Молекулярная биология клетки. Том 1. Молекулярная биология клетки 2Molecular Bruce Alberts, Dennis Bray,Biology
 Скачать 25.6 Mb.
|
|
Рис. 5-48 . Схема эксперимента, иллюстрирующего работу системы коррекции неправильного спаривания, устраняющей у бактерий ошибки репликации ДНК. Особый белковый комплекс удаляет неспаренные нуклеотиды из вновь синтезируемой цепи ДНК позади репликационной вилки, этот репарирующий комплекс узнает новую цепь ДНК по обнаруживаемым в ней неметилированным последовательностям GATC. На схеме представлены три молекулы ДНК с одной и той же «неправильной» парой нуклеотидов, но при этом в одной молекуле (А) метилированные последовательности GATC встречаются в обеих цепях, в другой молекуле (Б) таких метилированных последовательностей нет совсем, а в третьей (В) они присутствуют только в одной из цепей. Если воздействовать на эти молекулы ДНК клеточным экстрактом, содержащим корректирующий комплекс, то мы получим представленный здесь результат. Молекула ДНК в правой части рисунка воспроизводит картину, обнаруживаемую непосредственно за репликационной вилкой: нижняя цепь соответствует новой цепи, где метилирование еще не произошло. 296 няются ко всем остаткам А в последовательности GATC, но лишь спустя некоторое время после того, как А включится в новосинтезированную цепь ДНК. Новые цепи отличаются от старых тем, что только в них сразу же за репликационной вилкой могут находиться еще не метилированные последовательности GATC. Коррекция неправильного спаривания осуществляется крупным мультиферментным комплексом, сканирующим каждую из двух цепей двойной спирали ДНК. Этот комплекс удаляет только неправильно присоединенные нуклеотиды, но делает это лишь после того, как на той же цепи обнаружится и неметилированная последовательность GATC. Поэтому нуклеотиды удаляются только из новой цепи, т. е. устраняются ошибки репликации (рис. 5-48). В эукариотических клетках не удалось пока выявить ни одного из этих двух механизмов коррекции, обнаруженных у бактерий. Однако степень точности репликации у млекопитающих и у Е. coli приблизительно одинакова, и потому можно думать, что оба описанных типа коррекции существуют и у эукариот. Следует, впрочем, отметить, что в ДНК млекопитающих нет метилированных остатков А, поэтому механизм, который используется системой репарации ошибок спаривания для узнавания новосинтезированной цепи, должен быть в данном случае иным. 5-27 5.3.9. Репликационные вилки возникают в точках начала репликации [32] И у бактерий, и у млекопитающих образование репликационных вилок начинается с возникновения особой структуры, называемой репликационным глазком (replication bubble). Это небольшой участок, в котором две цепи родительской спирали ДНК отделились одна от другой и были использованы в качестве матриц для синтеза ДНК (рис. 5-49). Для бактерий и некоторых вирусов, размножающихся в эукариотических клетках, удалось показать, что репликационный глазок образуется в тех местах молекулы ДНК, где находятся специфические нуклеотидные последовательности, получившие название точек начала репликации. Эти последовательности состоят приблизительно из 300 нуклеотидов. Предполагают, что аналогичные точки начала репликации существуют и в эукариотических хромосомах, однако надежных доказательств этого пока нет (см. разд. 9.3.2). Процесс возникновения репликационных вилок удалось в некоторых случаях воспроизвести in vitro. Эти опыты показали, что у бактерий и бактериофагов инициация репликационных вилок начинается так, как это представлено на рис. 5-50. Множество копий инициаторного белка связываются с особыми участками в точке начала репликации, образуя крупный белковый комплекс. Этот комплекс присоединяет затем ДНК- геликазу и помещает ее на свободную одиночную цепь ДНК в прилегающем участке спирали. Присоединяется также ДНК-праймаза, т. е. образуется праймосома, которая, двигаясь от точки начала репликации, синтезирует РНК-затравку, что дает возможность начать синтез первой цепи ДНК. Остальные белки быстро объединяются после этого в два репликационных белковых комплекса, которые теперь движутся от точки начала репликации в противоположных направлениях (см. рис. 5-49); они продолжают синтезировать ДНК до тех пор, пока обе вилки не пройдут путь по матрице до самого конца. Некоторые дополнительные данные, касающиеся инициации репликационных вилок в хромосомах эукариот, мы обсудим в гл. 9, там, где речь пойдет о клеточном ядре. Рис. 5-49. Гипотетический механизм образования репликационных вилок в точках начала репликации (см. также рис. 5-50). 297 Рис. 5-50. Упрощенная схема, иллюстрирующая начальные этапы образования репликационных вилок в точках начала репликации у Е. соlі и бактериофага λ. Для обнаружения данного механизма потребовались опыты in vitro с использованием смеси высокоочищенных белков. Последующие этапы приводят (пока не ясным путем) к инициации еще трех цепей ДНК (рис. 5-49). У Е . соlі в репликации ДНК роль инициаторного белка играет белок dnaA; а праймосома состоит из белков dnaB (ДНК-геликаза) и dnaG (ДНК-праймаза). 5.3.10. ДНК-топоизомеразы предотвращают спутывание ДНК во время репликации [33] Изображая спираль ДНК так, как мы это делали до сих пор, т.е. неправильно, в виде плоской «лестницы», мы игнорировали «проблему закручивания» (winding problem). Между тем на каждые 10 пар оснований, образующихся в репликационной вилке, родительская двойная спираль должна совершить один полный оборот вокруг своей оси. Следовательно, для того чтобы репликационная вилка могла продвигаться вперед, вся хромосома впереди нее должна быстро вращаться (рис. 5-51), что для длинных хромосом потребовало бы большой затраты энергии. При репликации ДНК эта проблема решается иначе: путем образования в спирали своего рода «шарнира», особого класса белков, называемых ДНК- топоизомеразами. ДНК-топоизомераза представляет собой нечто вроде «обратимой нуклеазы». Сначала она разрывает цепь ДНК, а затем ковалентно присоединяется к разорванному концу. Ковалентная связь белок — ДНК обладает довольно значительной энергией, потому что в ней сохраняется энергия разорванной фосфодиэфирной связи. Вследствие этого реакция, приводящая к разрыву цепи, обратима и не требует дополнительной затраты энергии. В этом отношении данный механизм существенно отличается от механизма действия ДНК-лигазы, о котором мы говорили выше (см. рис. 5-35). Существуют различные типы ДНК-топоизомераз. Топоизомераза типа I разрывает только одну из двух цепей двойной спирали ДНК, что дает возможность двум участкам ДНК по обе стороны от разрыва Рис. 5-51. «Проблема кручения», возникающая при репликации ДНК. Для того чтобы репликационная вилка (у бактерий) могла продвигаться вперед со скоростью 500 нуклеотидов в 1 с, родительская спираль ДНК перед вилкой должна вращаться со скоростью 50 об/с. 298 Рис. 5-52. Обратимая реакция, приводящая к появлению разрыва в одной из цепей ДНК. Реакция у эукариот катализируется ДНК-топоизомеразой типа I Ферменты этой группы образуют временную ковалентную связь с ДНК. свободно вращаться относительно друг друга вокруг фосфодиэфирной связи, находящейся напротив разрыва, которая в этом случае выполняет роль упомянутого выше «шарнира» (рис. 5-52). Всякое напряжение в спирали ДНК заставляет ее вращаться в таком направлении, чтобы ослабить это напряжение. Поэтому вращение во время 299 Рис. 5-53. Пример реакции разделения двух сцепленных кольцевых молекул ДНК, катализируемой ДНК-топоизомеразой типа II. Действие этих ферментов (в отличие от реакций, катализируемых ДНК-топоизомеразами типа I) сопряжено с гидролизом АТР и некоторые из них способны сообщать спирали ДНК дополнительное напряжение. ДНК-топоизомеразы типа II обнаруживаются и у прокариот, и у эукариот, по всей вероятности, они участвуют во многих реакциях, имеющих отношение к ДНК. репликации ДНК происходит лишь на коротком отрезке спирали - в той части, которая находится непосредственно перед репликационной вилкой. Аналогичная проблема, возникшая в процессе транскрипции ДНК, решается таким же путем. Топоизомераза типа II ковалентно связывается с обеими цепями двойной спирали ДНК и вносит в нее на время двухцепочечный разрыв. Ферменты этого типа активируются под действием тех участков на хромосомах, где перекрестились спирали. Присоединившись к такому перекресту, топоизомераза: 1) обратимо разрывает одну из двух двойных спиралей, создавая тем самым для другой своего рода «ворота», 2) вынуждает вторую двойную спираль пройти через этот разрыв и 3) сшивает обе разорванные цепи, а затем отделяется от ДНК. Действуя подобным образом, топоизомеразы типа II очень быстро разделяют две сцепленные кольцевые молекулы ДНК (рис. 5-53). Точно так же предотвращают они и спутывание молекул ДНК, которое в противном случае неизбежно создавало бы при репликации серьезную проблему. Известны температурочувствительные мутанты дрожжей, вырабатывающие топоизомеразу II, которая при 37°С инактивируется. Если нагреть эти дрожжевые клетки до такой температуры, то их хромосомы в процессе митоза остаются спутанными и не могут разойтись. Насколько необходим для распутывания хромосом такой «инструмент», как топоизомераза II, поймет каждый, кто хоть раз пытался распутать безнадежно запутавшуюся леску, не имея под рукой ножниц. 5-28 5.3.11. Репликация ДНК у эукариот и прокариот в основных чертах сходна [24] Почти все, что мы знаем о репликации ДНК, удалось выяснить в опытах с очищенными мультиферментными системами бактерий и бактериофагов, способными осуществлять репликацию ДНК in vitro. Получение таких систем в 1970-х годах заметно облегчилось после того, как удалось выделить мутанты по целому ряду различных генов, ответственных за репликацию, которые можно было использовать для идентификации и очистки соответствующих белков (рис. 5-54). У эукариот энзимология репликации ДНК пока еще детально не изучена, главным образом потому, что получать здесь необходимые мутантные формы гораздо труднее. Однако схема репликации у прокариот и эукариот в основных чертах, включая геометрию репликационной вилки и потребность в РНК-затравке, по-видимому, одинакова. Главное различие заключается в том, что у эукариот ДНК реплицируется не как таковая, а в виде хроматина, в котором она прочно связана с белками, принадлежащими к классу гистонов. В гл. 8 мы узнаем, что гистоны образуют комплексы в форме дисков, вокруг которых обвивается эукариотическая ДНК, в результате чего возникают регулярно повторяющиеся структуры, называемые нуклеосомами. Нуклеосомы располагаются вдоль молекулы ДНК с интервалами 200 пар оснований. Быть может, именно этим объясняется тот факт, что новые фрагменты отстающей цепи ДНК закладываются у эукариот с интервалами в 10 раз более короткими (от 100 до 200 нуклеотидов), чем у бактерий (от 1000 до 2000 нуклеотидов). Кроме того, если нуклеотиды служат барьерами, на время останавливающими продвижение ДНК-полимеразы, присутствие хроматина (а не голой ДНК) может, вероятно, объяснить и то, что репликационные вилки движутся у эукариот приблизительно в 10 раз медленнее, чем у бактерий. 300 Рис. 5-54. Получение у бактерий и бактериофагов мутантов с различными нарушениями репликации ДНК открыло возможности для выявления и очистки ферментов, выполняющих какую-либо еще не известную функцию, необходимую для репликации ДНК у прокариот. Использованные здесь температурочувствительные мутанты принадлежат к так называемым условным мутантам, обычно их фермент нормально функционирует при низкой температуре и не работает при высокой. У «безусловных» мутантов с нарушениями репликации синтез ДНК не идет ни при низкой, ни при высокой температуре, и потому эти мутанты обречены на гибель. В модифицированной форме такие «тесты на комплементацию in vitro» полезны также при биохимическом изучении многих других процессов. Заключение Самокорректирующая ДНК-полимераза катализирует полимеризацию нуклеотидов на обеих цепях спирали ДНК в направлении 5' → 3', копируя матрицу с высокой степенью точности. Поскольку две цепи двойной спирали ДНК аптипараллелъны, в направлении 5' → 3' может непрерывно синтезироваться лишь одна из двух цепей (ее называют ведущей). Другая, отстающая цепь синтезируется в виде коротких фрагментов по принципу «шитья назад иголкой». Самокорректирующая ДНК-полимераза не способна начинать синтез новой цепи. Поэтому для закладки фрагментов отстающей цепи ДНК используются короткие молекулы РНК-затравки, которые позже удаляются - их заменяет ДНК. Процесс репликации ДНК требует совместного действия многих белков. В нем участвуют: 1) ДНК-полимераза и ДНК-праймаза, катали- 301 зирующие полимеризацию нуклеозидтрифосфатов; 2) ДНК-геликазы и дестабилизирующие белки, помогающие расплести спираль ДНК, которую предстоит копировать; 3) ДНК-лигаза и фермент, разрушающий молекулы РНК-затравки; они нужны для сшивания прерывисто синтезируемых фрагментов отстающей цепи ДНК; 4) ДНК-топоизомеразы, помогающие решить проблемы кручения и спутывания спирали ДНК; 5) инициаторные белки, присоединившиеся к специфическим последовательностям ДНК в точке начала репликации и способствующие образованию здесь новой репликационной вилки. В точке начала репликации к ДНК-матрице сначала присоединяется белковый комплекс, состоящий из ДНК- геликазы и ДНК-праймазы (его называют праймосомой); затем к этому комплексу добавляются другие белки и возникает мультиферментный комплекс —«репликационная машина», которая и осуществляет синтез ДНК. 5.4. Механизмы генетической рекомбинации [35] В двух предыдущих разделах этой главы мы рассмотрели механизмы, благодаря которым нуклеотидные последовательности ДНК передаются в ряду клеточных поколений почти неизменными. Генетическая стабильность крайне важна для выживания, когда речь идет о сравнительно коротких сроках, но для длительного существования вида необходима генетическая изменчивость, которая позволяла бы приспосабливаться к изменяющейся среде. Следовательно, важным свойством ДНК следует считать ее способность к перестройкам, которые могут изменять и комбинацию генов в данном геноме, и их экспрессию (ее время и степень). Перестройки в ДНК представляют собой результат генетической рекомбинации. События, из которых слагается генетическая рекомбинация, могут быть подразделены на два больших класса: общая рекомбинация и сайт-специфическая рекомбинация. В процессе общей рекомбинации генетический обмен происходит между гомологичными нуклеотидными последовательностями ДНК, по большей части между двумя копиями одной и той же хромосомы. Одним из самых известных примеров такого рода служит обмен участками гомологичных хромосом (гомологов) в процессе мейоза. Этот обмен (кроссинговер), происходящий между плотно конъюгированными хромосомами на ранних стадиях развития яйца или сперматозоида (см. разд. 15.2.3), создает возможность для опробования разных вариантов (аллелей) одного и того же гена в новых комбинациях с другими генами и тем самым повышает шансы на выживание в изменяющейся среде (по крайней мере для некоторых членов скрещивающейся популяции (см. разд. 15.2.2). Мейоз свойствен только эукариотам, но преимущества подобного комбинирования генов настолько велики, что и у прокариотических организмов развились в ходе эволюции такие процессы, как скрещивание и перегруппировка генов путем общей генетической рекомбинации. Сайт-специфическая рекомбинация отличается от общей рекомбинации тем, что для ее осуществления не требуется гомологии ДНК. В обмен вступают короткие специфические нуклеотидные последовательности одной и той же или обеих спиралей ДНК, участвующих в этом процессе, распознаваемые особым сайт-специфическим рекомбинационным ферментом. Таким образом, сайт-специфическая рекомбинация изменяет распределение нуклеотидных последовательностей в геноме. Иногда эти изменения приурочены к каким-то этапам и определенным образом организованы, как, например, при исключении интегрированного бактериофага из бактериальной хромосомы. Однако они могут носить и совершенно случайный характер, например при включении в геном подвижных (мобильных) элементов. 302 Что касается биохимии генетической рекомбинации, то как и в случае репликации ДНК, большую часть того, что мы знаем об этих процесса, удалось выяснить в исследованиях на простых организмах, в частности на Е. coli и ее вирусах. 5-31 5.4.1. Процессы общей рекомбинации направляются взаимодействиями, обусловленными спариванием основа™ между комплементарными цепями гомологичных спиралей ДНК [36] Общая рекомбинация включает ряд промежуточных этапов, для понимания которых необходимо затратить определенные усилия. Кроме того механизм обмена между цепями ДНК, по-видимому, несколько различается у разных организмов. Однако детальный генетический анализ скрещивания у бактерий, вирусов и грибов дает основания считать, что в целом результаты общей рекомбинации всегда одинаковы: 1. Две гомологичные двойные спирали ДНК разрываются и разорванные концы одного гомолога соединяются с соответствующими концами другого, так что вновь получаются две целые спирали ДНК но теперь уже каждая из них состоит из частей двух исходных молекул ДНК (рис. 5-55). 2. Точка обмена (т.е. то место, где на рис. 5-55 красная спираль соединяется с черной) может прийтись на любой участок гомологичных нуклеотидных последовательностей хромосом. 3. В точке обмена каждая полинуклеотидная цепь одной из спиралей соединяется путем спаривания оснований с цепью другой спирали, и между двумя разными спиралями ДНК возникает ступенчатое (гетеродуплексное) соединение (рис. 5-56). Такие соединения могут состоять из нескольких тысяч пар оснований. Как именно они возникают, мы объясним позже. 4. В точке обмена не происходит изменения нуклеотидных последовательностей. Точность разрыва и воссоединения настолько велика, что ни один нуклеотид не утрачивается, не добавляется и не превращается в какой-нибудь другой. Механизм общей рекомбинации таков, что в обмен могут вступать только два участка спирали ДНК, нуклеотидные последовательности которых обладают высокой степенью гомологии. Обеспечивается это наличием гетеродуплексного соединения в точке обмена, поскольку такое соединение может образоваться лишь в том случае, если комплементарные взаимодействия между цепями, принадлежавшими двум исходным спиралям, происходят на достаточно длинном участке. Но как именно возникает это ступенчатое соединение и как две гомологичные спирали ДНК, которые должны спариться, распознают гомологию своих нуклеотидных последовательностей? Как мы увидим, гомологичные участки сначала узнают друг друга непосредственно путем комплементарного спаривания. В дальнейшем образование пар оснований между комплементарными цепями, принадлежащими двум спиралям ДНК, направляет общую рекомбинацию таким образом, что она происходит лишь в пределах достаточно протяженной области гомологии двух нуклеотидных последовательностей ДНК. Однако и при соблюдении этого условия общая рекомбинация нередко ведет к перераспределению нуклеотидных последовательностей ДНК; гетеродуплексное соединение может заключать в себе небольшое число неправильных пар оснований и, что еще более важно, две спирали ДНК, претерпевающие кроссинговер, бывают обычно не вполне одинаковыми по обе стороны от этого соединения. |