Молекулярная биология клетки. Том 1. Молекулярная биология клетки 2Molecular Bruce Alberts, Dennis Bray,Biology
 Скачать 25.6 Mb.
|
|
342 Рис. 5-90. Выявление полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) блот-анализом по Саузерну. Для простоты в хромосомах показано лишь несколько сайтов рестрикции, хотя в действительности их многие тысячи. Если до воздействия рестрицирующей нуклеазой провести амплификацию соответствующего участка методом ПЦР, этот же тест можно провести без радиоизотопов и от блот-анализа отказаться. количеств РНК; для этого РНК переводят в последовательности ДНК с помощью обратной транскриптазы (см. разд. 5.6.3). Клонирование методом ПЦР быстро вытесняет блот-анализ по Саузерну в таких областях, как пренатальная диагностика наследственных болезней и выявление вирусных инфекций. Большие перспективы открывает этот метод также и в судебной медицине, поскольку он дает возможность однозначно определить принадлежность одной-единственной клетки данному человеку. 10-31 5.6.12. Применение рекомбинантных ДНК сильно облегчает картирование и анализ крупных геномов [66] Появившиеся в последнее время методы позволяют составлять подробные карты очень больших геномов. Есть две категории карт: 1. Физические карты, основывающиеся на строении молекул ДНК, составляющих каждую хромосому. Сюда относятся рестрикционные карты и систематизированные библиотеки клонов геномной ДНК. 2. Карты генетического сцепления; их строят, основываясь на частоте совместной передачи потомству двух или нескольких признаков - генетических маркеров, различных у отца и матери и приписываемых определенному участку хромосомы. В качестве маркеров издавна принято использовать те гены, экспрессия которых обнаруживается по их эффекту (таковы, в частности, гены, вызывающие генетические болезни, например мышечную дистрофию). Разработанные сравнительно недавно новые методы с применением рекомбинантной ДНК дали возможность использовать в качестве генетических маркеров короткие последовательности ДНК, содержащие один из сайтов рестрикции и различающиеся у отдельных индивидуумов; такие последовательности особенно удобны для генетического картирования, потому что под действием рестрикционной нуклеазы возникают фрагменты, различающиеся по своей длине, и этот полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) легко может быть выявлен блот-анализом по Саузерну с помощью подходящего ДНК-зонда (рис. 5-90). Если два генетических маркера находятся в разных хромосомах, то сцепление между ними отсутствует, т. е. шансы на их совместную передачу потомству равны 50:50. То же справедливо и в отношении маркеров, локализующихся на противоположных концах одной и той же хромосомы, из-за большой вероятности их разделения в результате кроссинговера, частота которого в процессе мейоза, при образовании яйцеклеток и сперматозоидов, весьма высока (см. разд. 15.2.3). Чем ближе друг к другу два маркера в пределах одной хромосомы, тем больше вероятность того, что они не будут разделены кроссинговером, а значит, будут переданы потомству совместно. Проведя скрининг больших семейных групп на совместное наследование интересующего нас гена (например, гена, ответственного за какую-нибудь болезнь) и большого числа отдельных ПДРФ-маркеров, можно идентифицировать несколько ПДРФ-маркеров, окружающих данный ген. Таким путем удается локализовать последовательности ДНК, находящиеся поблизости от этого гена, а в конце концов и ДНК, соответствующую самому этому гену (рис. 5-91). Этот метод используется для локализации многих генов, ответственных за болезни человека. После выделения такого гена можно подвергнуть детальному анализу его белковый продукт (см. разд. 4.6.12). Чтобы облегчить эти и некоторые другие исследования, в настоящее время ведется усиленная работа по созданию детальной ПДРФ- карты генома человека, на которой будут отмечены тысячи маркеров, от- 343 Рис. 5-91. Анализ генетического сцепления выявляет совместную передачу потомству какого-либо гена, обусловливающего у человека специфический фенотип (в данном случае - определенную болезнь), и соседнего ПДРФ-маркера. Такой анализ дает возможность клонировать многие гены человека и исследовать продукты этих генов. стоящих друг от друга в среднем на 10 6 п. н. (два маркера, разделенные таким расстоянием, наследуются совместно в 99 случаях из 100). Получив в свое распоряжение такую карту, можно будет - на основе данных о генетическом сцеплении - гены, идентифицированные ранее лишь по их эффекту у человека, локализовать в пределах одного или нескольких больших клонов в систематизированной библиотеке геномной ДНК. После этого на выделение данного гена потребуется в большинстве случаев уже не более нескольких месяцев. Быстрые успехи технологии рекомбинантной ДНК позволят в ближайшее время секвенировать длинные отрезки ДНК при сравнительно небольших затратах. Это значит, что станет возможным секвенирование целых геномов бактерий, дрожжей, нематод и Drosophila, а также обширных участков генома различных высших растений и позвоночных животных, в том числе и человека. Заключение При клонированш ДНК фрагмент, содержащий изучаемый ген, выявляют обычно с помощью радиоактивного ДНК-зонда или, после экспрессии гена в клетке-хозяине, - с помощью антител, обнаруживающих кодируемый этим геном белок. Затем клеткам, несущим данный фрагмент ДНК, предоставляют возможность размножаться и нарабатывать большое количество копий как самого гена, так и молекул его продукта. Для генноинженерных задач нуклеотидную последовательность такого клонированного фрагмента ДНК изменяют, присоединяют к другой последовательности ДНК, а затем снова вводят в клетки. Сочетание клонирования ДНК с генной инженерией вооружает клеточного биолога очень мощным инструментом исследования. В принципе возможно сконструировать ген, кодирующий белок с любой желательной аминокислотной последовательностью, и присоединить его к такой промоторной последовательности ДНК, которая позволит контролировать время и тип экспрессии гена. Этот новый ген можно ввести либо в клетки, выращиваемые в культуре, либо в клетки зародышевого пути мыши или плодовой мушки. У трансгенных животных эффект экспрессии включенного гена можно наблюдать на многих различных клетках и тканях. 344 Литература Общая Judson И. F. The Eighth Day of Creation: Makers of the Revolution in Biology, New York, Simon and Schuster, 1979. (History derived from personal interviews.) Lewin B. Genes, 3rd ed. New York, Wiley, 1987. Stent G.S. Molecular Genetics: An Introductory Narrative, San Francisco, Freeman, 1971. (Clear descriptions of the classical experiments.) Watson J. D., Hopkins N. H., Roberts J. W., Weiner A. M. Molecular Biology of the Gene, 4th ed.Menlo Park, CA, Benjamin-Cummings 1987. Цитируемая 1. Chamberlin M. Bacterial DNA-dependent RNA polymerases. In: The Enzymes, 3rd ed., Vol. 15B (P. Boyer ed.), pp. 61-108. New York, Academic Press, 1982. McClure W. Mechanism and control of transcription initiation in prokaryotes. Annu. Rev. Biochem., 54, 171-204, 1985. Yager Т.D., Hippel P.H. Transcript elongation and termination in E. coll In: Escherichia coli and Salmonella typhimurium: Cellular and Molecular Biology (F.C. Niedhardt ed.), pp. 1241-1275. Washington DC, American Society for Microbiology, 1987. 2. Hawley D. K., McClure W.R. Compilation and Analysis of Escherichia coli promoter DNA sequences. Nucleic Acids Res., 11, 2237-2255, 1983. Siebenlist U., Simpson R., Gilbert W. E. coli RNA polymerase interacts homologously with two different promoters. Cell, 20, 269-281, 1980. 3. Rich A., Kim S. H. The three-dimensional structure of transfer RNA. Sci. Am, 238(1), 52-62, 1978. Schimmel P. R., Soll D., Abelson J. N., eds. Transfer RNA: Structure, Properties and Recognition, and Biological Aspects (2 volumes). Cold Spring Harbor. NY, Cold Spring Harbor Laboratory, 1980. 4. Schimmel P. Aminoacyl tRNA synthetase: general scheme of structure-function relationships in the polypeptides and recognition of transfer RNAs. Annu. Rev. Biochem., 56 , 125-158, 1987. 5. Crick F.H.C. The genetic code. III. Sci. Am., 21(4) , 55-62, 1966. The Genetic Code. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., Vol. 31 , 1966. (The original experiments that defined the code.) 6. Moore P. B. The ribosome returns. Nature, 331 , 223-227, 1988. Noller H.F. Structure of ribosomal RNA. Annu. Rev. Biochem., 53, 119-162, 1984. Spirin A. S. Ribosome Structure and Protein Synthesis. Menlo Park CA, Benjamin-Cummings, 1986. 7. Clark B. The elongation step of protein biosynthesis. Trends Biochem. Sci., 5 , 207-210, 1980. Watson J. D. The involvement of RNA in the synthesis of proteins. Science, 140, 17-26, 1963. (A description of how ribosome function was initially deciphered.) 8. Caskey С. Т. Peptide chain termination. Trends Biochem. Sci., 5 , 234-237, 1980. Cragien W.J., Caskey С. Т. The function, structure and regulation of E. coli peptide chain release factors. Biochemie, 69 , 1031-1041, 1987. 9. Gold L. Posttranscriptional regulatory mechanisms in Escherichia coli. Annu. Rev. Biochem., 57 , 199-233, 1988. Hunt T. The initiation of protein synthesis. Trends Biochem. Sci., 5 , 178-181, 1980. Pain V.M . Initiation of protein synthesis in mammalian cells Biochem. J., 235, 625-637, 1986. 10. Kozak M. Comparison of initiation of protein synthesis in procaryotes, eucaryotes, and organelles. Microbiol. Rev., 47 , 1-45, 1983. Kozak M. An analysis of 5' noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs. Nucleic Acids Res., 15, 8125-8147, 1987. Steitz J. A. Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA. In: Biological Regulation and Development (R. Goldberg ed.), Vol. 1, pp. 349-399. New York, Plenum, 1979. 11. Rich A. Polyribisomes. Sci. Am., 209(6) , 44-53, 1963. 12. Hunt T. Phosphorylation and the control of protein synthesis. Philos. Trans. R. Soc. Lond. (Biol.), 302 , 127-134, 1983. Jagus R., Anderson W. F., Safer B. The regulation of initiation of mammalian protein synthesis. Prog. Nucleic Acid Res. Моl. Biol., 25 , 127- 185, 1981. 13. Kirkwood T.B., Rosenberger R.F., Galas D. J., eds. Accuracy in Molecular Processes: Its Control and Relevance to Living Systems. London, Chapman and Hall, 1986. (Chapters 4, 5, 6 and 11.) Thompson R. C. EFTu provides an internal kinetic standard for translational accurancy. Trends Biochem. Sci., 13 , 91-93, 1988. 14. Jimenez A. Inhibibitors of translation. Trends Biochem. Sci., 1 , 28-30, 1976. 345 15. Alberts B.M. The function of the hereditary materials: biological catalyses reflect the cell's evolutionary history. Am. Zool., 26, 781-796, 1986. Orgel L.E. RNA catalysis and the origin of life. J. Theor. Biol. 123 , 127-149, 1983. Weiner A. M., Maizels N. tRNA-like structures tag the 3' ends of genomic RNA molecules for replication: implications for the origin of protein synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84 , 7383-7387, 1987. 16. Friedberg Е. С. DNA Repa ir. San Francisco, Freeman, 1985. Lindahl T. DNA repair enzymes. Annu. Rev. Biochem., 51 , 61-88, 1982. 17. Dickerson R., Geis 1. The Structure and Action of Proteins, pp. 59-66. New York, Harper and Row, 1969. Wilson A. C., Carbon S. S., White T. J. Biochemical evolution. Annu. Rev. Biochem., 46 , 573-639, 1977. Wilson A. C., Ochman H., Prager Е. М. Molecular time scale for evolution. Trends Genet., 3 , 241-247, 1987. 18. Drake J. M. Comparative rates of spontaneous mutation. Nature, 221, 1132, 1969. 19. Cairns J. Cancer: Science and Society. San Francisco. Freeman, 1978. (Chapter 7 discusses the role of mutation in the development of cancer.) Ohta Т., Kimura M. Functional organization of genetic material as a product molecular evolution. Nature, 233 , 118-119, 1971. (The mutation rate limits the maximum number of genes in an organism.) 20. Schrodinger E. What is Life? Cambridge UK, Cambridge University Press, 1945. 21. Kornberg A. DNA Replication. San Francisco, Freeman, 1980. (Chapter 4 describes DNA polymerase. Chapter 8 describes DNA ligase, and Chapter 16 covers the general enzymol ogy of DNA repair.) 22. Cleaver J. E., Karentz D. DNA repair in man: regulation by a multigene family and association with human disease. Bioessays, 6, 122-127, 1987. Coulondre C., Miller J. H., Farabaugh P. J., Giobert W. Molecular basis of base substitution hotspots in E. соli. Nature, 274 , 775-780, 1978. Lindahl T. New class of enzymes acting on damaged DNA. Nature, 259 , 64-66, 1976. Sancar A.Z., Sancar G.B. DNA repair enzymes. Annu. Rev. Biochem. 57 , 29-67, 1988. 23. Lindahl Т., Sedgwick В., Sekiguchi M., Nakabeppu Y. Regulation and expression of the adaptive response to alkylating agents. Annu. Rev. Biochem., 57 , 133-157, 1988. Ossanna N.. Peterson K. R., Mount D. W. Genetics of DNA repair in bacteria. Trends Genet., 2 , 55-58, 1986. Walker G. C. Inducible DNA repair systems. Annu. Rev. Biochem., 54 , 425-457, 1985. 24. Alberts B.M. Prokaryotic DNA replication mechanisms. Philos. Trans. R. Soc. bond. (Biol.), 317, 395-420, 1987. Kornberg A. DNA Replication. San Francisco, Freeman, 1980. McMacken R., Silver L., Georgopoulos C. DNA replication. In: Escherichia coli and Salmonella typhimurium: Cellular and Molecular Biology (F. C. Neidhardt ed.), pp. 564-612. Washington DC. American Society for Microbiology, 1987. 25. Joyce C.M., Steitz T.A. DNA polymerase I: from crystal structure to function via genetics. Trends Biocem. Sci., 12 , 288-292, 1987. Kornberg A. Biologic synthesis of deoxyribonuclear acid. Science, 131 , 1503-1508. (Nobel prize address.) Meselson M., Stahl F. W. The replication of DNA in E. coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 44 , 671-682, 1958. 26. Cairns J. The bacterial chromosome and its manner of replication as seen by autoradiography. J. Моl. Biol., 6, 208-213, 1963. Imman R. В., Schnos M. Structure of branch points in replicating DNA: presence of single-stranded connections in lambda DNA branch parts. J. Моl. Biol., 56, 319-325, 1971. (Electron microscopy demonstrates that the replication fork is asymmetric.) Ogawa Т., Okazaki T. Discontinuous DNA replication. Annu. Rev. Biochem., 49, 421-457, 1980. 27. Brutlag D., Kornberg A. Enzymatic synthesis of deoxyribonucleic acid: a proofreading function for the 3' to 5' exonuclease activity in DNA polymerases. J. Biol. Chem., 247 , 241-248, 1972. Fersht A. R. Enzymatic editing mechanisms in protein synthesis and DNA replication. Trends Biochem. Sci., 5, 262-265, 1980. Topal M., Fresco J. R. Complementary base pairing and the origin substitution mutations. Nature, 263 , 285-289, 1976. 28. Rowen L., Kornberg A. Primase, the dnaG protein of Escherichia coli: an enzyme which starts DNA chains. J. Biol. Chem., 253, 758-764, 1978. 29. Abdel-Monem M., Hoffmann-Berling H. DNA unwinding enzymes. Trends Biochem. Sci., 5 , 128-130, 1980. 346 Alberts В. М., Frey L. T4 bacteriophage gene 32: a structural protein in the replication and recombination of DNA, Nature, 227, 1313-1318, 1970. Lohman T. M., Bujalowski W., Overman L. В. Е. coli single strand binding protein: a new look at helix-destabilizing proteins. Trends Biochem. Sci., 13, 250-254, 1988. 30. Alberts В. М. Protein machines mediate the basis genetic processes. Trends Genet., 1, 26-30, 1985. Kornberg A. DNA replication. J. Biol. Chem., 263, 1-4, 1988. LeBowitz J., McMacken R. The E. coli dnaB replication protein is a DNA helicase. J. Biol. Chem., 261, 4738-4748, 1986. 31. Modrich P. DNA mismatch correction. Annu. Rev. Biochem., 56, 435-466, 1987. Radman M., Wagner R. The high fidelity of DNA duplication. Sci. Am., 259(2) , 40-47, 1988. 32. Bramhill D., Kornberg A. Duplex opening by dnaA protein at novel sequences in initiation of replication at the origin of the E. coli chromosome. Cell, 52 , 743-755, 1988. Dodson M. et al. Specialized nucleoprotein structures at the origin of replication of bacteriophage lambda: localized unwinding of duplex DNA by a six-protein reaction. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83 , 7638-7642, 1986. Zyskind J. W., Smith D. W. The bacterial origin of replication, ori C. Cell, |