Молекулярная биология клетки. Том 1. Молекулярная биология клетки 2Molecular Bruce Alberts, Dennis Bray,Biology
 Скачать 25.6 Mb.
|
|
283 ← Рис. 5-35. Фермент ДНК-лигаза восстанавливает разорванную фосфодиэфирную связь. Из схемы видно, что ДНК-лигаза использует сначала молекулу АТР, для того чтобы активировать в точке разрыва 5'-конец поврежденной цепи (1-й этап), и лишь после этого образует новую связь (2-й этап). Энергетически невыгодная реакция сшивания разрыва осуществляется, таким образом, благодаря сопряжению с энергетически выгодным процессом гидролиза АТР. У больных синдромом Блума (одно из наследственных заболеваний) обнаружена частичная недостаточность ДНК- лигазы. В связи с этим у них нарушена репарация повреждений ДНК и как следствие повышена частота заболевания раком. Ферменты ДНК-полимераза и ДНК-лигаза играют важную роль в метаболизме ДНК: оба этих фермента участвуют не только в репарации, но и в репликации ДНК. Катализируемые ими реакции иллюстрируют соответственно рис. 5-34 и 5-35. 5-18 5-19 5.2.8. Различные типы повреждений в ДНК распознаются разными ферментами [22] Способ, каким в процессе репарации осуществляется удаление поврежденного участка, зависит от типа повреждения. Например, при апуринизации (наиболее часто встречающемся повреждении ДНК) один из остатков дезоксирибозы лишается ранее находившегося при нем основания (см. рис. 5-31). Фермент АП-эндонуклеаза быстро распознает данный остаток дезоксирибозы и разрывает в этом измененном участке цепи фосфодиэфирную связь. После этого поврежденный нуклеотид удаляется и правильная последовательность нуклеотидов восстанавливается при помощи механизма, представленного на рис. 5-33. Другой, близкий к этому, путь репарации связан с участием особого набора ферментов, называемых ДНК-гликозилазами. Каждый из этих ферментов узнает какой-либо один определенный тип измененных оснований в ДНК и катализирует гидролитическое отщепление такого основания. Существует, как полагают, не менее шести типов ферментов, входящих в эту группу. Среди них имеются ферменты, удаляющие дезаминированный цитозин, дезаминированный аденин, алкилированные основания разных типов, основания с разомкнутым кольцом и основания, в которых двойная углерод-углеродная связь заменена простой. Общий для всех случаев механизм проиллюстрирован на рис. 5-36 конкретным примером. Здесь представлено удаление дезаминированного цитозина. Сначала фермент урацил-ДНК-гликозилаза удаляет измененное основание (урацил). Дезоксирибозу, утратившую бывшее при ней основание, узнает другой фермент-АП-эндонуклеаза. Поскольку это тот самый фермент, который узнает апуринизированные участки ДНК, восстановление правильной последовательности идет далее тем же путем, который мы уже описали для случая апуринизации. В итоге U, возникший вследствие случайного дезаминирования, вновь замещается на С. Важность процесса удаления из ДНК случайно дезаминированных оснований удалось продемонстрировать непосредственно на конкретных примерах. Один из них касается бактериальных штаммов, у которых вследствие мутации отсутствует фермент урацил-ДНК-гликозилаза. Выяснилось, что у таких мутантов частота спонтанных замен C-G на Т-А (в норме низкая) возрастает приблизительно в 20 раз. В клетках имеется особый путь для удаления почти любого типа повреждения в ДНК, затрагивающего очень большой ее участок. Такие обширные повреждения возникают, например, при ковалентных взаимо- 284 действиях между основаниями ДНК и объемистыми углеводородами, в частности бензпиреном, обладающим канцерогенными свойствами. К ним же относятся и различные пиримидиновые димеры (Т-Т, Т-С и С-С), возникающие под действием солнечных лучей (см. рис. 5-32). В подобных случаях крупный мультиферментный комплекс узнает не какое-либо одно специфическое изменение основания, а обширное повреждение двойной спирали ДНК. Фосфодиэфирные связи поврежденной цепи по обе стороны от повреждения разрываются и измененный участок удаляется весь целиком. После этого восстановление нормальной последовательности происходит как обычно. О роли репарационных процессов свидетельствует тот факт, что клетки затрачивают большую часть своих ресурсов на производство репарационных ферментов. Обширные исследования, проведенные на дрожжах, выявили у них свыше 50 различных генов, кодирующих такие ферменты. Не менее сложны пути репарации ДНК у человека. Выяснилось, что у больных с пигментной ксеродермой нарушен процесс репарации обширных повреждений, в котором, как показывает генетический анализ, участвует не менее 7 различных генных продуктов. У таких больных в клетках накапливаются пиримидиновые димеры, что приводит к тяжелому поражению кожи, включая рак. 5-15 5.2.9. Клетки синтезируют репарирующие ферменты в ответ на повреждение ДНК [23] В процессе эволюции клетки выработали много различных механизмов, обеспечивающих их выживание в этом мире, полном всевозможных опасностей. Часто какое-нибудь резкое воздействие среды активирует целый набор именно тех генов, продукты которых способны защитить клетки от этого воздействия. Всем клеткам присущ, например, такой механизм, как реакция на тепловой шок; ее можно наблюдать в клетках, подвергшихся действию чрезмерно высоких температур. При этом индуцируется синтез особых «шоковых» белков; часть из них, по- видимому, помогает стабилизировать и репарировать другие клеточные белки, частично денатурированные тепловым шоком. Во многих клетках существуют также механизмы, дающие им возможность синтезировать ферменты для репарации ДНК, так сказать, в аварийных ситуациях, в ответ на серьезные повреждения ДНК. Среди примеров такого рода лучше всего изучен SOS-ответ (SOS-репарация) у Е. со/г. У этой бактерии любое нарушение репликации ДНК, вызванное ее повреждением, ведет к появлению сигнала (таким сигналом служит, по- видимому, избыток одноцепочечной ДНК), усиливающего транскрипцию более чем 15 различных генов, многие из которых кодируют белки, участвующие в репарации ДНК. Сигнал активирует у Е. coli белок (см. разд. 5.4.4), который затем разрушает другой белок - отрицательный регулятор активности генов (репрессор). Действие этого репрессора заключается в подавлении у Е. coli транскрипции всего набора генов, участвующих в SOS-ответе. Изучение бактериальных мутантов с различными нарушениями SOS-репарации показало, что новосинтезированные белки обусловливают два эффекта. Во-первых, их индукция повышает выживаемость клеток: если мутанты, у которых синтез таких ферментов нарушен, подвергнуть действию тех или иных агентов, вызывающих повреждение ДНК (например, ультрафиолетовых лучей), то процент погибших клеток окажется необычно высоким. Во-вторых, некоторые из индуцированных белков вызывают временное повышение частоты мутаций, вследствие чего генетическая изменчивость бактериальной популяции возрастает. Выгода здесь, видимо, заключается в том, что 285 таким путем увеличивается шансы на появление мутантной клетки с повышенной приспособленностью. Существуют и другие индуцируемые системы репарации ДНК. Известно, например, что одна из них у бактерий активируется присутствием в ДНК метилированных нуклеотидов. Аналогичная система функционирует в клетках дрожжей. Есть сведения, что и некоторые высшие эукариотические клетки адаптируются к повреждениям ДНК аналогичным путем. 5.2.10. Особенности структуры и химические свойства двойной спирали ДНК облегчают ее репарацию Молекула ДНК имеет структуру, по-видимому, наилучшим образом приспособленную для репарации. Если гипотеза о том, что РНК появилась в процессе эволюции раньше, чем ДНК верна (см. разд. 1.1.7), возникает вопрос, почему присутствующий в РНК урацил (U) был в ДНК заменен на тимин (Т). Очевидно, это можно объяснить тем, что механизм, осуществляющий удаление дезаминированных остатков цитозина (рис. 5- 36), не смог бы функционировать, если бы четвертым нуклеотидом в ДНК был урацил, а не тимин (т. е. не 5-метилурацил). Спонтанное дезаминирование С дает U, и потому фермент, узнающий и удаляющий такие случайно возникшие остатки U, наряду с ними удалял бы и остатки U, которые были бы нормальными компонентами этой ДНК. Аналогичным образом обстоит дело и в другом случае, а именно в выборе гуанина вместо гипоксантина. Простейший пурин, специфически спаривающийся с С, - это гипоксантин. Но гипоксантин является непосредственным продуктом дезаминирования А (рис. 5-37). Добавив к гипоксантину вторую аминогруппу, эволюция создала гуанин, который не может образоваться из А в результате его спонтанного дезаминирования. Таким образом, любое возможное дезаминирование в ДНК ведет к появлению необычного основания, которое именно в силу своей необычности может быть сразу же распознано и удалено специальной ДНК-гликозилазой (рис. 5-37). Итак, сама химическая природа оснований гарантирует, что дезаминирование не останется незамеченным. Однако точная репарация (а вместе с тем и радикальное решение шрёдингеровской дилеммы) возможна благодаря существованию двух копий генетической информации, каждая из которых представлена одной из двух цепей двойной спирали ДНК. Лишь в случае крайне маловероятного события, а именно одновременного повреждения обоих членов одной и той же пары оснований, в клетке не окажется ни одной правильной копии, которая могла бы служить матрицей для репарации ДНК. Генетическая информация может также храниться в одноцепочечной ДНК или РНК, и некоторые очень мелкие вирусы обладают одно- цепочечными геномами, содержащими лишь несколько тысяч нуклеотидов. Описанные выше механизмы не в состоянии осуществлять репарацию таких нуклеиновых кислот, и потому частота мутаций у этих вирусов весьма велика. Лишь организмы с совсем крошечными геномами могут позволить себе хранить генетическую информацию не в двойной спирали ДНК, а в иных структурах. Рис. 5-36. Путь репарации ДНК с участием урацил-ДНК-гликозилазы, восстанавливающий в цепи ДНК цитозин после его случайного дезаминирования. После действия ДНК-гликозилазы сахарофосфат, утративший бывшее при нем основание, удаляется из цепи АП-эндонуклеазой, тем же ферментом, который участвует и в репарации апуринизированных участков. Далее следуют этапы, показанные на рис. 5-33. В названии «АП-эндонуклеаза» отражен тот факт, что данный фермент распознает в спирали ДНК любой участок, содержащий остаток дезоксирибозы, утративший бывшее при нем основание. Утраченное основание может быть либо пурином (апуринизированные участки), либо пиримидином (апиримидинизированные участки). 286 Рис. 5-37. Продукты спонтанного дезаминирования различных оснований ДНК. Все эти продукты дезаминирования необычны в составе ДНК и распознаются именно по этой причине. Заключение Судить о надежности сохранения нуклеотидных последовательностей ДНК у высших эукариот можно, исходя из скорости изменения аминокислотных последовательностей второстепенных белков и нуклеотидных последовательностей ДНК на протяжении эволюционного времени. Эта надежность столь велика, что за год в геноме млекопитающего, насчитывающем 3 • 10 9 пар оснований, в среднем происходит всего лишь 10-20 замен оснований, затрагивающих клетки зародышевой линии. В то же время в геноме такого размера из-за неизбежных процессов химического распада ежедневно повреждаются тысячи нуклеотидов ДНК. Генетическая информация может надежно храниться в нуклеотидных последовательностях ДНК лишь потому, что широкий набор различных репарирующих ферментов осуществляет непрерывный «осмотр» ДНК и удаляет из нее поврежденные нуклеотиды. Процесс репарации ДНК основан на том, что генетическая информация представлена в этой молекуле двумя копиями - по одной в каждой из двух цепей двойной спирали ДНК. Благодаря этому случайное повреждение в одной из цепей может быть удалено репарирующим ферментом и данный участок цепи ресинтезирован в своем нормальном виде за счет информации, содержащейся в неповрежденной цепи. 287 5.3. Механизмы репликации ДНК [24] Живые организмы должны не только поддерживать целостность нуклеотидных последовательностей ДНК путем ее репарации, но еще и очень точно воспроизводить свою ДНК перед каждым клеточным делением. При репликации ДНК скорость полимеризации колеблется в пределах от 500 нуклеотидов в 1 с у бактерий приблизительно до 50 нуклеотидов у млекопитающих. Ясно, что ферменты, катализирующие процесс репликации, должны работать и точно, и быстро. Быстрота и точность достигаются с помощью особого мультиферментного комплекса, направляющего процесс репликации. Этот комплекс, состоящий из нескольких различных белков, представляет собой сложный и совершенный «аппарат репликации». 5.3.1. Репликация ДНК, как и ее репарация, основана на комплементарном спаривании оснований [25] Матричная активность ДНК проявляется в том, что ее нуклеотидная последовательность копируется (целиком или частично) путем комплементарного спаривания оснований (А с Т или G с С) в виде комплементарной последовательности нуклеотидов ДНК или РНК. Этот процесс предполагает узнавание каждого нуклеотида в ДНК свободным (неполимеризованным) комплементарным нуклеотидом и обязательное разделение (хотя бы на время) двух цепей ДНК, с тем чтобы в каждом основании группы, играющие роль доноров и акцепторов при образовании водородных связей, оказались доступными для комплементарного спаривания. Таким образом поступающие одиночные нуклеотиды выстраиваются в определенном порядке вдоль матричной цепи ДНК для ферментативной полимеризации, продуктом которой является новая полинуклеотидная цепь. В 1957 г. был открыт первый фермент, катализирующий процесс полимеризации нуклеотидов; он был назван ДНК-полимеразой. Было показано, что субстратами ДНК-полимеразы служат дезоксирибонуклеозидтрифосфаты, полимеризующиеся на одно-цепочечной ДНК-матрице (двухступенчатый механизм этой полимеризации представлен на рис. 5-34 в связи с обсуждением процесса репарации ДНК). Позже была выделена и РНК-полимераза, для которой субстратами служат рибонуклеозидтрифосфаты. Во время репликации ДНК каждая из двух ее старых цепей служит матрицей для образования новой цепи. Поэтому чрезвычайно длинная нуклеотидная последовательность клеточной ДНК реплицируется, как это принято называть, «полуконсервативно» и каждая из двух дочерних клеток получает при клеточном делении новую двойную спираль ДНК, состоящую из одной старой и одной новой цепи (см. рис. 3-11). 5-23 5.3.2. Репликационная вилка асимметрична [26] Исследования, проведенные в начале 1960-х годов на реплицирующихся хромосомах, в которые в качестве импульсной метки вводили радиоактивный предшественник ДНК 3 Н-тимидин, выявили особую четко ограниченную область репликации, перемещающуюся вдоль родительской спирали ДНК. Эта активная область из-за своей Y-образной формы была названа репликационной вилкой. Именно в ней с помощью мультиферментного комплекса, содержащего ДНК-полимеразу, синтезируются дочерние молекулы ДНК. В то время казалось вполне вероятным, что простейший механизм репликации ДНК заключается в непрерывном росте обеих новых цепей 288 Рис. 5-38. На первый взгляд простейшим механизмом репликации ДНК представляется механизм, изображенный на этой (неверной!) схеме. Обе дочерние цепи должны были бы при этом расти непрерывно за счет присоединения нуклеотидов соответственно в 5' → 3' - направлении (на рисунке - внизу) и 3' → 5' - направлении (на рисунке - вверху). Однако фермента, который бы катализировал присоединение нуклеотидов в направлении 3' → 5', не существует. нуклеотид за нуклеотидом по мере перемещения репликационной вилки от одного конца молекулы ДНК к другому. Однако, поскольку две цепи в спирали ДНК антипараллельны, одна из дочерних цепей должна расти в направлении 5' → 3', а другая - в направлении 3' → 5'. В таком случае репликационной вилке потребовалось бы две разные ДНК-полимеразы. Одна из них наращивала бы цепь в направлении 5' → 3' (рис. 5-34); при этом каждый поступающий мономер (дезоксирибонуклеозидтрифосфат) приносит с собой необходимую для его присоединения к цепи энергию (ее носителем является трифосфатная группа). Другая ДНК-полимераза, перемещающаяся в направлении 3' → 5', должна катализировать «рост с головы»; в этом случае энергию, необходимую для присоединения каждого очередного нуклеотида, должен нести конец растущей цепи ДНК. В действительности такой (3' → 5') ДНК-полимеразы не существует (рис. 5-38), хотя биохимикам известны некоторые другие процессы полимеризации, протекающие по типу «роста с головы» (см. рис. 2-34), Каким же образом происходит рост цепи в направлении 3' → 5'? Возможный ответ на этот вопрос подсказали в конце 1960-х годов эксперименты с радиоактивно меченными предшественниками ДНК. Если растущие клетки получают всего на несколько секунд высокорадиоактивный 3 Н-тимидин, то метка включается лишь в ДНК, синтезированную в самый последний момент, т. е. в ту ее часть, которая следует непосредственно за репликационной вилкой. Этим методом избирательного введения метки было выявлено, что при репликации бактериальной ДНК в области репликационной вилки образуются и какое-то время существуют фрагменты, насчитывающие от 1000 до 2000 нуклеотидов (впоследствии за ними закрепилось название «фраг- 289 Рис. 5-39. Строение репликационной вилки. Обе дочерние цепи строятся в направлении 5' → 3'. Для этого отстающая цепь ДНК должна синтезироваться в виде ряда коротких фрагментов (фрагменты Оказаки). менты Оказаки»; у эукариот они гораздо короче: от 100 до 200 нуклеотидов). Несколько позже было показано, что синтез этих фрагментов ДНК идет только в направлении 5' → 3'; синтезированные фрагменты соединяются затем в длинные цепи ДНК под действием того же фермента, который сшивает разрывы в спирали ДНК во время ее репарации, т.е. под действием ДНК-лигазы (см. рис. 5-35). Репликационная вилка асимметрична (рис. 5-39). Из двух синтезируемых дочерних цепей ДНК одна строится непрерывной, а другая прерывистой. Первую называют ведущей (или лидирующей), а вторую - |