Молекулярная биология клетки. Том 1. Молекулярная биология клетки 2Molecular Bruce Alberts, Dennis Bray,Biology
 Скачать 25.6 Mb.
|
|
5-44 5.5.10. У другой группы транспозонов переход совершается непосредственно из одного участка генома в другой [52] Многие транспозоны отличаются от ретротранспозонов тем, что они, по-видимому, никогда не существуют вне хромосомы клетки- хозяина; транспозазы, катализирующие их перемещение, действуют на ДНК 323 Рис. 5-76. Структура транспозона, перемещающегося непосредственно из одного участка хромосомы в другой. Узнаются транспозоны этого типа по наличию у них на концах двух инвертированных повторяющихся последовательностей ДНК. Как показали эксперименты, именно эти повторяющиеся последовательности (длиной иногда не более 20 нуклеотидов) требуются для того, чтобы находящаяся между ними ДНК могла быть перенесена на новое место специальным ферментом транспозазой. На схеме показан белковый комплекс, образующийся на первом этапе процесса транспозиции. Дальнейшие события включают разрыв ДНК на концах инвертированных повторяющихся последовательностей и ряд других этапов, которые можно рассматривать как модификацию схемы, представленной на рис. 5-67, Б (см. также рис. 5-77). транспозона в то время, как он пребывает в интегрированном состоянии в геноме хозяина. Транспозаза, как полагают, связывается с короткими нуклеотидными последовательностями, повторяющимися в инвертированном виде на обоих концах транспозона, и тем самым сближает эти концы для последующей рекомбинации, которую она катализирует (рис. 5-76). У некоторых транспозонов механизм транспозиции сводится всего лишь к разрыву и воссоединению ДНК; два конца транспозона присоединяются при этом к концам хромосомы в другом ее участке, там, где в ней возник ступенчатый разрыв (см. рис. 5-67, Б). Такие транспозоны переходят непосредственно из одного участка хромосомы в другой без сопутствующей репликации ДНК. Однако при сшивании хромосомы в том месте, откуда был удален транспозон, ее нуклеотидная последовательность нередко нарушается, т. е. в этом участке хромосомы возникает мутация. Существуют также транспозоны, при перемещениях реплицирующиеся. Лучше других изучен пример, в котором сайт-специфическая рекомбинация «запускает» локальный синтез ДНК; одна копия реплицировавшегося транспозона включается при этом в какой-либо новый случайно выбранный участок хромосомы, а другая остается в старом участке (рис. 5-77). Механизм процесса очень близок к тому, который мы только что описали для нерепликативного пути. Известны транспозоны, способные использовать как гот, так и другой путь. Перемещаясь сами, транспозоны всех типов прихватывают иногда и соседние нуклеотидные последовательности генома хозяина или вызывают в них перестройки. Часто результатом оказываются делеции в соседних участках генома или перенос соседних последовательностей на новое место. Присутствие в хромосомах транспозонов делает их нуклеотидные последовательности менее стабильными, нежели это считалось ранее; возможно, именно эти элементы несут ответственность за многие изменения в геномах, существенные для эволюции. Можно ли приписать транспозонам еще одну важную эволюционную роль, а именно можно ли считать их древнейшими предками вирусов? Что касается ретровирусов, то они, по-видимому, действительно про- 324 Рис. 5-77. Схема, иллюстрирующая перемещение в хромосоме одного из типов транспозонов. Транспозон этого типа реплицируется в процессе транспозиции, так что, появляясь в новом участке хромосомы, он в то же время в виде одной из копий остается и в старом участке. Две инвертированные повторяющиеся последовательности ДНК на концах транспозона представлены здесь красными прямоугольниками. В начале процесса транспозиции транспозаза разрывает одну из двух цепей ДНК на обоих концах транспозона, чтобы мог начаться синтез ДНК, для которого транспозон служит матрицей. Синтез идет путем добавления нуклеотидов к 3'-концам нуклеотидных последовательностей ДНК хромосомы. Известны и последующие этапы этого процесса, но весь он в целом слишком сложен для того, чтобы рассматривать его здесь. изошли от ретротранспозонов. Однако нельзя упускать из виду, что все ныне существующие транспозоны теснейшим образом зависят от метаболизма ДНК, у первых же клеток геномы состояли, как полагают, не из ДНК, а из РНК. Очевидно поэтому, путь к самым истокам происхождения вирусов следует искать именно в метаболизме РНК. 5.5.11. Большинство вирусов, вероятно, возникло в процессе эволюции из плазмид [53] Даже самые крупные вирусы не способны осуществлять биосинтетические процессы самостоятельно; они зависят в этом отношении от клеток-хозяев. Среди известных нам вирусов ни один не имеет собственных рибосом и не обладает способностью синтезировать АТР, в котором он нуждается. Ясно поэтому, что клетки должны были появиться в процессе эволюции раньше вирусов. Предшественниками вирусов были, вероятно, небольшие фрагменты нуклеиновых кислот, которые приобрели способность размножаться независимо от хромосом их клеток-хозяев. Такие независимо размножающиеся элементы - их назвали плазмидами - реплицируются самостоятельно. Плазмиды встречаются как в ДНК-, так и в РНК-форме, и так же как вирусы, они содержат особую нуклеотидную последовательность, которая служит точкой начала репликации. Однако в отличие от вирусов они не способны синтезировать белок для построения белковой оболочки и, не имея такой оболочки, не могут свободно переходить из клетки в клетку. Многие из них не способны также включаться в хромосому клетки-хозяина. Возможно, что первые РНК-плазмиды напоминали собой вироиды, встречающиеся в некоторых растительных клетках. Эти небольшие кольцевые молекулы РНК (не более 300-400 нуклеотидов) размножаются, хотя они и не кодируют никаких белков (см. рис. 10-61). Не имея капсида, вироиды существуют лишь как голые молекулы РНК и переходят от растения к растению только в том случае, когда и донорная клетка, и клетка- реципиент оказываются поврежденными, т. е. когда между ними не существует мембранного барьера, который вироид не способен преодолеть. Под давлением естественного отбора такие независимо реплицирующиеся элементы могли, очевидно, включать в себя те нуклеотидные последовательности клетки-хозяина, которые облегчали их самостоятельное размножение, в том числе и некоторые последовательности, кодирующие белки. Некоторые известные нам плазмиды действительно достаточно сложны: в них закодированы белки и молекулы РНК, регулирующие их размножение, а также белки, регулирующие их распределение между дочерними клетками. Самые крупные среди известных плазмид представляют собой кольцевые 325 двухцепочечные спирали ДНК, насчитывающие свыше 100000 пар нуклеотидов. Первый вирус возник, вероятно, когда у плазмиды появился ген, кодирующий белок капсида. Однако в капсиде умещается ограниченное количество нуклеиновой кислоты, и, значит, число генов, которые вирус может в себе заключать, лимитируется размерами капсида. Будучи вынуждены оптимальным образом использовать свой небольшой геном, некоторые мелкие вирусы (вроде бактериофага ФХІ74) обзавелись в ходе эволюции перекрывающимися генами, в которых часть нуклеотидной последовательности, кодирующей один какой-нибудь белок, используется (с той же или с иной рамкой считывания) для кодирования второго белка. У других вирусов в процессе эволюции возникли более крупные капсиды, что должно было дать им возможность приобретать новые полезные гены. Обладая уникальной способностью к переносу ДНК через видовые барьеры, вирусы, почти несомненно, играли важную роль в эволюции тех организмов, которые они инфицируют. Многие вирусы часто вступают в рекомбинацию как друг с другом, так и с хромосомами клеток-хозяев; при этом они захватывают случайные фрагменты хромосом и переносят их в другие клетки или другие организмы. Кроме того, включившиеся в геном хозяина (интегрированные) копии вирусной ДНК (провирусы) становятся постоянными компонентами генома у большей части организмов. Примеры таких провирусов мы находим в семействе бактериофагов λ и среди так называемых эндогенных ретровирусов, многочисленные копии которых обнаруживаются в геномах позвоночных. Интегрированная вирусная ДНК часто видоизменяется так, что способность образовывать полноценный вирус у нее утрачивается, но она все еще может кодировать белки, причем некоторые из них оказываются полезными для клетки. Вирусы, следовательно, так же, как и половой процесс, создают возможности для ускорения эволюции, открывая для нее такой путь, как смешение генофондов различных организмов. С помощью вирусов отдельные последовательности ДНК переносятся из генома в геном (феномен трансдукции). Таким образом, вирусы можно использовать как инструмент для переноса генов из одной клетки в другую. Вирусы, а также очень близкие к ним плазмиды и транспозоны играют важную роль в биологии клетки и по другим причинам. Благодаря тому что они относительно просто устроены, изучение процесса их размножения продвигается чрезвычайно быстро, а полученные при этом данные позволяют судить об основных генетических механизмах клеток. Кроме того, вирусы и плазмиды стали главными элементами в технологии рекомбинантной ДНК. К рассмотрению этой последней темы мы теперь и перейдем. Заключение Вирусы — это инфекционные частицы, которые состоят из молекул ДНК или РНК (они образуют геном вируса), упакованных в белковый капсид; у некоторых вирусов капсид окружен еще и мембранной оболочкой, основу которой составляет липидный бислой. Строение вирусного генома и способы его репликации у разных вирусов сильно варьируют. Вирус способен размножаться только в клетке-хозяине, используя для этого ее генетические механизмы. Обычно вирусная инфекция завершается лизисом инфицированной клетки и высвобождением потомства вируса. Однако некоторые вирусы могут включаться в хромосому клетки, не вызывая лизиса последней. Здесь вирусные гены (в форме провируса) реплицируются вместе с генами хозяина. Считается, что многие вирусы 326 возникли в ходе эволюции из плазмид, которые представляют собой самореплицирующиеся молекулы ДНК или РНК, не способные окружать себя белковой оболочкой. Транспозоны - это нуклеотидные последовательности ДНК, отличающиеся от вирусов тем, что размножаясь только в клетках- хозяевах или в их потомстве, они, подобно плазмидам, не могут покинуть клетку. От плазмид же транспозоны отличаются тем, что они обычно реплицируются лишь в составе хромосомы хозяина, как ее неотъемлемая часть. Некоторые транспозоны, однако, весьма напоминают ретровирусы: они перемещаются в новые участки генома в результате обратной транскрипции промежуточного РНК-соединения. Существуют и транспозоны, способные оказаться в новом участке хромосомы, сохранив свою копию и на прежнем месте. Хотя и вирусы, и транспозоны могут рассматриваться как паразиты, они полезны тем, что вызываемые ими перестройки нуклеотидных последовательностей ДНК нередко играют важную роль в эволюции клеток и организмов. 5.6. Клонирование ДНК и генная инженерия [54] Открытия, о которых шла речь в этой главе, были порождены стремлением ученых постичь жизнь клеток и основные механизмы наследственности. Однако в последние годы эти фундаментальные знания получили практическое применение. Методы клонирования ДНК и генная инженерия дают возможность выделять те или иные гены в достаточном количестве, «перекраивать» их по своему усмотрению и затем вновь вводить в какие-нибудь клетки и организмы. Эти методы составляют лишь часть того общего набора методов, который известен как технология рекомбинантных ДНК (о нем мы уже говорили в гл. 4). Появление технологии рекомбинантных ДНК вызвало подлинную революцию в науке о живых клетках. Кроме того, оно открыло перед медициной и промышленностью новые пути к получению в достаточном количестве тех белков, которые раньше либо были недоступны вообще, либо могли быть получены лишь в очень малых количествах. 5-48 5-49 5-50 5.6.1. Рестрицирующие нуклеазы облегчают клонирование генов [55] В 1960-е годы возможность выделить в изолированном виде отдельный ген казалась бесконечно далекой. Ген в клетке в отличие от белка не представляет собой некой дискретной единицы; он есть не что иное, как небольшой участок во много раз большей молекулы ДНК. И хотя механическим воздействием молекулы ДНК в клетке можно разделить на множество сегментов, это разделение происходит по закону случая, и фрагмент, содержащий интересующий нас ген может затеряться среди миллиона других фрагментов. Как получить нужный ген в очищенном виде? Поскольку все молекулы ДНК состоят из одних и тех же четырех видов нуклеотидов, которые входят в их состав примерно в равных пропорциях, их нельзя легко разделить подобно тому, как это делают с белками, на основе различий в их зарядах или по их способности связываться с теми или иными реагентами (см. разд. 4.4.3). Более того, если бы даже какую-нибудь схему очистки и можно было предложить, понадобилось бы очень много ДНК для того, чтобы получить нужный ген в количестве, достаточном для последующих экспериментов. Решение всех этих проблем стало реальным, когда были открыты 327 Рис. 5-78. Липкие концы, образующиеся под действием многих рестрицирующих нуклеаз (см. рис. 4-63), обеспечивают возможность соединения двух фрагментов ДНК за счет комплементарных взаимодействий. Фрагменты ДНК, соединившиеся таким путем, связываются затем ковалентно в высокоэффективной реакции, катализируемой ДНК-лигазой. Здесь представлен случай образования рекомбинантной молекулы ДНК, состоящей из плазмиды и встроенной в нее хромосомной ДНК. ферменты, названные рестрицирующими нуклеазами (рестриктазами). Эти ферменты, которые можно выделить в очищенном виде из бактериальных клеток, разрезают двойную спираль ДНК по специфическим последовательностям из 4-8 нуклеотидов, разделяя ее на фрагменты строго определенного размера (их называют рестрикционными фрагментами). Специфичность рестрицирующих нуклеаз в отношении нуклеотидных последовательностей у разных видов бактерий различна, так что не очень трудно подобрать такую рестриктазу, которая вырежет небольшой фрагмент ДНК, содержащий определенный ген. Размер этого рестрикционного фрагмента и послужит затем ориентиром для частичной очистки данного гена (выделения его из смеси). Еще одно свойство рестрицирующих нуклеаз делает их удобным инструментом для клонирования генов. Многие из них вызывают ступенчатые разрывы, вследствие чего на обоих концах фрагмента ДНК образуются короткие одноцепочечные «хвосты». Их называют липкими концами, потому что они способны к комплементарному взаимодействию с любым другим концом, образовавшимся под действием того же фермента. Благодаря липким концам, образуемым рестрицирующей нуклеазой, два фрагмента двойной спирали ДНК, происходящие из разных геномов, могут соединиться в одно целое путем спаривания оснований (рис. 5-78). Можно, например, присоединить in vitro фрагмент ДНК, содержащий какой-нибудь ген человека, к хромосоме вируса бактерий и полученную таким путем новую рекомбинантную молекулу ДНК ввести затем в бактериальную клетку. Начав с одной этой рекомбинантной молекулы ДНК, инфицировавшей одну бактериальную клетку, репликационная машина вируса может менее чем за сутки выработать свыше 10 12 идентичных молекул вирусной ДНК, а значит, точно в такой же мере размножить и присоединенный к ней фрагмент ДНК человека. Вирус, используемый для подобной цели, называют клонирующим вектором. 5-51 5.6.2. Получение библиотеки ДНК с помощью вирусных или плазмидных векторов [56] Клонирование того или иного гена начинается с создания библиотеки ДНК в вирусном или плазмидном векторе. Принципы, лежащие в основе клонирования генов, для обоих этих типов векторов одинаковы, хотя в деталях методы могут и различаться. Ради простоты мы в этой главе пренебрежем различиями и проиллюстрируем методы, о которых идет речь, применительно к плазмидам. Плазмидные векторы, используемые при клонировании генов, пред- 328 Рис. 5-79. Очистка и амплификация специфической последовательности ДНК путем клонирования ДНК в бактериальных клетках. ставляют собой небольшие кольцевые молекулы двухцепочечной ДНК, происходящие от более крупных плазмид, обычно присутствующих в клетках бактерий, дрожжей и млекопитающих (см. разд. 5.5.11). Как правило, они составляют лишь небольшую фракцию всей ДНК клетки-хозяина, однако благодаря малым размерам их можно легко отделить от молекул хромосомной ДНК, которые, будучи более крупными, при центрифугировании оказываются на дне пробирки. Клонирование начинают с того, что очищенные кольцевые молекулы плазмидной ДНК обрабатывают одной из рестриказ и получают таким путем линейные молекулы ДНК. Затем клеточную ДНК, из которой требуется создать библиотеку, разрезают при помощи той же рестриктазы и полученные рестрикционные фрагменты (включая и те, в которых присутствует клонируемый ген) добавляют к разрезанным плазмидам, а затем подвергают отжигу, для того чтобы могли образоваться рекомбинантные кольцевые молекулы ДНК. Ковалентное сшивание под действием ДНК-лигазы завершает образование этих рекомбинантных молекул, содержащих вставки чужеродной ДНК (см. рис. 5-78). Следующий шаг к получению библиотеки ДНК состоит в том, что рекомбинантные кольцевые молекулы ДНК вводят в клетки (обычно бактериальные или дрожжевые), сделав их для этой цели временно проницаемыми для ДНК; клетки, как принято говорить, трансфицируют плазмидами. Теперь, когда эти клетки растут и делятся, рекомбинантные плазмиды также реплицируются, в результате чего получается в конце концов огромное количество копий кольцевых молекул, содержащих чужеродную ДНК (рис. 5-79). Многие бактериальные плазмиды несут в себе гены устойчивости к антибиотикам. Это их свойство можно использовать для того, чтобы отделить трансфицированные клетки от тех, которые остались нетрансфицированными: если выращивать бактерии в присутствии антибиотика, то выживут и образуют колонии только те клетки, которые содержат плазмиды. Эти выжившие клетки и заключают в себе библиотеку ДНК. Однако лишь немногие из них несут те рекомбинантные плазмиды, в которых находится подлежащий выделению ген. Надо уметь их идентифицировать, чтобы получить интересующую нас ДНК в очищенном виде и в достаточном количестве. Прежде чем говорить о том, каким способом можно этого достичь, нам следует описать и другой путь получения библиотеки ДНК, также используемый при клонировании. |