Санитарная микробиология. Министерство сельского хозяйства и продовольствия российской федерации
 Скачать 248 Kb.
|
МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА И ПРОДОВОЛЬСТВИЯРОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИУЛЬЯНОВСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯФАКУЛЬТЕТ ВЕТЕРИНАРНОЙ МЕДИЦИНЫ кафедра микробиологии, вирусологии, эпизоотологии иветеринарно-санитарной экспертизыЗолотухин С.Н., Васильев Д.А. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ к проведению лабораторно-практических занятий по САНИТАРНОЙ МИКРОБИОЛОГИИ для студентов факультета ветеринарной медицины (специальность 310800 – ветеринария) специализация – ветеринарный врач-бактериолог Ульяновск -2000 Значение раздела. Усвоение данного раздела обеспечивает приобретение студентами знаний, необходимых при изучении последующих дисциплин санитарно-гигиенического профиля, умений пользоваться санитарно-бактериологическими методами и показателями ГОСТ в практике ветеринарных лабораторий и клиник для оценки эпизоотологической и эпидемиологической ситуаций. Цель раздела. Усвоить знания о предмете, задачах и значении санитарной микробиологии, об условно-патогенных и санитарно-показательных микроорганизмах, принципах и методах санитарно-микробиологического исследования воздуха, воды, почвы, предметов обихода, пищевых продуктов; знать возбудителей пищевых токсикоинфекций и токсикозов, их биологические свойства, лабораторную диагностику бактериальных отравлений людей и кормовых отравлений животных микробного происхождения. Изучить методы санитарно-бактериологического исследования воздуха, воды, почвы, пищевых продуктов, кормов, смывов с предметов для оценки микробиологического моноторинга в животноводческих помещениях, оценки качества дезинфекции. Занятие 1. Тема: Санитарно-микробиологическое исследование воздуха и воды. 4 часа Цель занятия. Овладеть методами санитарно-бактериологического исследования воздуха, воды. Содержание занятия: 1) определение общей микробной загрязненности воздуха; 2) определение микробного числа воды; 3) определение коли-титра воды бродильным методом; 4) определение коли-индекса воды с помощью мембранных фильтров; 5) определение индекса энтерококка воды; 6) изучение методов исследования воды на наличие сальмонелл. Вопросы для самоподготовки. Роль, значение и задачи санитарной микробиологии. Учение о санитарно-показательных микроорганизмах. Микрофлора воздуха и методы микробиологического исследования (атмосферный воздух и воздух закрытых помещений). Санитарно-показательные микроорганизмы воздуха. Микрофлора воды и методы ее бактериологического исследования. Санитарно-показательные микроорганизмы воды. Методы индикации патогенных микроорганизмов. САНИТАРНО-МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ВОЗДУХА Задание 1. Определить микробное число воздуха: седиментационным методом (по Коху) — посев воздуха на мясопептонный агар и аспирационным методом (с помощью аппарата Кротова) — посев воздуха на мясопептонный агар, кровяной и молочно-желточно-солевой агар. Материалы и оборудование. Чашки Петри с мясопептонным агаром, кровяным и молочно-желточно-солевым агаром, аппарат Кротова. Методические указания к выполнению работы Загрязненность воздуха закрытых помещений микробами определяется по двум показателям: 1) общему количеству микробов, содержащихся в 1 м3 воздуха; 2) качественному составу микрофлоры воздуха, определяемому по выявлению санитарно-показательных бактерий (золотистых стафилококков и стрептококков) и спорообразующих бактерий. Обнаружение санитарно-показательных бактерий в воздухе свидетельствует о санитарно-эпизоотологическом и эпидемиологическом неблагополучии, так как они выделяются от больных или бактерионосителей. Появление спорообразующих — показатель загрязненности воздуха микроорганизмами почвы. Седиментационный метод (по Коху) — оседание микробов на поверхность твердой питательной среды под действием силы тяжести. Для исследования воздуха помещений чашки Петри со средой открывают на 5—10 мин (для определения общей обсемененности воздуха) и на 40 мин (для учета кокковой флоры). Осевшие из воздуха микробы в термостате при 37С в течение 24 часов и затем при комнатной температуре (сутки). О степени загрязненности воздуха судят по количеству выросших колонии, которые подсчитывают, затем определяют количество микробов в 1 м3 воздуха (микробное число) по формуле Омелянского: где Х — количество микробов в 1 м3 (1000 л) воздуха; а — количество выросших колоний в чашках; в — площадь чашки; Т —время, в течение которого чашка была открыта; 5 — время по правилу Омелянского; 10 — объем воздуха в литрах (1 м3). Правилом Омелянского подразумеваеся, что на поверхности агара в чашке Петри с площадью 100 см2 за 5 мин из воздуха оседает такое количество микробов, которое находится в его 10 л. Аспирационный метод более точный по сравнению с предыдущим и используется для исследования как воздуха помещений, так и атмосферного воздуха. Для определения общей бактериальной обсемененности воздуха закрытых помещений используют две чашки Петри с мясопептонным агаром и пропускают через аппарат по 100 л воздуха. После подращивания посевов в течение 48 ч при температуре 37°С подсчитывают количество выросших колоний на обеих чашках, вычисляют среднее арифметическое и делают пересчет на количество микробов в 1 м3 воздуха. При определении санитарно-показательных бактерий используют две чашки Петри с 3—5% кровяным агаром (определение - и -гемолитических стрептококков), а также две чашки Петри с молочно-желточно-солевой средой (обнаружение золотистых стафилококков). При этом через аппарат пропускают по 250 л воздуха. Через сутки подращивания в термостате и еще одни сутки сохранения при комнатной температуре производят макро- и микроскопическое исследование колоний, определяют патогенность бактерий по общепринятым тестам. Состав микрофлоры воздуха оценивают с учетом спорообразующих анаэробов. С этой целью посев воздуха в объеме 200—300 л производят на чашку с железосульфитной средой (среда Вильсона — Блера) и заливают ее 15 мл расплавленного и охлажденного до 45°С мясопептонного агара для создания анаэробных условий. После суток подращивания в термостате подсчитывают количество черных колоний и делают перерасчет на 1 м3 исследуемого воздуха (табл. 1). Таблица 1 Санитарно-бактерио логическое исследование воздуха
САНИТАРНО-МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ВОДЫ Исследование воды проводится по трем показателям: 1) микробное число воды; 2) коли-индекс и коли-титр; 3) обнаружение патогенных бактерий кишечной группы. Задание 2.Определить микробное число воды: произвести взятие проб воды и сделать посев разведений исследуемой воды на мясопептонный агар (табл. 2). Материалы и оборудование. Колба с исследуемой водой — 50 мл, пробирки со стерильной водой по 9 мл, стерильные чашки Петри, стерильные пипетки на 1—2 мл, пробирки с мясо-пептонным агаром по 10 мл, водяная баня, термометр. Методические указания к выполнению работы. Из открытых водоемов пробы воды отбирают с глубины 10—15 см от поверхности и на расстоянии 10—15 см от дна. Из водопровода воду берут в стерильные флаконы с притертой пробкой емкостью 0,5 л, а с глубины водоема — привязанным к шесту батометром или стеклянным сосудом с притертой пробкой, к которой прикреплен шнур. Водопроводную воду наливают после предварительного обжигания крана и стекания первых порций воды из него в течение 10—15 мин. Воду из колодца следует брать утром до начала пользования им или через 10—12 ч после прекращения пользования. Хлорированную воду перед исследованием нейтрализуют серноватистокислым натрием из расчета 10 мл на 1 л воды. Промежуток времени с момента взятия пробы до бактериологического исследования не должен превышать 2 ч (при температуре 1—5°С можно хранить до 6 ч). Микробное число воды — количество микробов в 1 мл используемой воды — определяют путем высева воды на мясопептонный агар. Исследуемую воду разводят в 10, 100 и 1000 раз. В пробирку с 9 мл стерильной воды вносят 1 мл исследуемой воды (разведение 1:10), затем после перемешивания другой пипеткой переносят в аналогичную пробирку 1 мл разведенной воды (разведение 1 : 100) и т. д. По 1 мл полученных разведении воды, начиная с большего, переносят в маркированные стерильные чашки Петри и заливают 10 мл расплавленного и охлажденного до 45°С мясопептонного агара. Осторожно кругообразными движениями перемещают по поверхности стола чашку Петри, перемешивая содержимое. Затем чашки Петри с застывшим агаром переворачивают вверх дном и помещают на сутки в термостат. При исследовании водопроводной воды в каждую из двух чашек засевают 1 мл неразведенной воды. Таблица 2 Определение микробного числа воды
Задание З. Определить коли-титр воды бродильным методом (I этап): сделать посевы исследуемой воды на глюкозопептонную среду (табл. 3). Таблица 3 Определение коли-титра воды
Материалы и оборудование. Колба с исследуемой водой — 50 мл; пробирки с разведенной водой в 10, 100 раз (приготовленные при определении микробного числа воды); пробирки с концентрированной глюкозопептонной средой — одна с 10 мл и одна с 1 мл среды; 3 пробирки, содержащие по 10 мл среды нормальной концентрации; пипетки на 10 мл и на 1—2 мл. Методические указания к выполнению работы. Сущность метода заключается в посеве определенных объемов исследуемой воды в среде накопления (глюкозо-пептонная или лактозопептонная среда с индикатором и поплавком), последующем культивировании посевов и высеве из забродивших пробирок на среду Эндо. Выросшие на среде Эндо колонии изучают с целью определения БКГП. Затем определяют по расчетным таблицам коли-титр и коли-индекс. Для анализа отбирают различные объемы воды, регламентированные ГОСТом 18963-73. Первый день исследования. В случае исследования воды на этапах очистки и обеззараживания производят посев 100; 10; 1; 0,1; 0,01 мл воды соответственно во флаконы с 10 и 1 мл концентрированной среды накопления и 10, 10 и 10 мл среды накопления нормальной концентрации. При исследовании питьевой водопроводной воды производят посев 100, 100, 100 и 10, 10, 10 мл воды соответственно во флаконы с 10 и 1 мл концентрированной среды накопления и по 1, 1, 1 мл в 10 мл среды накопления нормальной концентрации. Культивирование посевов производят при температуре 37° в течение 24 ч. Задание 4.Определить коли-индекс воды методом мембранных фильтров, используя демонстрацию. Материалы и оборудование. Чашки Петри со средой Эндо с выросшими на фильтре колониями бактерий группы кишечной палочки. Методические указания к выполнению работы. Для анализа отбирают различные объемы воды, регламентированные ГОСТ 18963-73 в зависимости от предполагаемого количества БГКП в пробе воды. Исследуемую воду фильтруют в фильтровальном аппарате, например в аппарате Зейтца через мембранные фильтры № 2 или № 3, а также планктонные фильтры № 6. Фильтровальный аппарат стерилизуют фламбированием после обработки ватным тампоном, смоченным спиртом. Подготовленный фильтр помещают на стерильный столик фильтровального аппарата и закрепляют верхней частью аппарата (воронкой, цилиндром). Вода фильтруется с помощью водоструйного насоса или аппарата Комовского. После фильтрования фильтр стерильным пинцетом переносят, не переворачивая, на среду Эндо, в чашку Петри. Фильтр должен плотно прилегать к поверхности питательной среды. На дне чашки Петри ставят номер пробы, объем профильтрованной воды, дату посева и помещают в термостат при температуре 37°С на сутки. За это время из осевших на фильтре бактерий образуются колонии. Учитывают колонии, характерные для кишечных палочек (темно-красные с металлическим блеском и без него, розовые прозрачные). Из нескольких колоний различных оттенков готовят мазки и окрашивают их по Граму. В случае присутствия нетипичных кишечных палочек (короткие или длинные, полиморфные) дополнительно проводят оксидазный тест, который позволяет отличить бактерии семейства Enterobacteriacae от других грамотрицательных бактерий. С этой целью мембранный фильтр с колониями бактерий помещают на больший по размеру диск фильтровальной бумаги, смоченный реактивом — раствором фе-нилендиамина. Результат реакции учитывают через 2—4 мин. колонии бактерий, не относящиеся к семейству Еntегоbасtеriасеае, дают положительную реакцию на оксидазу в виде посинения колоний или появления синего ободка. Колонии, не изменившие окраску и состоящие из грамотрицательных палочек, относят к колониям БГКП, так как у них отсутствует оксидазная активность. Результат анализа выражают в виде коли-индекса, который высчитывают, умножая количество выросших на фильтре колоний БГКП на 1000 и делят на объем профильтрованной воды. Если в 1 л питьевой воды содержится более 3 БГКП, а в 1 л воды бассейнов — более 10, то это свидетельствует о фекальном загрязнении, превышающем норму. Задание 5. Определить в воде индекс энтерококка (1-й этап): сделать посевы исследуемой воды на щелочную элективную среду (табл. 4). Таблица 4 Определение индекса энтерококка в воде
| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||