Микробиологические факторы
 Скачать 322.5 Kb.
|
|
6. Диагностика внебольничных пневмоний 6.1. Диагностика пневмококковой пневмонии Streptococcuspneumoniae (S. pneumoniae) является самым частым бактериальным возбудителем ВП. Пневмококковые пневмонии регистрируются у пациентов любого возраста, встречаются как в амбулаторной практике, так и в стационаре (в т. ч. среди госпитализированных в ОРИТ). Рост заболеваемости ВП пневмококковой этиологии в Северном полушарии отмечается в зимнее время года; пневмококковая пневмония чаще регистрируется среди пациентов с сопутствующими хроническими заболеваниями – хроническая обструктивная болезнь легких, сахарный диабет, алкоголизм, аспления, иммунодефицит, нередко протекает с бактериемией (до 25—30 %). Для пневмококковой ВП, как правило, характерны острое начало, высокая лихорадка, боли в грудной клетке. Однако клинико-лабораторные и рентгенологические проявления ВП, вызванной S. pneumoniae, недостаточно специфичны и не могут считаться адекватным предиктором этиологии заболевания. Для диагностики пневмококковой ВП наиболее часто используют культуральные методы исследования. Клиническим материалом для исследования является мокрота, венозная кровь, реже – инвазивные респираторные образцы (БАЛ, материал, полученный при бронхоскопии, защищенной браш-биопсии и др.) и плевральная жидкость. При исследовании мокроты особое внимание следует обратить на необходимость оценки качества доставленного образца. Проведение анализа необходимо начать с приготовления мазка, так как результаты микроскопии влияют не только на оценку пригодности материала, но и на дальнейшее направление бактериологического исследования. Критериями пригодности мокроты для бактериологического исследования является наличие более 25 сегментоядерных лейкоцитов и не более 10 эпителиальных клеток в поле зрения при просмотре, как минимум, 20 полей зрения мазка, окрашенного по Граму (под увеличением ×100). При микроскопии мазка, окрашенного по Граму (под увеличением ×1 000 при использовании иммерсионного объектива), обнаруживаются грамположительные кокки (чаще – ланцетовидные диплококки) диаметром 0,5—1,25 мкм, не имеющие спор и жгутиков; большинство имеет полисахаридную капсулу. Исследование плевральной жидкости предусматривает бактериоскопию мазка, окрашенного по Граму с последующим культуральным исследованием. Оно выполняется при наличии плеврального выпота и условий безопасного проведения плевральной пункции (визуализация на латерограмме свободно смещаемой жидкости с толщиной слоя > 1,0 см). Культуральное исследование инвазивных респираторных образцов при ВП рекомендуется проводить пациентам с иммунодефицитом, данный метод может использоваться в отдельных случаях при тяжелой ВП, а также неэффективности стартовой антибактериальной терапии (АБТ). Клинически значимыми при остром воспалительном процессе считаются микроорганизмы, выделенные из БАЛ в количестве ≥ 104 КОЕ/мл, из биоптата, полученного с помощью защищенных щеток – ≥ 103 КОЕ/мл, мокроты – ≥ 105 КОЕ/мл. Для выделенияS. pneumoniae из клинического материала необходимо использовать питательные среды, обогащенные дефибринированной кровью животных (барана, лошади или козла) в концентрации 5 %. Несколько худшие результаты даёт применение дефибринированной крови человека. В связи с дефицитностью дефибринированной крови в практических лабораториях и небольшим сроком её хранения следует помнить о возможности использования для выделения пневмококков коммерчески приготовленного шоколадного агара, который параллельно применяется для выделения гемофилов. Еще одно условие культивирования S. pneumoniae – инкубация в атмосфере с повышенным до 3—7 % содержанием CO2, так как он является факультативным анаэробом. Вероятность выделения S. pneumoniaeиз респираторныхобразцов увеличивается при использовании селективных сред, содержащих добавки, ингибирующие рост сапрофитных и грамотрицательных микроорганизмов (колистин, налидиксовая кислота, гентамицин). Ключевым тестом дифференциации пневмококков от других -гемолитических стрептококков является чувствительность к оптохину (тест основан на способности оптохина селективно подавлять рост пневмококка в отличие от других зеленящих стрептококков). Однако средиS. pneumoniae растет число оптохинорезистентных штаммов, что требует использования альтернативных методов идентификации возбудителя (лизис в присутствии солей желчных кислот, тест Нейфельда, агглютинация с диагностическими пневмококковыми сыворотками). Информативность культурального исследования респираторных образцов и крови в значительной степени зависит от соблюдения общепринятых правил их сбора, хранения и транспортирования (см. прилож.). Кроме того, вероятность выявления St. pneumoniae значительно снижается при получении клинических образцов на фоне системной АБТ. Для культурального исследования крови предпочтительно использовать коммерческие флаконы с питательными средами. Среди некультуральных методов диагностики пневмококковой пневмониинаибольшее распространение в последние годы получил иммунохроматографический тест, предусматривающий выявление пневмококкового клеточного полисахаридного антигена в моче. Основное его преимущество – возможность использования «у постели больного» в связи с простотой выполнения и быстрым получением результата. Пневмококковый экспресс-тест демонстрирует приемлемую чувствительность (50—80 %) и достаточно высокую специфичность (> 90 %) при ВП у взрослых по сравнению с традиционными методами. К недостаткам теста относятся возможность получения ложноположительных результатов при пневмококковом носительстве (тест не рекомендуется проводить у детей младше 6 лет) и у лиц, недавно перенесших ВП. Разработаны методы выявления St. pneumoniaeв клиническом материале с помощью ПЦР. В качестве мишеней для амплификации используются гены аутолизина (lytA), пневмококкового поверхностного антигена (psaA) и пневмолизина (ply) и другие гены мишени. Однако данные методы не получили широкого распространения в клинической практике и их место в этиологической диагностике ВП требует уточнения. 6.2. Диагностика других бактериальных пневмоний Важным клинически значимым бактериальным возбудителем ВП является Haemophilusinfluenzae (H.influenzae). Внебольничную пневмонию, как правило, вызывают нетипируемые штаммы H.influenzae. По данным ряда исследований, H.influenzae чаще встречается у пациентов с сопутствующей ХОБЛ и активных курильщиков, частота инфицирования данным возбудителем выше у пациентов с нетяжелой ВП. Представители семейства Enterobacteriaceae (Klebsiellapneumoniae, Escherichiacoli и др.) и Pseudomonasaeruginosa (P.aeruginosa) выявляются менее чем у 5 % пациентов с ВП и относятся к категории редких возбудителей. Однако значимость данных микроорганизмов может возрастать у пациентов с тяжелой ВП, а инфицирование в несколько раз увеличивает вероятность неблагоприятного прогноза. Как показывают эпидемиологические исследования, частота встречаемости энтеробактерий выше у пациентов с хроническими сопутствующими заболеваниями, у лиц, злоупотребляющих алкоголем, при аспирации, в случае недавней госпитализации и предшествующей АБТ. Дополнительными факторами риска инфицирования P.aeruginosa являются хронические бронхолегочные заболевания (тяжелая ХОБЛ, бронхоэктазы), длительный прием системных стероидов, цитостатиков. Еще один бактериальный возбудитель – Staphylococcusaureus (S. aureus) – редко встречается среди амбулаторных пациентов с ВП, в то же время у лиц с тяжелым течением заболевания его удельный вес может возрастать до 10 % и более. К инфицированию S.aureus предрасполагают многие факторы – пожилой возраст, проживание в домах престарелых, наркомания, злоупотребление алкоголем. Известно, что актуальность S.aureus как возбудителя ВП значительно возрастает во время эпидемий гриппа. Каких-то специфических клинических, лабораторных или рентгенологических признаков, типичных для ВП, вызванной данными возбудителями, и позволяющих отличить ее от пневмоний другой этиологии, не существует. В отдельных случаях, преимущественно у лиц с иммуносупрессией или злоупотребляющих алкоголем, K. pneumoniae может вызывать долевую пневмонию с локализацией поражения в верхней доле легкого, быстрым прогрессированием симптомов заболевания и высокой летальностью. Для этиологической диагностики ВП, вызванной данными возбудителями, основное значение имеет культуральный метод исследования. H. influenzae, как и пневмококк, относится к категории «прихотливых» микроорганизмов, требующих для культивирования наличия в питательных средах факторов X, V и 5—7 % CO2 в атмосфере инкубации. Для выделения H. influenzae из клинического материала обычно используется шоколадный агар или селективный агар для выделения бактерий рода Haemophilus. Посев клинического материала с целью выявления представителей семейства Enterobacteriaceae и P.aeruginosa осуществляется на селективные среды для выделения грамотрицательных бактерий (агар Эндо, МакКонки и др.), S. aureus– на желточно–солевой агар, маннитол–солевой агар и др. Клиническим материалом для исследования может являться мокрота, венозная кровь, инвазивные респираторные образцы и плевральная жидкость. При исследовании мокроты, как и для выявления пневмококков, важное значение имеет оценка качества собранного образца. Исследование плевральной жидкости выполняется при наличии плеврального выпота и условий безопасного проведения плевральной пункции, инвазивных респираторных образцов – только по отдельным показаниям. Следует отметить, что нетипируемые штаммы H. influenzae и S. aureusвходят в состав нормальной микрофлоры верхних дыхательных путей (ВДП), причем частота бессимптомного носительства может быть достаточно высокой. С возрастом, при наличии хронических сопутствующих заболеваний, а также недавней системной АБТ возрастает частота колонизации полости рта и ВДП энтеробактериями. Этот факт необходимо учитывать при клинической интерпретации результатов бактериологического исследования респираторных образцов, особенно мокроты. Информативность культурального исследования респираторных образцов и крови в значительной степени зависит от соблюдения общепринятых правил их сбора, хранения и транспортирования. Идентификация основана на определении питательных потребностей возбудителей и результатах биохимических тестов. Для идентификации всех указанных микроорганизмов разработаны коммерческие биохимические панели и наборы реагентов, могут использоваться автоматизированные микробиологические анализаторы, которые уменьшают трудоемкость культурального исследования. При подозрении на ВП, вызванную S. aureus, важное значение приобретает не только выделение и идентификация возбудителя, но и определение его чувствительности к оксациллину. Несмотря на отсутствие документированных фактов выявления метициллинорезистентного S. aureus у пациентов с ВП на территории Российской Федерации опасность их появления и распространения является вполне реальной. Среди фенотипических методов детекции метициллинорезистентности наиболее часто используются тестирование диско-диффузионным методом с диском, содержащим 30 мкг цефокситина или 1 мг оксациллина, или скрининг на агаре Мюллера-Хинтон с добавлением 4 %-й NaCl и оксациллина в концентрации 6 мг/л. Для подтверждения инфицирования метициллинорезистентным S. aureus разработаны коммерческие тест-системы, основанные на выявлении в клиническом материале гена mecA методом ПЦР. 6.3. Диагностика пневмонии, вызванной Mycoplasma pneumoniae Возбудителем респираторного микоплазмоза является Mycoplasma pneumoniae – представитель класса Mollicutes, объединяющего бесстеночные, способные к автономному существованию бактерии, по уровню структурной организации занимающие промежуточное положение между бактериями и вирусами. Респираторный микоплазмоз – распространенное антропогенное заболевание. Особенностью респираторного микоплазмоза является периодичность эпидемий с интервалами, по данным разных источников, варьирующими от 3 до 7 лет. Распространению инфекции способствует частота и длительность контактов среди лиц, пребывающих в закрытых и полузакрытых коллективах (военнослужащие, школы-интернаты), особенно при их формировании. В 3—10 % случаев микоплазменной инфекции рентгенологически диагностируется пневмония. При пневмонии, вызванной M. pneumoniae, другие бактериальные или вирусные возбудители, как правило, не обнаруживаются, однако в редких случаях также выделяется S. pneumoniae. В 1—5 % случаев заболеваний респираторным микоплазмозом требуется госпитализация. Микоплазменная пневмония сопровождается частым мучительным и продолжительным кашлем со скудной вязкой мокротой, которая плохо эвакуируется, отмечаются боли в грудной клетке, может развиться обструкция бронхов. Интоксикация нерезко выражена. Физикальные изменения в лёгких отсутствуют или слабо выражены. Рентгенологическая картина весьма вариабельна. В большинстве случаев выявляются поражения интерстиция, у части больных пневмония протекает по типу очаговой или сегментарной, иногда воспалительные изменения носят смешанный характер. Явления лёгочной недостаточности нехарактерны для микоплазменной пневмонии. Микоплазменная пневмония обычно имеет благоприятное течение, в редких случаях течение очень тяжёлое. Диагностика микоплазменной пневмонии только на основании клинических или рентгенологических данных невозможна, поскольку не имеет патогномонических черт. Основная роль в подтверждении микоплазменной этиологии пневмонии отводится лабораторной этиологической диагностике. Для этиологической диагностики микоплазменной пневмонии применяют: обнаружение ДНК M. pneumoniae методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), основным методом для прямого выявления ДНК M. рneumoniae является на настоящий момент стандартная полимеразная цепная реакция (ПЦР) с детекцией методом электрофоретического разделения ДНК, однако наибольшей специфичностью и чувствительностью обладает ПЦР с детекцией в режиме реального времени (ПЦР-РВ); выявление антигена микоплазм в реакции прямой иммунофлуоресценции (РИФ); серологические исследования по обнаружению специфических антител класса IgM и IgG к M. pneumoniae в сыворотках крови методом иммуноферментного анализа (ИФА). Mycoplasmapneumoniae относится к трудно культивируемым микроорганизмам; процесс выделения занимает 3—5 недель, поэтому культуральный метод не может быть рекомендован для использования диагностическими лабораториями. С целью быстрой этиологической диагностики пневмонии рекомендуется использовать ПЦР при исследовании биологического материала, полученного из нижних дыхательных путей (мокрота при глубоком откашливании, аспираты из трахеи, мокрота, полученная в результате индукции посредством ингаляции гипертонического раствора натрия хлорида, жидкость бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ), получаемая с помощью фибробронхоскопии). При получении положительного результата ПЦР при исследовании биологического материала, полученного из нижних дыхательных путей, этиология пневмонии считается установленной. При невозможности получения биологического материала из нижних дыхательных путей для ПЦР допустимо использовать мазки из верхних дыхательных путей (объединенный мазок из носоглотки и задней стенки глотки), и при получении положительного результата следует считать этиологию пневмонии предположительно установленной. Однако получение отрицательного результата ПЦР при исследовании мазков из верхних дыхательных путей не может свидетельствовать об отсутствии микоплазменной инфекции. В этом случае рекомендуется серологическая диагностика с учетом совокупности результатов по обнаружению специфических антител классов IgM и IgG в парных сыворотках, исследуемых одновременно. С целью ретроспективной диагностики, когда больной уже находится в стадии реконвалесценции, необходимо использовать серологические исследования. Первичный иммунный ответ характеризуется синтезом IgM-антител через 1—3 недели с момента заражения, обнаружение которых свидетельствует об острой фазе инфекции. Иммуноглобулины классов G появляются к концу 3—4 недели. Диагноз микоплазменной респираторной инфекции подтверждает 4-кратная сероконверсия специфических антител в парных сыворотках крови. Непосредственное обнаружение антигенов M. рneumoniae в различных биосубстратах (мазки из носоглотки, лаважная жидкость, биоптаты), полученных от больных с респираторной патологией, до настоящего времени в отдельных диагностических лабораториях проводят с использованием РИФ. Этот метод в сочетании с выявлением специфических антител к микоплазме в ИФА дает возможность подтвердить заболевание, вызванное Mycoplasma pneumoniae. Следует учитывать, что гуморальные антитела сохраняются несколько лет. Для достоверной и окончательной этиологической диагностики микоплазменной пневмонии с учетом возможности персистенции данного возбудителя в организме человека без выраженных клинических проявлений рекомендуется дополнительное подтверждение установленного диагноза каким-либо из перечисленных выше методов. 6.4. Диагностика пневмонии, вызванной Chlamydophila pneumoniae Chlamydophilapneumoniae – патогенная для человека грамотрицательная бактерия с облигатным внутриклеточным типом паразитирования, обладает тропизмом к клеткам столбчатого цилиндрического эпителия слизистых оболочек человека, в частности, к эпителию бронхиол, бронхов, а также к альвеолярным макрофагам, моноцитам. Для C. pneumoniae-инфекции характерна генерализация процесса, вследствие чего возбудитель может инфицировать эндотелиальные клетки сосудов, синовиальные клетки, гепатоциты и ткани нервной системы. C. pneumoniae вызывает пневмонии различной тяжести, длительно протекающие бронхиты, фарингиты, синуситы. Пневмония, вызванная C. pneumoniae обычно имеет благоприятное течение, в редких случаях течение очень тяжёлое. Микст-инфекция, например сочетание с пневмококком или наличие тяжелых сопутствующих заболеваний, особенно у пожилых лиц, осложняет течение заболевания и увеличивает риск летального исхода. Нередко инфекция протекает малосимптомно. В группу риска попадают все возраста, но частота заболеваемости хламидийной пневмонией выше у детей школьного возраста. Заболеваемость среди мужчин выше, чем среди женщин. Эпидемические вспышки происходят каждые 4—10 лет. Описаны эпидемиологические вспышки в изолированных и полуизолированных коллективах, случаи внутрисемейной передачи хламидийной инфекции. Ни один из известных в настоящее время методов диагностики хламидийной пневмонии не обеспечивает 100 %-ю надежность выявления возбудителя, что диктует необходимость сочетания не менее двух методов. Микробиологическое выделение C. pneumoniae имеет ограниченное применение ввиду того, что является длительным и трудоемким процессом, характеризуется низкой чувствительностью и доступно только специализированным лабораториям. Однако в случае выделения жизнеспособного возбудителя диагноз может быть поставлен с наибольшей достоверностью без необходимости применения подтверждающих тестов. Культуральное выделение указывает на активный инфекционный процесс, так как при персистентной инфекции возбудитель переходит в некультивируемое состояние. Наиболее специфичным и чувствительным методом выявления возбудителя является ПЦР-диагностика. Высокая чувствительность и отсутствие ложноположительных результатов могут быть обеспечены использованием только лицензированных наборов для эффективного выделения ДНК из клинического материала и наборов для постановки ПЦР современного поколения на основе ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ). Метод не дает возможность дифференцировать острую и хроническую инфекцию. С целью быстрой этиологической диагностики пневмонии рекомендуется использовать ПЦР при исследовании биологического материала, полученного из нижних дыхательных путей (мокрота при глубоком откашливании, аспираты из трахеи, мокрота, полученная в результате индукции посредством ингаляции гипертонического раствора натрия хлорида, жидкость бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ), получаемая с помощью фибробронхоскопии). Серологические тесты применяют для ретроспективной диагностики и ретроспективного анализа природы эпидемических вспышек. При получении положительного результата ПЦР при исследовании биологического материала, полученного из нижних дыхательных путей, этиология пневмонии считается установленной. Однако при пневмониях, вызванных Chlamydophila (Chlamydia) pneumoniae, кашель часто бывает непродуктивным, в таких случаях для ПЦР рекомендуется использовать мазки из верхних дыхательных путей (объединенный мазок из носоглотки и задней стенки глотки), и при получении положительного результата следует считать этиологию пневмонии предположительно установленной. При получении отрицательного результата ПЦР при исследовании мазков из верхних дыхательных путей при подозрении на инфекцию, вызванную C. pneumoniae, на основании эпидемиологических или клинических данных рекомендуется серологическая диагностика с учетом совокупности результатов по обнаружению специфических антител классов IgM и IgG в парных сыворотках, исследуемых одновременно. С целью ретроспективной диагностики, когда больной находится в стадии реконвалесценции, необходимо использовать серологические исследования. В настоящее время для обнаружения специфических IgM-, и IgG-антител к C. pneumoniae используют метод иммуноферментного анализа (ИФА) или реакцию иммунофлюоресценции (РИФ). Определены серологические критерии острой C. pneumoniae-инфекции: 4-кратное нарастание титров IgG-антител в парных сыворотках или однократное выявление IgM-антител в титре ≥ 1 : 16. Для достоверной и окончательной этиологической диагностики хламидийной пневмонии с учетом возможности персистенции данного возбудителя в организме человека без выраженных клинических проявлений рекомендуется дополнительное подтверждение установленного диагноза каким-либо из перечисленных выше методов. 6.5. Диагностика пневмонии, вызванной Legionella pneumonia В связи со сходством клинических проявлений и симптоматики легионеллезной и пневмококковой пневмонии быстрая и эффективная лабораторная диагностика приобретает решающее значение для выбора тактики этиотропной терапии больных. В 1999 г. ВОЗ и в 2002 г. Европейской рабочей группой по легионеллезу в качестве диагностических критериев приняты стандарты, в соответствии с которыми диагноз легионеллеза в случае острой инфекции нижних дыхательных путей (клинически и рентгенологически подтвержденной) считается установленным: 1) при выделении культуры легионелл из отделяемого респираторного тракта или легочной ткани; 2) при 4-кратном или более нарастании титра специфических антител к Legionella pneumophila серогруппа 1 в реакции непрямой иммунофлюоресценции; 3) при определении растворимого антигена Legionellapneumophila серогруппа 1 в моче иммуноферментным (ИФА) или иммунохроматографическим методом (ИХА). При отсутствии сыворотки крови, взятой в ранние сроки болезни, выявление достоверно высокого уровня антител к Legionellapneumophila серогруппа 1 (1 : 128 и выше) в одиночной сыворотке методом непрямой иммунофлюоресценции позволяет считать диагноз легионеллеза предположительно установленным. Аналогичным образом интерпретируются результаты, полученные на основании выявления возбудителя или его ДНК в респираторном секрете или легочной ткани с помощью прямой иммунофлюоресценции или ПЦР. Пункты 2 и 3 стандартов лабораторной диагностики в настоящее время распространяется только на антитела и антиген, определяемые для Legionellapneumophila серогруппы 1. Для других серогрупп Legionellapneumophila результаты, получаемые по определению антител или выявлению антигена в моче, позволяют установить лишь предполагаемый диагноз. Выделение культуры возбудителя остается единственным методом стандартов, устанавливающим окончательный диагноз в случае инфекции, вызываемой другими серогруппами Legionellapneumophila или видами Legionellaspp. В то же время следует отметить, что более 80 % спорадических и групповых случаев легионеллеза вызваны штаммами Legionellapneumophila серогруппа 1, а при эпидемических вспышках внебольничных пневмоний этиологическое значение штаммов L. pneumophila серогруппа 1 подтверждено в 96 % случаев. Основным методом стандартов, позволяющим осуществлять в настоящее время своевременную диагностику и мониторинг легионеллезной инфекции, является определение легионеллезного антигена в моче иммунохроматографическим или иммуноферементным методом. Метод позволяет окончательно подтвердить диагноз в течении 1—2 ч. Превосходство данного метода над другими, включенными в стандарт, методами состоит прежде всего в сроках исследования и доступности клинического материала. Бактериологический метод занимает не менее 4—5 суток, причем требуются инвазивные процедуры для получения материала бронхоскопии, биопсии, так как из мокроты, особенно после начала этиотропной терапии, возбудитель удается выделить далеко не всегда. Выявление диагностического нарастания титров антител в реакции непрямой иммунофлюоресценции возможно лишь на 3-й неделе заболевания, когда проведен курс антибиотикотерапии и исход заболевания обычно ясен. Необходимость исследования парных сывороток определяет ретроспективный характер диагностики легионеллеза данным методом. Метод ПЦР может быть рекомендован прежде всего для исследования БАЛ или биопсии при подозрении на легионеллезную пневмонию у иммунокомпрометированных больных. Если у данной категории больных инфекция вызвана штаммами L. pneumophila, не принадлежащими к серогруппе 1, то данный метод является единственным, позволяющим быстро установить диагноз. 6.6. Диагностика пневмонии, вызванной Pneumocystis jiroveci Пневмоцистоз, как правило, протекает в виде острых респираторных заболеваний, обострений хронических бронхолегочных заболеваний, обструктивного бронхита, ларингита, а также по типу пневмоний с нарушениями газообмена (интерстициальных пневмоний). Типичная рентгенологическая картинапри пневмоцистной пневмонии представлена двусторонней прикорневой интерстициальной инфильтрацией легочной ткани с нарастающей интенсивностью и большим объемом поражения в прямой зависимости с прогрессированием болезни. Реже встречаются единичные и множественные уплотнения легочной ткани, верхнедолевые инфильтраты и пневмоторакс. Плеврит и увеличение внутригрудных лимфатических узлов встречаются достаточно редко. При отсутствии патологии на рентгенограммах, КТ высокого разрешения может обнаруживать изменения по типу матового стекла или ячеистой деформации легочного рисунка. У взрослых пневмоцистная пневмония, как правило, развивается на фоне вторичного иммунодефицита. Инкубационный период краткий – от 2 до 5 суток, начало – острое. Пневмоцистная пневмония может развиться у больных, получающих иммуносупрессивную терапию (кортикостероиды). При медикаментозной иммуносупрессии это заболевание проявляется на фоне снижения дозы кортикостероидов. Продромальный период обычно продолжается 1—2 недели; у больных СПИД – 10 дней. Пневмоцистная пневмония при СПИД, как правило, характеризуется вялым хроническим процессом. Первоначально аускультативная симптоматика не выявляется. К летальному исходу приводит дыхательная недостаточность, связанная с резким нарушением вентиляции легких и газообмена. Возможны также абсцессы, спонтанный пневмоторакс и экссудативный плеврит. Пневмоцистоз у детей развивается обычно на 4—6-м месяце жизни, когда иммунная система новорожденного еще полностью не сформировалась. Наиболее подвержены этому заболеванию недоношенные, больные рахитом, с гипотрофией и поражениями ЦНС. У детей раннего возраста пневмоцистоз протекает как классическая интерстициальная пневмония с четкими стадиями патологических процессов. На основании морфологических изменений при манифестном течении заболевания выделяют три стадии пораженного легкого: отечная (7—10 дней); ателектатическая (до 4 недель); эмфизематозная (ее продолжительность вариабельна). Группами риска в отношении инфицированности Pneumocystisjiroveci являются: дети недоношенные, ослабленные новорожденные и дети раннего возраста с гипогаммаглобулинемией, гипотрофией и рахитом; больные лейкозом, онкологические больные, реципиенты органов, получающие иммунодепрессанты; больные туберкулезом, цитомегалией и другими инфекциями; ВИЧ-инфицированные. Для диагностики пневмоцистоза необходимо использовать комплекс лабораторных методов исследования, включающий паразитологический, иммунологические методы и ПЦР-диагностику. Для окраски паразитологических препаратов с целью выявления Pneumocystisjiroveci используют классические методы: импрегнация метенамин-серебряным нитратом по Гомори, окраска толуидиновым синим, гематоксилином и эозином, по Грамму и раствором Шиффа, а также методом Романовского-Гимза. Наиболее универсальным для выявления цист, трофозоитов и спорозоитов является метод Романовского-Гимза. Витальная окраска нейтральным красным также позволяет выявить возбудителя в активной фазе. Все перечисленные методы окраски требуют высокой квалификации исследователя для точной идентификации Pneumocystisjiroveci; к тому же эти методы служат лишь для индикации и направлены на общие грибные полисахариды оболочки цист. Иммунофлюоресцентный метод (РИФ) для выявления цист и трофозоитов с использованием моноклональных или поликлональных антител в лаважной жидкости обладает более высокой специфичностью и чувствительностью, нежели гистохимическое окрашивание препаратов. Иммунологический метод, выявляющий специфические антитела классов IgG и IgM (ИФА), также играет значительную роль в диагностике пневмоцистоза, особенно при диагностике, когда у больного невозможно взять лаважную жидкость или мокроту. Антитела класса G среди здорового населения выявляют достаточно часто (60—80 %). Поэтому исследование антител должно происходить в динамике при обязательном титровании сыворотки. Выявление 4-кратного нарастания IgG и/или определение антител IgM против Pneumocystisjiroveci говорит об остром инфекционном процессе, вызванном этим возбудителем. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) является одним из высокочувствительных методов диагностики, позволяющим выявлять единичные клетки или фрагменты ДНК возбудителя Pneumocystisjiroveci в мокроте или бронхоальвеолярном лаваже. Для достоверной этиологической диагностики пневмоцистной пневмонии с учетом возможности персистенции данного возбудителя в организме человека без выраженных клинических проявлений рекомендуется комплексное исследование: на основе методов прямого выявления возбудителя (паразитологическим методом, РИФ или ПЦР) и определения серологических маркеров в динамике. 6.7. Диагностика вирусных и вирусно-бактериальных пневмоний Вирусную или вирусно-бактериальную этиологию пневмонии у взрослых можно подозревать во время подъема заболеваемости гриппом и ОРВИ, а также при возникновении групповых случаев заболевания в течение месяца после формирования закрытых и полузакрытых коллективов. В группу риска тяжелого течения вирусных пневмоний входят лица, страдающие сердечной недостаточностью и хроническими заболеваниями бронхолегочной системы. Сопутствующей патологией при тяжелом течении гриппа являются также ожирение, сахарный диабет, состояние беременности, особенно в третьем триместре. Основными возбудителями вирусных и вирусно-бактериальных пневмоний у иммунокомпетентных взрослых считают вирусы гриппа А и В, аденовирусы, РС-вирус, вирусы парагриппа; реже обнаруживается метапневмовирус. У взрослых больных гриппом в 10—15 % случаев развиваются осложнения, причем 80 % из них приходится на пневмонию. Важна диагностика вирусных инфекций при ВП у детей в этиологической структуре которых вирусные инфекции играют существенную роль. Современные методы этиологической диагностики острых вирусных инфекций дыхательных путей основаны прежде всего: на выявлении РНК/ДНК возбудителей методами амплификации нуклеиновых кислот, в частности, с помощью наиболее широко используемой ПЦР; на обнаружении антигенов методами иммунохроматографии (ИХА), иммуноферментного анализа (ИФА), иммунофлюоресценции (РИФ). Сохраняют значение в основном для ретроспективной диагностики методы по обнаружению специфических антител в сыворотке крови (реакция связывания комплемента (РСК), реакция нейтрализации (РН), реакция торможения гемагглютиниции (РТГА), реакция непрямой гемагглютинации (РНГА), иммуноферментный анализ (ИФА)). Культивирование возможно для вирусов гриппа А и В, респираторно-синцитиального вируса, вирусов парагриппа 1—3-го типов, метапневмовируса человека и аденовирусов. Культуральные исследования отличаются трудоемкостью и продолжительностью, в рутинной практике используется только при мониторинге гриппа, при этом первоначальное обнаружение положительных образцов проводится в ПЦР, далее проводится выделение в культуре. Реакции иммунофлюоресценции позволяют обнаруживать антигены вирусов гриппа, респираторно-синцитиального вируса, вирусов парагриппа 1—3 и аденовирусов. Материал для исследований методом иммунофлуоресценции необходимо собирать не позднее трех дней от начала респираторной инфекции (в острой фазе заболевания, поскольку метод наиболее эффективен, когда внутриклеточное содержание вирусных антигенов бывает наиболее высоким), что делает данный метод малоинформативным для этиологической диагностики пневмоний. Помимо этого метод отличается субъективностью при интерпретации результатов анализа. Серологические тесты обнаруживают антитела к респираторно-синцитиальному вирусу (РН, РСК, РНГА, ИФА), вирусам парагриппа 1—4 (РТГА, РСК, ИФА), аденовирусам (ИФА), риновирусам (РСК); исследование, как правило, носит ретроспективный характер. По сравнению с РСК ИФА отличается большей чувствительностью. При интерпретации оценивают изменение титра специфических антител в динамике в парных сыворотках (полученных с интервалом в 2 недели), и их результаты в значительной степени зависят от состояния иммунной системы пациента. Признанным доказательством первично вирусной пневмонии (или смешанной вирусно-бактериальной пневмонии) согласно международным критериям (ESCMID 2011, BTS, 2009—2011), служит обнаружение нуклеиновых кислот вируса гриппа или другого респираторного вируса методом ПЦР. Чаще для диагностики используются мазки из носоглотки и с задней стенки глотки, при этом наибольшей чувствительности вследствие большего содержания вирусов в исследуемом образце удается добиться при комбинации мазков из обоих локусов. С этой целью, мазки у пациента берут двумя разными зондами со слизистой нижнего носового хода, а затем с задней стенки ротоглотки, при этом тампоны с обоих зондов после взятия мазков последовательно отламываются в одну пробирку. Однако, в случае вирусов гриппа, реплицирующихся в ткани легких (A/H5N1, A/H1N1pdm2009) на второй неделе пневмонии концентрация вируса в мазках уже может быть недостаточной для его обнаружения, особенно при неадекватном заборе материала. Кроме того, с целью одновременного обнаружения как вирусных, так и бактериальных агентов, целесообразно использовать материал нижних дыхательных путей (мокрота при глубоком откашливании, мокрота, полученная в результате индукции посредством ингаляции гипертонического раствора натрия хлорида, аспираты из трахеи, жидкость бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ), получаемая с помощью фибробронхоскопии). Для идентификации наиболее значимых возбудителей острых респираторных вирусных инфекций: вирусы гриппа А и В, РС-вирус, метапневмовирус, вирусы парагриппа 1—4, коронавирусы (229E, OC43, NL63, HKUI), риновирусы, аденовирусы (В, С, Е), бокавирус доступны наборы реагентов для ПЦР в форматах с электрофоретической детекцией, детекцией по конечной точке флуоресценции, а также с детекцией накопления продуктов амплификации в режиме «реального времени» (ПЦР-РВ). Максимального уровня специфичности и чувствительности достигают тесты на основе ПЦР в режиме реального времени, преимуществом обладают тесты с одновременным определением нескольких возбудителей. Использование в качестве мишеней специфичных консервативных участков генома вирусов обусловливает высокие показатели диагностической чувствительности и специфичности ПЦР, приближающиеся к 100 %, по сравнению с культуральным исследованием. При диагностике гриппа реализуется возможность определения субтипа вирусов гриппа А, в том числе – высокопатогенного вируса гриппа птиц А/H5N1 и нового пандемического варианта A/H1N1pdm2009, так называемого вируса гриппа свиней. Полимеразная цепная реакция в формате электрофоретической детекции требует особых мер предотвращения контаминации (ложноположительных результатов), достигаемых проведением специальных мероприятий и соблюдением особых правил организации лаборатории согласно МУ 1.3.2569—09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I—IV групп патогенности». Этиологию «пневмонии, вызванной вирусом гриппа», следует считать установленной в случае обнаружения методом ПЦР РНК вируса гриппа (или в сочетании с другими вирусами) в материале нижних дыхательных путей при отрицательном результате бактериологического исследования крови (или при отсутствии ДНК бактериальных возбудителей пневмоний в крови по результатам ПЦР, или при обнаружении незначимых концентраций ДНК в материале нижних дыхательных путей в количественной ПЦР). При невозможности получения материала нижних дыхательных путей гриппозная этиология пневмонии с большой долей вероятности может быть доказана в случае обнаружения РНК вируса гриппа в мазках из носоглотки и ротоглотки. Этиология пневмонии, вызванной другими респираторными вирусами, считается установленной в случае обнаружения методом ПЦР РНК/ДНК одного респираторного вируса (или одновременно нескольких вирусов) в материале нижних дыхательных путей при отрицательном результате бактериологического исследования крови (или при отсутствии ДНК бактериальных возбудителей пневмоний в крови по результатам ПЦР, или при обнаружении незначимых концентраций ДНК в материале нижних дыхательных путей в количественной ПЦР). Вирусная этиология пневмонии считается предположительно установленной в случае обнаружения методом ПЦР РНК/ДНК одного респираторного вируса (или одновременно нескольких вирусов) в мазках из носоглотки и ротоглотки при отрицательном результате бактериологического исследования крови (или при отсутствии ДНК бактериальных возбудителей пневмоний в крови по результатам ПЦР, или при обнаружении незначимых концентраций ДНК в материале нижних дыхательных путей в количественной ПЦР), а также если бактериологические исследования не проводились. Вирусная этиология пневмонии считается предположительно установленной в случае обнаружения методом РИФ антигенов одного респираторного вируса (или одновременно нескольких вирусов) при отрицательном результате бактериологического исследования крови (или при отсутствии ДНК бактериальных возбудителей пневмоний в крови по результатам ПЦР, или при обнаружении незначимых концентраций ДНК в материале нижних дыхательных путей в количественной ПЦР), а также если бактериологические исследования не проводились. Вирусно-бактериальная этиология пневмонии считается установленной в случае обнаружения методом ПЦР РНК/ДНК одного вируса (или одновременно нескольких вирусов) в материале нижних дыхательных путей при положительном результате бактериологического исследования крови (или обнаружении ДНК значимых концентраций в крови или в материале нижних дыхательных путей в количественной ПЦР). Вирусно-бактериальная этиология пневмонии считается предположительно установленной в случае обнаружения методом РИФ или ИХА антигенов одного респираторного вируса (или одновременно нескольких вирусов) при положительном результате бактериологического исследования крови (или обнаружении ДНК значимых концентраций в крови или в материале нижних дыхательных путей в количественной ПЦР). Результаты серологических исследований позволяют судить о наличии или отсутствии вирусной инфекции, на фоне которой развилась пневмония. 6.8. Дифференциальная диагностика с зоонозными заболеваниями, вызывающими поражения легких, и туберкулезом Дифференциальная диагностика с зоонозными заболеваниями, вызывающими поражения легких (орнитоз, лихорадка Ку, туляремия и др.) проводится по эпидемиологическим показателям и в эндемичных для данных возбудителей регионах в соответствии с санитарными правилами «Профилактика орнитоза», «Профилактика лихорадки Ку», «Профилактика туляремии». Дифференциальная диагностика с туберкулезом является также важным и необходимым компонентом обследования больных тяжелыми пневмониями. 7. Алгоритм диагностики внебольничных пневмоний Алгоритм лабораторной диагностики типичной ВП (у пациентов с отсутствием выраженных нарушений иммунитета) различен для пневмоний тяжелого и нетяжелого течения, для пациентов с выраженными нарушениями иммунитета и детей. Своевременная этиологическая диагностика ВП особенно важна при пневмониях тяжелого течения у пациентов, госпитализированных в ОРИТ. При тяжелых пневмониях в первую очередь необходимо провести бактериологическое исследование на пневмококк и другие бактериальные этиологические агенты с учетом спектра их чувствительности к антибиотикам, а также исключить легионеллезную этиологию с помощью экспресс-теста на определение антигена легионелл в моче пациентов. Во время подъема заболеваемости гриппом и ОРВИ достаточно высока вероятность тяжелых пневмоний вирусной или вирусно-бактериальной природы. В этом случае алгоритм диагностики тяжелых пневмоний должен учитывать возможность бактериальной, вирусной или вирусно-бактериальной этиологии. Недооценка на этапе лабораторной диагностики любого из вышеупомянутых этиологических вариантов тяжелых пневмоний у пациентов ОРИТ может привести к летальным исходам. Летальность при тяжелых ВП может составлять 25—50 %. Термин «нетяжелая пневмония» используется для пневмоний, лечение которых проводится амбулаторно или в условиях стационара, но не требует госпитализации в ОРИТ. При отсутствии адекватной своевременной терапии нетяжелая пневмония может привести к серьезным осложнениям и хроническим заболеваниям бронхолегочной системы. Летальность при этом может составлять от 1 до 10 %. Наряду с бактериологическим исследованием на пневмококк и другие бактериальные этиологические агенты, с учетом спектра их чувствительности к антибиотикам, диагностика нетяжелых пневмоний должна учитывать возможность микоплазменной или хламидийной этиологии. Во время подъема заболеваемости гриппом и ОРВИ высока вероятность нетяжелых пневмоний вирусной, а также микст-инфекции упомянутых вирусов с бактериями, хламидиями или микоплазмами. Требует расширенного анализа этиологической структуры ВП у пациентов с выраженными нарушениями иммунитета (синдром приобретенного иммунодефицита, прочие заболевания или патологические состояния). Помимо бактериологического исследования на пневмококк, другие бактериальные этиологические агенты, с учетом спектра их чувствительности к антибиотикам, и легионеллы для данной группы пациентов высока вероятность развития пневмонии, вызванной «оппортунистическими этиологическими агентами», прежде всего Pneumocystisjiroveci, а также цитомегаловирусом, грибами, вирусом герпеса. Дифференциальная диагностика с туберкулезом и другими микобактериозами является также важным и необходимым компонентом обследования пациентов с ВП, имеющими выраженные нарушениями иммунитета. Для исключения легионеллезной этиологии пневмоний у иммунокомпрометированных больных проводится исследование бронхоальвеолярного лаважа или биопсии с помощью бактериологического метода, или ПЦР на L. pneumophilaсерогруппы 2—15 и Legionellaspp. При ВП у детей наиболее выражена полиэтиологичность, что необходимо учитывать в процессе лабораторной диагностики. Наряду с бактериологическим исследованием на пневмококк и другие бактериальные этиологические агенты, с учетом спектра их чувствительности к антибиотикам, диагностика пневмоний у детей должна учитывать широкий спектр респираторных вирусов, причем не только во время эпидемических подъемов заболеваемости гриппом и ОРВИ (вирусы гриппа, РС-вирус, метапневмовирус, вирусы парагриппа, аденовирусы, коронавирусы, бокавирус, риновирусы), а также этиологическую роль микоплазм и хламидий. При ВП у детей высока вероятность смешанной бактериально-вирусной инфекции, включая смешанную инфекцию с хламидиями и микоплазмами. 8. Контроль качества лабораторных исследований Обязательным компонентом современной лабораторной диагностики является система качества лабораторных исследований и обеспечение ее функционирования. Система качества включает внутренний контроль на этапах лабораторного исследования и внешний контроль. Внутренний контроль качества микробиологических исследований – комплекс выполняемых лабораторией мероприятий и процедур, направленных на предупреждение неблагоприятного воздействия факторов, возникающих в процессе подготовки, выполнения и оценки результатов анализа, способных повлиять на достоверность результата. Внутренний контроль качества включает: 1. Контроль за соблюдением требований к условиям проведения анализа: (лабораторные помещения, воздушная среда, температурные режимы инкубации и хранения, режимы дезинфекции и стерилизации и т. д.). 2. Выполнение процедуры ведения эталонных бактериальных культур. 3. Контроль качества питательных сред. 4. Контроль качества тест-систем и реагентов. 5. Контроль качества дистиллированной воды. Структура организации внутреннего контроля качества, периодичность и частота выполняемых процедур устанавливается действующей в лаборатории системой менеджмента качества в соответствии с ГОСТ ИСО/МЭК 17025 и ГОСТ Р ИСО 15189. Документальное оформление результатов проведенных контрольных процедур осуществляется по утвержденным действующей системой менеджмента качества формам. Регистрация и хранение контрольных результатов могут осуществляться на электронных носителях. Обязательным разделом внутреннего контроля качества является проведение периодического, но не реже 1 раза в год, анализа результатов выполненных контрольных процедур, с учетом которого осуществляется корректировка руководства по качеству испытательной лаборатории. Обеспечение внутреннего контроля качества молекулярно-генетических (ПЦР) исследований дополнительно проводят в соответствии с МУ 1.3.2569—09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I—IV групп патогенности». Внешний контроль качества осуществляется в соответствии с требованиями ГОСТ ИСО/МЭК 17025 и ГОСТ Р ИСО 15189 в форме участия в межлабораторных сравнительных испытаниях (МСИ) и/или программах проверки квалификации по показателям и с периодичностью в соответствии с установленными требованиями и потребностью лабораторий. 9. Требования безопасности Исследования биологического (клинического) материала проводят в соответствии с действующими нормативными правовыми и методическими документами в отношении работы с микроорганизмами III—IV и I—II групп патогенности в зависимости от вида предполагаемого возбудителя. Приложение Правила получения биологического материала С целью выяснения этиологического агента (агентов) инфекции нижних дыхательных путей при подозрении на ВП исследуется мокрота при глубоком откашливании, мокрота, полученная при индукции ингаляцией стерильного 5 %-го раствора натрия хлорида через небулайзер, мокрота, полученная аспирацией из трахеи с помощью хирургического вакуумного или электрического отсоса, бронхоальвеолярный лаваж (БАЛ), получаемый с помощью фибробронхоскопии, а также кровь и плевральная жидкость. В случае невозможности получения материала из нижних дыхательных путей при исследовании на респираторные вирусы, микоплазму и хламидию допустимо использование мазков из верхних дыхательных путей (из нижнего носового хода и с задней стенки глотки), которые берут у пациента как можно раньше от момента появления симптомов ОРЗ в одну пробирку и исследуют как один образец. При подозрении на легионеллезную или паразитарную этиологию инфекции нижних дыхательных путей исследуются прижизненный БАЛ или биоптаты ткани легких. У госпитализированных пациентов материал для исследования следует собирать как можно раньше при поступлении (не позднее вторых суток), поскольку в более поздние сроки не исключена возможность суперинфекции при контакте с другими пациентами. Сбор биологического материала для бактериологического исследования следует проводить до назначения антибиотиков. В случае летального исхода исследуется посмертный (аутопсийный) материал. |