сенсибилизированных эритроцитов (гематокрит 0,05) добавляют 1 мл разведенной мышиной сыворотки.

Смесь инкубируют 30 мин при 37 °С, трижды отмывают ФСБ и доводят средой Игла гематокрит до 0,005. Для контроля активности комплемента можно использовать инактивированную мышиную сыворотку (30 минут, 56 °С).

Инкубация

Суспензию эритроциты — антитела — комплемент (ЕАС) с гематокритом 0,005 (0,5 мл) в центрифужных пробирках объемом 10 мл с 0,5 мл суспензии лимфоцитов инкубируют 15 мин при 37°С на водяной бане, периодически перемешивая. Затем центрифугируют 5 мин при 200 g и наконец суспендируют при комнатной температуре в роторе (10 качаний в минуту) или вручную (очень осторожно) .

Оценка результатов

Клеточную суспензию (1—2 капли) наносят на сетку счетной камеры, используя для этого пипетку с широким носиком. После наложения покровного стекла производят подсчет розеток» нерозеткообразующих мононуклеаров (микроскопия). За РОК принимают клетки, несущие три и более эритроцита на своей поверхности. Часто встречаются розетки в виде морулы.

Однако ее не следует путать с группами агглютинировавших эритроцитов, т. е. в центре морулы должна присутствовать ядерная клетка. Подсчитывают 200—300 клеток и вычисляют процент розеток. В норме ЕАС-розетки составляют 10— 20% клеток.

Определение количества иммуноглобулинов. Иммуноглобулины классов IgA, IgM, IgG являются показателями гуморального иммунного ответа. Соотношение данных классов антител меняется в зависимости от стадии заболевания. IgM являются маркерами острой фазы заболевания и обострения хронической инфекции; IgА появляются в острый период заболевания, однако сохраняются в сыворотке крови дольше иммуноглобулинов класса IgM, и позволяют определить наличие персистирующей инфекции; IgG формируются в стадии разрешения или при хронической инфекции, и могут существовать длительно, часто сохраняются в течение всей жизни. Результаты исследования не являются единственным критерием, учитываемым лечащим врачом при постановке диагноза и назначении соответствующего лечения, и должны рассматриваться в комплексе с данными анамнеза и результатами других возможных обследований, включая инструментальные методы диагностики. Методы определения иммуноглобулинов: радиальная иммунодиффузия по Манчини, нефелометрия. Уровень IgE определяют методом ИФА.

Принцип метода радиальной иммунодиффузии заключается в следующем. Строго определенное количество сыворотки вносят в лунки, вырезанные в слое геля, содержащего соответствующую моноспецифическую антисыворотку. При последующей инкубации антиген диффундирует из лунки в гель и образует преципитат в виде кольца. Площадь кольца соответствует объему геля, содержащего антитела в количестве, эквивалентном количеству внесенного антигена, т. е. при стандартных условиях опыта площадь кольца прямо пропорциональна концентрации данного белка в сыворотке. Сравнивая размер колец исследуемых сывороток и стандартной сыворотки, содержащей известное количество данного белка, рассчитывают его концентрацию в изучаемых образцах.

При использовании нефелометрии реакция антиген (исследуемый белок) — антитело (моноспецифическая антисыворотка) протекает в жидкой фазе, а образовавшиеся в результате реакции иммунные комплексы выпадают в виде нерастворимого осадка, вызывая помутнение среды. Для повышения эффективности реакции и ее ускорения реагенты помещают в раствор коллоида (обычно полиэтиленгликоля), в присутствии которого реакция заканчивается уже через несколько минут. О количестве образовавшегося иммунного преципитата судят по мутности пробы (относительно контроля). При нефелометрическом анализе мутность раствора определяют, регистрируя количество рассеянного света при прохождении хорошо сфокусированного монохроматического луча через исследуемый раствор. Учет реакции производят после ее окончания (по конечной точке) или по мере образования осадка. Эта модификация, называемая кинетической нефелометрией, более предпочтительна.

При использовании методов, основанных на регистрации изменения оптических свойств среды, образец и реагенты должны быть оптически прозрачны и не содержать веществ, образующих нерастворимые соединения с полиэтиленгликолем (например, гепарин). Важные требования к антисывороткам — высокое сродство к антигену, обеспечивающее образование устойчивого преципитата, и высокое содержание специфических антител, поскольку при избытке антигена образуются растворимые иммунные комплексы.

Фагоцитарная активность лейкоцитов определяется НСТ-тестом. Принцип метода - основан на восстановлении поглощённого фагоцитом растворимого красителя НСТ(или же бактерии,помеченной флюорисцирующем красителем) в нерастворимый диформазан под влиянием супероксиданиона. Показатели НСТ-теста повышаются в начальный период острых бактериальных инфекций, тогда как при подостром и хроническом течении инфекционного процесса они снижаются Спонтанный НСТ тест - позволяет оценить исходное состояние кислородзависимого механизма бактерицидной активности фагоцитов (гранулоцитов) крови in vitro (инкубируют 40 мин 0,1 мл крови+0,1 мл 0,1% р-р НСТ+0,1 мл среды 199 ) Активированный тест с НСТ - позволяет оценить функциональный резерв кислородзависимого механизма бактерицидности фагоцитов (инкубируют 40 мин 0,1 мл крови+0,1 мл 0,1% р-р НСТ+0,1 мл латекса ).