Санитарная микробиология. Министерство сельского хозяйства и продовольствия российской федерации
 Скачать 248 Kb.
|
|
Вопросы для самоподготовки. Инфекционные заболевания, связанные с употреблением зараженных пищевых продуктов. Характеристика токсикоинфекций и бактериальных интоксикаций. Идентификация условно-патогенных микроорганизмов, выделенных из пищевых продуктов. Показательные микроорганизмы для бактериологического контроля качества дезинфекции. САНИТАРНО-МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПОЧВЫ Задание 1. Закончить определение коли-титра почвы бродильным методом: изучить характер колоний на среде Эндо, из подозрительных колоний сделать мазки, окрасить по Граму, микроскопировать. Материалы и оборудование. Посевы на среде Эндо, сделанные студентами на занятии 3. Методические указания к выполнению работы. Результаты внести в табл. 41, дать заключение о коли-титре почвы по положительному результату в последнем разведении. САНИТАРНО-МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ Задание 2. Закончить определение общего микробного обсеменения молока (или мороженого), подсчитать количество колоний, выросших на чашках с мясопептонным агаром, и определить количество микробов в 1 мл или 1 г продукта, результаты записать в табл. 43, дать заключение (см. табл. 45). Материалы и оборудование. Посевы на мясопептонном агаре, сделанные студентами на занятии 3, счетная камера. Методические указания к выполнению работы. Учет результатов общего микробного числа молока проводится так же, как и при определении микробного числа воды. Задание 3. Продолжить определение коли-титра молока или мороженого (II этап): учесть результаты брожения в среде Кесслера, записать в табл. 44, сделать пересев из пробирок со средой Кесслера на среду Эндо. Материалы и оборудование.Посевы на среде Кесслера, сделанные студентами на занятии 3, чашка Петри со средой Эндо. Методические указания к выполнению работы. Из пробирок, где обнаруживается брожение (газ в поплавке), производят высев на сектора среды Эндо в чашках Петри. Чашки выдерживают сутки при 37°С. ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ПИЩЕВЫХ ТОКСИКОИНФЕКЦИЙ Задание 4. Продолжить лабораторную диагностику пищевых бактериальных отравлений (II этап): изучить характер роста на селенитовом бульоне, среде Эндо, висмут-сульфитной среде (выделение сальмонелл и эшерихий), скошенном агаре (выделение протея), на среде Китта—Тароцци (выделение клостридий), в 6,5% солевом бульоне, кровяном агаре, молочно-солевом или жел-точно-солевом агаре (выделение патогенных стафилококков); результаты сравнить с данными табл. 46 и записать в протоколе исследования. Колонии, характерные для сальмонелл, пересеять на среду Ресселя. Из колоний, выросших на молочно-солевом агаре, приготовить мазки, окрасить по Граму, микроскопировать. Колонии грамположительных кокков отсеять на скошенный мясопептон-ный агар для выделения чистой культуры. Материалы и оборудование. Посевы, сделанные студентами на занятии 3, пробирка со средой Ресселя, ингредиенты для окраски по Граму, пробирка со скошенным мясопептон-ным агаром. Методические указания к выполнению работы. С а л ь м о н е л л ы образуют на среде Эндо бесцветные или розоватым оттенком колонии, а на висмут-сульфитном агаре — серо-зеленые колонии с черным центром и подкрашенной в черный цвет средой под колонией. В случае отсутствия роста колоний, характерных для сальмонелл, делают высев на эти же среды из селенитового бульона. Колонии, характерные для сальмонелл, пересевают на среду Ресселя штрихом по скошенной поверхности и уколом в столбик среды. При росте сальмонелл исходный цвет скошенной поверхности среды не изменяется, изменяется только цвет столбика среды. Газообразование определяют по разрыву столбика. На свежескошенном мясопептонном агаре б а к т е р и и р о д а п р о т е я образуют вуалеобразный налет с голубоватым оттенком» издают неприятный гнилостный запах. Для установления вида протея применяют соответствующие агглютинирующие сыворотки. Со сред Китта — Тароцци для обнаружения клостридий проводят бактериоскопию мазков, окрашенных по Граму. Подтверждающим исследованием является также высев 1—2 капель культуры в расплавленную и остуженную до 45°С среду Вильсона — Блера, которую выливают в стерильную чашку Петри и после застывания заливают слоем голодного агара толщиной не менее 5 мм. Рост колоний черного цвета указывает на присутствие клостридий. При обнаружении с т а ф и л о к о к к о в окрашивают по Граму мазки из колоний, выросших на молочно-солевой среде. Колонии грамположительных кокков отсевают на скошенный мясопептонный агар (выделение чистой культуры) и подращивают сутки при температуре 37°С. Выделенную чистую культуру стафилококков испытывают на плазмокоагулазу (посев в плазму), которая вызывает образование сгустка, и лецитовителлазу (посев на желточно-солевой агар) — по образованию вокруг колоний матового коагулянта в результате действия фермента на лецитовителлин желтка. При отсутствии роста коагулазоположительных стафилококков на молочно-солевом агаре исследуют колонии, выделенные со сред обогащения. Для этого производят высев из сред обогащения на сектора плотных питательных сред (кровяной агар, желточно-солевой агар). Колонии коагулазоположительных стафилококков подлежат подсчету и перерасчету на 1 г продукта. БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА ДЕЗИНФЕКЦИИ Задание 5. Взять пробы смывов для бактериологического исследования качества дезинфекции. Произвести посевы на среду Материалы и оборудование. Пробирки, дезинфектанты, стерильная вода, вата, чашки Петри с питательными средами. Методические указания к выполнению работы. Студенты разбиваются на бригады по 3 человека, проводят визуальную проверку качества проведенной дезинфекции, берут пробы для бактериологического анализа. О качестве профилактической и вынужденной дезинфекции при сальмонеллезных инфекциях, роже свиней, бруцеллезе, чуме свиней и птиц, при ящуре судят по наличию или отсутствию на объектах, подвергнутых дезинфекции, кишечной палочки, а при туберкулезе, ящуре (заключительная дезинфекция), оспе овец и птиц, лептоспирозе, вирусном гепатите утят — стафилококков. По истечении определенной экспозиции (в зависимости от вида дезинфекции — текущая, заключительная и характера инфекции) берут пробы с пола, стен, углов, кормушек — всего с 10—20 разных участков. При взятии пробы намечают участок 10х10 см и стерильным ватным тампоном, предварительно смоченным раствором, нейтрализующим использованный дезинфектант, хорошо отжатым, протирают этот участок в течение 1—2 мин. Каждый тампон отдельно помещают в сосуд (пробирку) со стерильным нейтрализующим раствором или стерильной водой (20 мл). Для нейтрализации хлорной извести используют 0,1 %-й раствор натрия тиосульфата; для щелочных растворов—0,01 %-й раствор уксусной кислоты; для формалина — 1—2 %-й раствор нашатырного спирта (концентрация нейтрализующих растворов должна быть в 10 раз меньше концентрации растворов, применявшихся для дезинфекции). При применении креолина, лизола, серно-карболовой смеси и других дезинфектантов, при которых нет нейтрализаторов, тампоны промывают двукратно по 5—10 мин в стерильной воде. Пробы доставляются в лабораторию не позже чем через 2 ч после их взятия. К пробам пишут сопроводительную, в которой указывают: 1) хозяйство; 2) тип постройки; 3) дату и время дезинфекции; 4) дату и время взятия пробы; 5) вид дезинфекции (если текущая, то при какой болезни); 6) качество механической очистки. В лаборатории в этот же день из присланных проб делают посевы на специальные среды. Для выделения культуры кишечной палочки используют среду Эйкмапа с последующим прогреванием и высевом на среду Эндо или же высевают сразу непосредственно на среду Эндо. Кроме этого, как для выделения кишечной палочки, так и для выделения стафилококка можно пользоваться модифицированной средой Хейфеца, предложенной ВНИИВС. Посевы инкубируют в термостате при 37С в течение 24 часов. Занятие 5. Санитарно-микробиологическое исследование пищевых продуктов, лабораторная диагностика пищевых бактериальных отравлений бактериологический контроль качества дезинфекции (окончание), исследование кормов на микотоксикозы. Цель занятия. Провести заключительные санитарно-бактериологические исследования пищевых продуктов, идентифицировать возбудителей пищевых инфекций, освоить методы исследования кормов при поражении плесневыми грибами. Содержание занятия. 1. Определение коли-титра молока (окончание). 2. Исследование пищевых продуктов при пищевых отравлениях (окончание). 3. Определить качество дезинфекции по бактериологическим показателям. 4. Исследование кормов с целью диагностики микотоксикозов. Вопросы для самоподготовки. Санитарно-бактериологическое исследование продуктов, на которые нет ГОСТов. Этапы идентификации сальмонелл и стафилококков. Методика взятия проб для бактериологического контроля качества дезинфекции. Методы диагностики микотоксикозов животных. САНИТАРНО-МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ Задание 1. Закончить исследование молока или мороженого на коли-титр: изучить колонии, выросшие на среде Эндо, из характерных колоний сделать мазки, окрасить по Граму, микроскопировать, результаты записать втабл. 44, дать заключение. Материалы и оборудование. Посевы на среде Эндо, сделанные студентами на занятии 4, среда Симонса, Кеслера, жидкая среда с глюкозой. Методические указания к выполнению работы. При отсутствии роста колоний БГКП на среде Эндо считается, что молоко практически не загрязнено; коли-титр более 3,0. При росте на среде Эндо красных с металлическим блеском колоний готовят мазки и окрашивают их по Граму. При обнаружении в мазках грамотрицательных палочковидных бактерии проводится дополнительное исследование: пересев колоний на жидкую среду с глюкозой (вторая бродильная проба) и подращивание при 43°С в течение суток. Одновременно делают посев и на цитратную среду Симонса, инкубируют сутки при 37°С. Показателем фекального загрязнения служат грамотрицательные палочки, имеющие характерный рост на среде Кесслера, Эндо и жидкой среде с глюкозой, способные вызывать брожение среды Кесслера и жидкой среды с глюкозой при 43°С и не дающие роста на среде Симонса (цитратотрицательные кишечные палочки). Полученные результаты записывают в табл. 44. Задание 2. Закончить лабораторную диагностику пищевых бактериальных отравлений: 1) изучить изменения в среде Ресселя, идентифицировать сальмонеллы: поставить реакцию агглютинации на стекле с выделенной культурой и диагностическими сальмонеллезными сыворотками — поливалентной (групп АВСД), а затем адсорбированными О и Н. Результаты исследования записать в протокол; 2) изучить характер роста на скошенном мясопептонном агаре, поставить реакцию на плазмокоагулазу стафилококков, результаты исследования записать в протокол; 3) составить заключение по исследованию пищевого продукта, вызвавшего бактериальное отравление. Материалы и оборудование. Посевы на среде Ресселя и скошенном мясопептонном агаре, сделанные студентами на занятии 4; пробирки с сальмонеллезными поливалентной и адсорбированными О-сыворотка ми (4, б, 9) и Н-сыворот-ками; пробирка с цитратной плазмой. БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА ДЕЗИНФЕКЦИИ Задание 3. Закончить исследование качества дезинфекции бактериологическим методом. Оценить качество проведенной дезинфекции. Материалы и оборудование. Посевы, сделанные студентами на прошлом занятии. Методические указания к выполнению работы. Выросшие на Среде Эндо или глюкозосолевом агаре питательных средах культуру показательного микроорганизма обязательно исследуют под микроскопом. Первичное ориентировочное определение кишечной палочки производят по изменению цвета питательной среды. Так, изменение цвета среды из малинового в зеленый или салатный при ее помутнении и газообразовании свидетельствует о наличии в посевах кишечной палочки. Другие цветовые изменения среды — желтоватый, розовый, сероватый, обусловленные ростом посторонней микрофлоры, не учитываются. Профилактическая и заключительная дезинфекции признаются удовлетворительными, если нет роста показательного микроба во всех исследованных пробах, текущая – не менее чем в 90% пробах. Исследование токсичности кормов, вызванной метаболитами грибов Как уже указывалось, токсичности кормов обусловливают самые различные продукты метаболизма микроскопических грибов, довольно различно действующие на организм животных, поэтому и методы их обнаружения неодинаковы. Существуют биологические и физико-химические методы обнаружения метаболитов грибов в кормах. Биологические методы исследования Биологическими методами определяют в кормах комплекс (смесь) токсических веществ, химическая структура и биологическое действие которых на организм животных весьма различны. Из биологических тестов применяют скармливание животным, пораженного грибами корма. Исследование токсичности кормов, вызванной метаболитами грибов Как уже указывалось, токсичности кормов обусловливают самые различные продукты метаболизма микроскопических грибов, довольно различно действующие на организм животных, поэтому и методы их обнаружения неодинаковы. Существуют биологические и физико-химические методы обнаружения метаболитов грибов в кормах. Для определения токсичности корма широко практикуется кожная проба на кролике. Многие грибы продуцируют метаболиты, обладающие некробиотическими свойствами . Методика постановки кожной пробы на кролике. Приготовление экстрактов. 50 г измельченного корма помещают в булыжные патроны из фильтровальной бумаги и экстрагируют серным эфиром в течение 6 часов. Экстракт переносят в бюкс или другой сосуд и конденсируют при комнатной температуре до исчезновения запаха эфира. Токсические вещества многих известных грибов растворимы в этаноле, спирте, хлороформе и др. Например, корма, пораженные фузариями, можно экстрагировать хлороформом. Для извлечения токсических веществ из эфирной вытяжки взвешивают остаток эфирной вытяжки и содержащиеся в ней токсины растворяют этанолом в зависимости от веса сухого эфирного экстракта. Экстрагирование можно проводить в обычных 0.5-литровых банках с притертой пробкой, а из растворителей применять эфир. Экстракты из грубых кормов (соломы, сена) крошковатой КОнсистенции, поэтому перед их использованием необходимо добавить 2—3 капли растительного масла (оливкового или другого) и смешать до получения равномерной маслянистой массы. Постановка опыт а. В качестве подопытных животных берут взрослых кроликов вышесредней упитанности. Па выбритую, гладкую, не поврежденную поверхность кожи (4—5 см) кролика наносят экстракт н слегка втирают его в кожу стеклянной палочкой или шпателем. Экстракт наносят двукратно с интервалами в 24 часа в количестве 700—750 мг. Чтобы кролик не слизывал нанесенный экстракт, ему па шею надевают картонный или фанерный воротник. Занятие 39; ВОЗБУДИТЕЛИ МИКОТОКСИКОЗОВ Цель занятия. Ознакомить студентов с правилами взятия материала для исследования и методами лабораторной диагностики микотоксикозов. Материалы и оборудование. Культуры грибов . препаровальные иглы или микологические крючки, предметные стекла; таблицы и плакаты по данной теме. Самостоятельная работа. Студентам необходимо приготовить из культур грибов препараты «раздавленная капля», изучить под микроскопом и зарисовать в тетради морфоло гию грибов, а также ознакомиться со свойствами грибов. Микотоксикозы — отравления животных, возникающие при поедании кормов, содержащих токсические продукты жизнедеятельности грибов (микотоксины). К ми-котоксинам чувствительны почти все виды домашних, диких животных, птицы и рыбы. Наименование микотоксикоза происходит от названия токсина или гриба-продуцента токсина. При диагностике этих болезней наибольшее внимание уделяют обнаружению токсина, поскольку гриб-продуцент в ряде случаев к моменту исследования погибает и, кроме того, один и тот же микотоксин может синтезировать различные виды грибов. Лабораторная диагностика микотоксикозов включает токсико-биологические, микологические и физико-хими-ческие исследования. Материалом для исследования на микотоксикозы служат пробы всех кормов, входивших в суточный рацион животного в течение одного месяца до проявления болезни, а также остатки кормов из кормушек, содержимое желудочно-кишечного тракта павших животных. Отбор средних проб корма проводят ветеринарные и зооинженерные специалисты с представителями предприятий. Отобранную среднюю пробу делят на две части, упаковывают в чистые сухие стеклянные банки емкостью 2—3 л, герметически закрывают и пломбируют. Одну часть отправляют в лабораторию, другую — хранят в хозяйстве в течение одного месяца в условиях, предотвращающих порчу или вторичное загрязнение. В документе указывают цель исследования, вид кормового средства, назначение, массу всей партии корма, место отбора пробы, основные клинические признаки у больных животных. Прилагают копию акта вскрытия трупов (при гибели животных), копию экспертиз ветеринарной лаборатории об исключении инфекционных болезней и отравлений животных химическими или растительными ядами (если такие исследования были проделаны лабораторией). При токсико-биологическом исследовании определяют токсичность корма на различных биологических моделях: кроликах, аквариумных рыбах гуппи породы Винер, белых мышах или сельскохозяйственных животных. На кроликах ставят кожную пробу. К 50 г измельченного корма добавляют 150 мл диэтилового эфира (эфир для наркоза) или ацетона. Смесь встряхивают при комнатной температуре с помощью шуттель-аппарата 3 ч. Экстракт фильтруют и выпаривают до полного исчезновения запаха. Налет, оставшийся на стенках чашки» смывают небольшим количеством эфира и используют для биопробы. Биологическую пробу проводят на кроликах массой 2—2,5кг. Предварительно у кролика в области бедра, лопатки или бока выстригают участок кожи 6х6 см. Пигментированная или с признаками шелушения кожа непригодна для исследования. На одном кролике можно ставить не более 4 проб. На выстриженный участок кожи кролика наносят стеклянной лопаткой половину экстракта и легко втирают его. При восковиднюй консистенции экстракта его предварительно подогревают. Часть участка оставляют свободной от экстракта как контрольную. Через 24 ч наносят оставшийся экстракт. Чтобы предупредить слизывание его, кролику надевают воротник (не менее чем на 3 дня). Учет проводят на следующий день после повторного нанесения экстракта и продолжают вести наблюдение в течение 3—5 дней в зависимости от реакции, после чего дают окончательную оценку нетоксичный — отсутствуют воспалительная реакция и изменения на коже; корм с л а б о-т о_к си ч н ы и — шелушение кожи, отечность, болезненность, незначительное утолщение кожи с образованием отдельных корочек; корм т оксичный — резкая гиперемия, отек, утолщение кожи, болезненность, появление язвы и струпа. В качестве дополнительного теста используют метод определения токсичности кормов на аквариумных рыбах. Методика основана на извлечении микотоксинов из фураж-лого зерна, продуктов его переработки и комбикормов, экстракции хлороформом и исследовании на рыбках — гуппи. В раствор экстракта помещают независимо от пола и возраста. Ведут наблюдения в течение 24—30 ч. Оценка степени токсичности корма: нетоксичный — при гибели не более одной рыбки в течение 24 ч; с л а б о-г о к с и ч н ы и — при гибели 2—4 рыбок; токсичный— при гибели всех 5 гуппи за тот же отрезок времени. Определение токсичности корма на белых мышах. Методика основана на извлечении токсических веществ из жмыхов, кормовых дрожжей ацетоном и введении концентрированного экстракта однократно в желудок белым мышам массой 20—25 г. Наблюдают животных 3 сут, не ограничивая лх в кормлении и поении. Оценка результатов корма: н етоксичный— мыши живы, на вскрытии у убитых мышей патологоанатомических изменений нет; слаботокс и ч н ы и — мыши живы» при вскрытии у убитых обнаруживают геморрагическое воспаление желудочно-кишечного тракта, чаще очаговое; токсичный— гибнут все мыши (или одна), на вскрытии павших или убитых устанавливают геморрагическое воспаление желудочно-кишечного тракта, часто дегенерацию тканей печени, почек или кровоизлияние в паренхиматозных органах. Если токсичность корма не выявлена всеми перечисленными методами, применяют скармливание подозрительных кормов лабораторным животным (цыплятам, утятам, голубям, белым мышам, морским свинкам, кроликам) или тем видам животных которые болели в хозяйстве. Микологический анализ включает выделение и идентификацию грибов-продуцентов микотоксинов из кормов. С этой целью из кормов делают посевы в чашки Петри с агаром Чапека, сусло-агаром или в жидкую среду Билай. Грубые корма высевают во влажные камеры со средой Ван-Итерсона. Перед посевом агар расплавляют в водяной бане, после охлаждения до 45—50 °С в него для подавления роста сопутствующей микрофлоры добавляют антибиотики (пенициллин 50 тыс. ЕД и стрептомицин 100 тыс. ЕД на I л среды). Для приготовления влажной камеры со средой Зан-Итерсона на дно чашки Петри кладут тонкий слой ваты кружком фильтровальной бумаги по диаметру чашки и стерилизуют в сушильном шкафу. Перед посевом на фильтровальную бумагу наливают среду Ван-Итерсона до увлажнения бумаги, не создавая избытка влаги (около 5 мл). Для выделения грибов из зерен последние раскладывают о поверхности фильтровальной бумаги по 10 штук, чтобы ли не соприкасались одно с другим. Посевы культивируют ри 22—25 °С 3—10 дней до образования характерного спороношения, после чего проводят макро- и микроскопическое исследование культур грибов с целью идентификации. ри макроскопическом исследовании учитывают различие по цвет, форму, консистенции. Физико-химический анализ проводят с целью качественного и количественного определения микотоксинов в кормах и других материалах (люминесцентный метод, хро-матография и т. д.). |