Молекулярная биология клетки. Том 1. Молекулярная биология клетки 2Molecular Bruce Alberts, Dennis Bray,Biology
 Скачать 25.6 Mb.
|
|
6-14 6.2.4. Спектрин - белок цитоскелета, нековалентно связанный с цитоплазматической стороной мембраны эритроцитов [11] Большинство мембранных белков эритроцитов человека - это периферические мембранные белки, ассоциированные с бислоем на его плазматической стороне. Самый распространенный из таких белков спектрин представляет собой длинную, тонкую, гибкую «палочку» длиной около 100 нм. Его масса составляет около 25% массы мембранных белков, что соответствует 2,5 х 10 5 копий на клетку. Спектрин является важным компонентом белковой сети (цитоскелета), поддерживающей структурную целостность и двояковогнутую форму эритроцитов (см. рис. 6-22). Если цитоскелет экстрагировать из теней эритроцитов растворами с низкой ионной силой, мембрана фрагментируется на мелкие пузырьки. 366 Рис. 6-25. Молекулы спектрина из эритроцитов человека. А. Схематическое изображение. Б. Электронная микрофотография. Каждый гетеродимер состоит из двух антипараллельных слегка перекрученных друг с другом, гибких полипептидных цепей, которые нековалентно взаимодействуют во множестве точек, включая оба конца. Фосфорилированная «головка» - место, где объединяются два димера, образуя тетрамер, расположена слева. Каждая из а и (3 цепей состоит из большого числа повторяющихся доменов, длиной 106 аминокислотных остатков. Предполагают, что каждый домен организован группой из трех α-спиралей (не показано), связанных нерегулярными перетяжками. На (Б) показаны спектриновые молекулы, оттененные платиной. (A-D. W. Speicher и V.Т. Marcher, Nature 311, 177-180; Б - с любезного разрешения D. М. Shotten et al., J. Моl. Biol., 131, 303- 329, 1979. Academic Press Inc. (London) Ltd.) Молекула спектрина состоит из двух больших полипептидных цепей: α-спектрина (около 240 000 дальтон) и β-спектрина (около 220 000 даль-тон). По-видимому, каждая цепь должна быть построена из множества α-спиральных сегментов, объединенных в группы по три и связанных между собой неспиральными участками (рис. 6-25). Такие спектриновые гетеродимеры самопроизвольно агрегируют (голова к голове), образуя тетрамеры длиной 200 нм. Концы пяти или шести тетрамеров соединяются между собой, связываясь с короткими активными филаментами и с другим белком (полосой 4.1), в так называемый «узловой комплекс». Таким образом, образуется гибкая сетеподобная структура на цитоплазматической поверхности мембраны (рис. 6-26). Именно цитоскелет, в основу которого входит спектрин, позволяет эритроцитам противостоять давлению на мембрану при прохождении через узкие капилляры. У анемичных мышей и людей с наследственной аномалией спектрина эритроциты имеют сферическую (а не двояковогнутую) форму и повышенную хрупкость. Степень тяжести анемии прямо пропорциональна степени недостаточности спектрина. При связывании радиоактивно меченного спектрина с мембранами эритроцитов, из которых предварительно был удален спектрин и некоторые другие периферические белки, удалось идентифицировать белок, ответственный за соединение спектринового цитоскелета с плазматической мембраной. Крупный внутриклеточный белок был назван анкирином. Он связывал как β-спектрин, так и цитоплазматический домен трансмембранного белка полосы 3 (см. рис. 6-26). Соединяя белок полосы 3 со спектрином, анкирин связывал сеть, образуемую спектрином, с мембраной. При этом сильно уменьшалась скорость диффузии молекул белка полосы 3 в липидном бислое. Однако цитоскелет на основе спектрина может соединяться с мембраной и по другому механизму. Было показано, что цитоскелетный белок полосы 4.1 (который 367 Рис. 6-26. Схематическое изображение (А) и электронная микрофотография ( Б ) цитоскелета (на основе спектрина) на цитоплазматической поверхности мембраны эритроцитов человека. Структура, представленная на (А), вытекает главным образом из исследований взаимодействия очищенных белков in vitro. Спектриновые димеры ассоциируют «голова к голове», образуя тетрамеры, которые объединяются с помощью коротких актиновых филаментов (содержащих 15 мономеров) и белка полосы 4.1 (а два или три других белка не показаны), в результате чего образуется сеть. Эта цитоскелетная сеть связана с мембраной благодаря взаимодействию спектриновых тетрамеров с молекулами белка полосы 3, но не прямо, а через молекулы анкирина. Она может также связываться с мембраной при взаимодействии белка полосы 4.1 с молекулами гликофорина (не показано). Электронная микрофотография демонстрирует эритроциты после фиксации и негативного контрастирования. Спектриновая сеть была специально растянута, для того чтобы были видны отдельные детали структуры; в нормальной клетке такая сеть занимает лишь 1/10 изображенной площади. (С любезного разрешения Т. Byers и D. Branton, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 6153-6157, 1985.) связывает спектрин и актин) соединяется с цитоплазматическим доменом гликофорина, другого трансмембранного белка эритроцитов. Аналогичные, но гораздо более совершенные и сложные цитоскелетные сети лежат в основе плазматических мембран ядерных клеток. Такие сети, состоящие из кортикальных областей (или кортексов) цитоплазмы, содержат множество актиновых филаментов, которые, по- видимому, соединены с плазматическими мембранами несколькими различными способами. В кортексе обнаружены белки, структурно гомологичные спектрину, анкирину и белку полосы 4.1, но их организация и функции до сих пор не поняты. 6.2.5. Гликофорин пронизывает липидный бислой в виде одиночной α-спирали [11] Гликофорин - это один из двух главных белков, выступающих не внешней поверхности эритроцитов человека. Он оказался первым мембранным белком, для которого была определена полная аминокислотная последовательность. Гликофорин представляет собой небольшой трансмембранный гликопротеин (131 аминокислотный остаток). Большая часть массы этого белка находится на наружной поверхности 368 мембраны, где локализован и его гидрофильный N-концевой участок. С этой областью белковой молекулы связаны 15 отдельных олигосахаридных боковых цепей, в которых в сумме содержится около 100 сахарных остатков, что составляет примерно 60% массы молекулы гликопротеина. Фактически подавляющую часть углеводов клеточной поверхности (включая более 90% сиаловой кислоты) и, следовательно, большую часть всех отрицательных зарядов клеточной поверхности несут на себе молекулы гликофорина. Гидрофильные С-концевые хвосты этих молекул погружены в цитозоль, а гидрофобный α-спиральный участок, насчитывающий приблизительно 20 аминокислотных остатков, пронизывает липидный бислой. Несмотря на то что в клетках содержится много молекул гликофорина (более 6 х 10 5 ), их функция остается неизвестной. Более того, люди, в эритроцитах которых отсутствует большинство этих молекул, производят впечатление совершенно здоровых. Гликофорин обнаружен только в эритроцитах, однако в структурном отношении его можно отнести к общему классу мембранных гликопротеинов, пронизывающих липидный бислой в виде одиночной α-спирали (см. пример 1 на рис. 6-14 и рис. 6-16). Различные рецепторы на поверхности клеток принадлежат именно к этому классу белков. 6-14 6.2.6. Полоса 3 из мембраны эритроцитов человека представляет собой белок, транспортирующий анионы [13] О белке полосы 3 известно (в отличие от гликофорина), что он играет важную роль в функционировании клетки. Этот белок называется полосой 3, поскольку при электрофорезе в ПААГ в присутствии ДСН он занимает соответствующее положение относительно других белков (см. рис. 6-24). Как и гликофорин, полоса 3 является трансмембранным белком. Однако в отличие от него этот белок имеет глобулярную конформацию, а его полипептидная цепь (длиной около 930 аминокислотных остатков) пересекает бислой по крайней мере 10 раз. Каждый эритроцит содержит около 10 6 молекул белка полосы 3, которые, по-видимому, образуют в мембране димеры и, возможно, тетрамеры. Основная функция эритроцитов, как известно, заключается в переносе О 2 из легких ко всем тканям и СО 2 из тканей к легким. Белок полосы 3 принимает участие в этом обмене. Находясь в легких, эритроциты избавляются от СО 2 , аккумулированного в тканях, путем замены ионов НСО 3 - на С1 - . В мембране есть специальный анионный транспортный белок для осуществления данного процесса. Газообмен можно заблокировать специфическим ингибитором, связывающимся с транспортным белком. При использовании ингибиторов, меченных радиоактивными изотопами, этот анионный транспортный белок был идентифицирован. Им оказался белок полосы 3. Совсем недавно процесс анионного транспорта был реконструирован in vitro с использованием очищенного белка полосы 3, встроенного в фосфолипидные пузырьки. Очень похожие анионные транспортные белки были обнаружены и во многих других ядерных клетках, где они помогают контролировать внутриклеточный рН. Белок полосы 3 можно зарегистрировать в виде внутримембранных частиц с помощью электронной микроскопии в сочетании с замораживанием - скалыванием. В этом случае клетки замораживают в жидком азоте и полученный кусочек льда раскалывают острым ножом. Плоскость скола обычно проходит через гидрофобную сердцевину мембранного бислоя, разделяя его на два монослоя. Затем на образовавшиеся поверхности напыляют платину и рассматривают платиновые реплики Рис. 6-27. Схема, показывающая, как с помощью электронной микроскопии образцов, приготовленных методом замораживания - скалывания, можно получить изображения внутренней гидрофобной поверхности цитоплазматической (или протоплазматической) половины бислоя (называемой Р-поверхностью) и наружной половины бислоя (называемой Е-поверхностью). После показанного здесь процесса скалывания открытые поверхности сколов оттеняют платиной и углеродом, органические вещества удаляют, а полученную платиновую реплику рассматривают в электронный микроскоп (см. также рис. 4-23). 369 Рис. 6-28. Электронная микрофотография скола эритроцитов человека. Обратите внимание, что плотность внутримембранных частиц на цитоплазматической (Р) поверхности выше, чем на наружной (Е). (С любезного разрешения L. Engstrom и D. Branton.) в электронный микроскоп. С помощью этой методики открываются (рис. 6-27) две различные гидрофобные внутренние поверхности: цитоплазматической (или протоплазматической) половины бислоя (Р-поверхность) и внешней половины бислоя (Е-поверхность, от англ. external). Мембраны человеческих эритроцитов в таких препаратах выглядят усеянными относительно гомогенными по размеру (7.5 нм в диаметре) внутримембранными частицами. Как оказалось, их больше на Р-поверхности, чем на Е-поверхности (рис. 6-28). По-видимому, это главным образом белки полосы 3, поскольку такие же частицы обнаружены при скалывании синтетических липидных бислоев, реконструированных вместе с белком полосы 3. Рис. 6-29 убеждает нас в том, что именно молекулы белка полосы 3, а не молекулы гликофорина, видны на электронных микрофотографиях мембран эритроцитов, полученных с помощью метода замораживания - скалывания. Ведь нетрудно себе представить, каким образом трансмембранный белок, такой, например, как белок полосы 3, основная масса которого расположена в пределах липидного бислоя, может осуществлять пассивный транспорт полярных молекул через неполярный бислой. Ясно, что белок полосы 3 (или его Рис. 6-29. Схема, показывающая, что может произойти с молекулами гликофорина и белка полосы 3 в мембранах эритроцитов человека во время процедуры замораживания - скалывания. При расщеплении липидного бислоя из замороженного монослоя выдергивается либо внутренняя, либо внешняя половина трансмембранного белка. Преимущественно белки остаются на той половине, с которой ассоциирована более крупная часть белковой молекулы. Поэтому молекулы белка полосы 3 обычно остаются на внутренней (Р) поверхности скола. Поскольку при этом над поверхностью скола экспонирована достаточно большая часть белка, они видны на микрофотографиях в виде внутримембранных частиц. Молекулы гликофорина обычно остаются на внешней (Е) поверхности скола, но их экспонированных цитоплазматических хвостов не хватает для того, чтобы создать изображение каких-либо четко различимых частиц. 370 димер либо тетрамер) способен обеспечить трансмембранный гидрофильный проход, по которому ионы С - и HCO 3 - переносятся без контакта с гидрофобным окружением липидного бислоя (см. рис. 6-43, А). Маловероятно, что подобный транспорт может осуществлять молекула гликофорина, пронизывающая бислой в виде простой α-спирали. Для того чтобы понять механизм функционирования мембранных транспортных белков, необходима точная информация об их трехмерной структуре в составе бислоя. Первым транспортным белком, для которого подобные детали стали известны, оказался бактериородопсин - белок, работающий как фотоактивируемый протонный (Н + ) насос в плазматической мембране некоторых бактерий. Структура бактериородопсина аналогична структуре других мембранных белков. Этот белок заслуживает того, чтобы остановится на нем поподробнее. 6.2.7. Бактериородопсин - это протонный насос, пронизывающий бислой в виде семи α-спиралей [14] «Пурпурная мембрана» бактерий Holobacterium halobium - это четко очерченный участок (пятно) неправильной формы на плазматической мембране (рис. 6-30), которая содержит молекулы одного белка - бактериородопсина, В каждой молекуле имеется одна поглощающая свет простетическая группа, или хромофор (называемый ретиналем), родственная витамину А и идентичная хромофору, обнаруженному в родопсине палочек сетчатки глаза у позвоночных (см. разд. 19.6.6). Ретиналь ковалентно связан с боковой цепью лизина в белке. При активации одним квантом света возбужденный хромофор вызывает конформационные изменения в белке, в результате чего два протона переносятся с внутренней поверхности клетки на наружную. Вследствие такого переноса в клетке создается градиент концентрации протонов и градиент электрического потенциала, которые в свою очередь обусловливают синтез АТР с помощью второго белка клеточной плазматической мембраны. Молекулы родопсина образуют в клеточной мембране плоскую кристаллическую решетку, подобную двумерному кристаллу. Сочетание методов электронной микроскопии низкой интенсивности и малоуглового рассеяния электронов позволило определить трехмерную структуру белка и его ориентацию в мембране с разрешением 0,7 нм. Последний метод аналогичен рентгеноструктурному анализу, который используется для получения трехмерных кристаллов растворимых белков. Изучение бактериородопсина показало, что его молекула состоит из семи α-спиралей (каждая из которых содержит около 25 аминокислотных остатков), плотно упакованных друг с другом (рис. 6-31). Эти спирали пересекают линейный бислой примерно под прямым углом к плоскости мембраны. Весьма возможно, что протоны проходят через мембрану при участии хромофора по сопряженной системе боковых цепей α-спиралей, однако детальные механизмы этого процесса еще неизвестны. Бактериородопсин относится к семейству мембранных белков, обладающих сходной структурой, но различными функциями. Например, рецептор света - белок родопсин - в палочках сетчатки глаза позвоночных и некоторые другие белки-рецепторы клеточной поверхности, связывающие специфические гормоны, также уложены в виде семи трансмембранных α-спиралей. Эти белки функционируют скорее как переносчики сигнала, чем как транспортные белки, поскольку каждый из них в ответ на внешний сигнал активирует другой белок плазматической мембраны, который генерирует химический сигнал в цитозоле. Для полного понимания механизмов функционирования бактериородопсина необходимо определить точное положение всех его атомов Рис. 6-30. Схематическое изображение бактерии Halobacterium halobiит, показывающее пятна пурпурной мембраны, содержащей молекулы бактериородопсина. У этих бактерий, живущих в солнечных озерах и получающих много солнечного света, в процессе эволюции появились разнообразные белки, активируемые светом, в том числе и бактериородопсин - фотоактивируемый протонный насос плазматической мембраны. 371 Рис. 6-31. Структура молекулы родопсина и ее расположение в липидном бислое. Полипептидная цепь пересекает бислой в виде семи α-спиралей. (По данным R. Henderson и R.N.T. Onwin, Nature, 257, 28-32, 1975.) методами рентгеноструктурного анализа кристаллов белка. Однако из-за амфипатической природы мембранных белков их чрезвычайно трудно кристаллизовать. Это удалось сделать лишь в 1985 году при изучении фотосинтезирующего реакционного центра у бактерий методами рентгеноструктурного анализа. Впервые было показано, как множество полипептидов могут ассоциировать в мембране, образуя сложную белковую машину. 6.2.8. Четыре различных полипептидных цепи в мембраносвязанном комплексе образуют фотосинтезирующий реакционный центр у бактерий [15] В гл. 3 шла речь о том, что различные полипептиды ассоциируют, образуя большие мультиферментные комплексы, которые с высокой эффективностью катализируют сложные реакции благодаря кооперативной работе субъединиц. Аналогичные комплексы белков обнаружены и в мембранах. Наиболее изучен среди них бактериальный фотосинтезирующий реакционный центр. Этот белковый комплекс находится в плазматической мембране пурпурных фотосинтезирующих бактерий Rhodopseudomonas viridis. Он использует поглощенную энергию света для создания электрона с высокой энергией, позволяющей ему пересекать мембрану быстрее чем за наносекунду. Затем электрон переходит к другим переносчикам электронов, находящимся в мембране, которые используют часть энергии, высвобождаемой в процессе электронного транспорта для синтеза АТР в цитозоле. Реакционный центр построен из четырех различных полипептидов: L, М, Н и цитохрома. Для изучения трехмерной пространственной структуры этот комплекс был солюбилизирован в растворе детергента, закристаллизован в виде комплекса белков с детергентом и изучен методом рентгеноструктурного анализа. Как оказалось, реакционный центр содержит четыре молекулы хлорофилла и восемь других коферментов, переносящих электроны. В гл. 7 мы будем говорить о том, что для понимания фотосинтеза очень важным оказалось установление точного положения каждого из коферментов в комплексе. Не менее значимым (в большой степени относящимся к теме данной главы) событием стало выяснение организации четырех белковых субъединиц в трансмембранном комплексе. Субъединицы L и М гомологичны и состоят каждая из пяти α-спиралей, пронизывающих липидный бислой плазматической мембраны (рис. 6-32). Эти две субъединицы образуют гетеродимер, представляющий собой ядро реак- |