Молекулярная биология клетки. Том 1. Молекулярная биология клетки 2Molecular Bruce Alberts, Dennis Bray,Biology
 Скачать 25.6 Mb.
|
|
5.6.7. Трансляция in vitro облегчает идентификацию надлежащего клона ДНК [61] Выделение клонов геномной ДНК и кДНК методом гибридизации in situ при всей своей эффективности не вполне удобно тем, что в таких экспериментах отбирается обычно немало и «псевдоположительных» клонов. Требуются дополнительные приемы для того, чтобы отличить их от подлинных. Задача облегчается, если требуемый клон кодирует какой-нибудь белок, ранее уже охарактеризованный иными методами. В этом случае каждый подлежащий проверке клонированный фрагмент ДНК используют для отбора комплементарных ему молекул мРНК из смеси клеточных мРНК посредством процесса, называемого гибридизационной селекцией; при этом избыток данного фрагмента ДНК расщепляют на одиночные цепи, иммобилизуют на фильтре и наносят на этот фильтр смесь мРНК, чтобы отобрать комплементарные молекулы мРНК путем РНК- ДНК-гибридизации (рис. 5-86). Очищенную таким способом мРНК используют затем для синтеза белка в бесклеточной системе, содержащей радиоактивные аминокислоты. Полученный радиоактивный белок исследуют и сравнивают с белковым продуктом, который, согласно ожиданиям, должен быть получен от данного клона. Совпадение их характеристик служит обычно в таком тесте основанием для вывода, что клонируемый фрагмент ДНК кодирует данный белок. 5.6.8. Экспрессирующие векторы могут быть использованы для сверхпродукции белков [62] Очень часто никаких биохимических данных относительно белка, кодируемого тем или иным клонированным фрагментом ДНК, не имеется. Именно так, например, обстоит дело в тех случаях, когда клон, о котором идет речь, был идентифицирован посредством субтрактивной гибридизации или же в результате «прогулки по хромосоме» до соответствующего мутантного гена. Более того, в таких случаях мРНК, кодирующая этот белок, часто присутствует в столь малых количествах или же в столь немногих клетках, что гибридизационная селекция комплементарной мРНК оказывается неосуществимой. При этом приходится прибегать к другим методам, которые дают возможность охарактеризовать белковый продукт клонированного гена. Один из методов состоит в том, чтобы синтезировать короткий фрагмент белка (олигопептид), соответствующий выведенной аминокислотной последовательности белкового продукта секвенированной молекулы кДНК, а затем получить антитела к этому олигопептиду. Эти антитела во многих случаях будут распознавать ту же аминокислотную последова- 336 тельность в составе природного белка, что даст возможность обнаруживать, локализовать и подвергать очистке белок, кодируемый исходной кДНК. Такой иммунологический подход в сочетании с клонированием путем субтрактивной гибридизации эффективен и как способ идентификации белков, специфичных для определенного типа клеток, и как путь к изучению характера дифференцировки, а также свойств и функций каждого типа клеток в многоклеточном организме. Однако самый простой путь, позволяющий охарактеризовать белок, закодированный в какой-нибудь клонированной кДНК, заключается в том, чтобы заставить саму эту кДНК направлять синтез белка в клетке-хозяине. Плазмиды или вирусы выступают в таких случаях в качестве экспрессирующих векторов; их конструируют с таким расчетом, чтобы присоединить клонированную кДНК к той последовательности, которая служит сильным промотором для транскрипции. Исследователи располагают достаточно широким набором экспрессирующих векторов - каждый из них приспособлен для функционирования в клетках того типа, в которых должен синтезироваться данный белок. С помощью этого генноинженерного подхода клетки бактерий, дрожжей и млекопитающих можно заставить вырабатывать большие количества различных ценных белков, таких, как гормон роста человека, интерферон или антитела к вирусам, используемые для приготовления вакцин. Особенно удобны для получения белка бактериальные клетки с плазмидными или вирусными векторами, сконструированными подобным образом; встроенный чужеродный ген обеспечивает нередко свыше 10% от всего синтезируемого клеткой белка. Для клетки синтез такого большого количества какого- нибудь белка оказывается часто непомерной метаболической нагрузкой; поэтому предложены особые «индуцибельные» промоторы, с помощью которых запуск транскрипции можно осуществлять лишь за несколько часов до сбора клеток для выделения из них белка. Некоторые плазмидные экспрессирующие векторы содержат, например, промотор, полученный из бактериофага λ. Работа его регулируется температурочувствительным белковым продуктом генарепрессора; повысив температуру бактериальных клеток до 42°С, можно в любой момент «включить» промотор и быстро получить большое количество требуемого белка. Если библиотека кДНК создана в экспрессирующем векторе, то каждый клон будет продуцировать особый белок и тогда представляющие интерес клоны можно идентифицировать не по их нуклеотидной последовательности, а по их белковым продуктам. При этом в качестве зонда для клонов обычно применяют радиоактивно меченные антитела. Иногда вместо этого можно провести прямой тест, выявляющий биологическую активность продукта данного гена. Особенно эффективен этот метод при поисках эукариотических генов, ответственных за секретируемые факторы роста. Можно, например, клоны кДНК из клеток, вырабатывающих определенный фактор роста, ввести в экспрессирующий вектор, размножающийся в клетках млекопитающих. Смесь трансфицированных клеток, содержащих много таких различных клонов, выращивают на небольшой чашке, где каждая клетка, в которой экспрессируется данный ген, выделяет этот фактор роста в среду. Затем пробы среды испытывают на присутствие данного фактора роста, добавляя их к культурам других клеток, способных реагировать на этот фактор. Тест отличается настолько высокой чувствительностью, что положительный ответ получают даже в том случае, когда в исходной культуре одна клетка из тысячи содержит ген, кодирующий данный фактор роста. Повторное тестирование позволяет отыскать в смеси тот единственный клон, который продуцирует этот фактор. Таким способом удалось открыть ранее неизвестные факторы роста и выделить их за 337 срок, не превышавший нескольких месяцев; если бы процедуру вели обычными биохимическими методами, то для очистки в миллион с лишним раз потребовалась бы чрезвычайно кропотливая работа, которая длилась бы годы. 5-53 5.6.9. Гены можно «перестраивать» и таким путем получать белки с желаемой аминокислотной последовательностью [63] Перестраивая кодирующую последовательность и регуляторные участки гена, можно изменять функциональные свойства его белкового продукта, количество синтезируемого белка и, наконец, менять тип клеток, способных вырабатывать данный белок. В кодирующую последовательность можно вносить весьма существенные изменения, например, можно «пришивать» какую-нибудь ее часть к другому гену, что даст в результате новый гибридный ген, кодирующий комбинированный (составной) белок (fusion protein). Подобные белки часто используются для выявления функций различных доменов белковой молекулы. Известно, например, что большинство ядерных белков содержит особые короткие аминокислотные последовательности, которые распознаются как сигнал для немедленного импорта этих белков в клеточное ядро. Присоединяя искусственно - методом слияния генов - к какому-нибудь цитоплазматическому белку различные части молекулы ядерных белков, можно идентифицировать эти «сигнальные пептиды», ответственные за импорт в ядро. Для более тонкой структурной реорганизации гена (результатом которой является замена одной или нескольких аминокислот в кодируемом белке) требуются специальные методы. Сначала химическим путем синтезируют небольшую молекулу ДНК, содержащую измененную часть нуклеотидной последовательности данного гена. Затем этот синтетический олигонуклеотид гибридизуют с одноцепочечной плазмидой ДНК, в составе которой присутствует последовательность ДНК, подлежащая изменению; гибридизацию ведут в условиях, допускающих спаривание не вполне подходящих партнеров (рис. 5-87). Синтетический олигонуклеотид становится затравкой для ДНК-полимеразы, осуществляющей синтез ДНК, в результате которого образуется молекула, содержащая ген с встроенной в него измененной последовательностью. После этого модифицированный ген включают в экспрессирующий вектор, что позволяет получить измененный белок в достаточном количестве для детального изучения. Заменяя таким путем те или иные аминокислоты в молекуле интересующего нас белка, можно выяснить, какие именно части полипептидной цепи ответственны за такие фундаментальные процессы, как свертывание белка, взаимодействие белка с лигандом или ферментативный катализ. В тех случаях, когда требуется определить, какая именно часть эукариотического гена ответственна за регулирование его экспрессии, предполагаемые регуляторные последовательности ДНК этого гена можно присоединить к кодирующей последовательности другого гена, выбранного с таким расчетом, чтобы в нем был закодирован какой-нибудь легко обнаруживаемый фермент-маркер, в норме в эукариотических клетках отсутствующий. Чаще всего в качестве такого фермента-маркера используется бактериальный белок хлорамфеникол-ацетил-трансфераза (ХАТ). Полученную рекомбинантную молекулу ДНК вводят в эукариотическую клетку, чтобы выяснить, действительно ли предполагаемые регуляторные последовательности стимулируют экспрессию гена ХАТ. Проще всего сделать это, если трансфицировать 338 Рис. 5-87. Использование синтетических олигонуклеотидов для изменения отдельных кодирующих участков гена. Здесь приведены лишь два примера из многих возможных типов таких изменений. С помощью подходящего олигонуклеотида можно, например, заменить одновременно не одну, а несколько аминокислот, можно также вызвать выпадение одной или нескольких аминокислот. Из схемы ясно, что при такой процедуре в исходной рекомбинантной плазмиде изменяется только одна из двух цепей ДНК, так что после репликации лишь половина всех трансфицированных клеток содержит плазмиду с нужным мутантным геном. Здесь указана лишь небольшая часть всей плазмидной последовательности. клетки в культуре и затем после инкубации в течение ночи исследовать их на хлорамфеникол-ацетилтрансферазную активность. Среди трансфицированных клеток многие в течение некоторого времени экспрессируют чужеродный ген, но лишь очень небольшое число клеток удерживает этот ген надолго. Чтобы добиться устойчивой трансформации, надо произвести отбор тех редких клеточных клонов, у которых рекомбинантные молекулы ДНК включились в их хромосомы. Трансфицируя различные типы клеток такими рекомбинантными молекулами ДНК, удается определять те регуляторные последовательности ДНК, которые позволяют данному гену экспрессироваться в одних клетках и не экспрессироваться в других (разд. 10.2.8). 5.6.10. Сконструированные гены можно ввести в половые клетки мыши или плодовой мушки и получить трансгенные организмы [64] Для выявления функции измененного белка, необходимо ввести этот ген в организм и проследить, каков будет эффект. В идеале желательно заменить нормальный ген измененным, с тем чтобы действие мутантного белка можно было наблюдать в условиях, когда нормальный белок отсутствует. Единственный эукариотический организм, с которым такую процедуру можно проделать относительно легко, - это дрожжи. Фрагменты ДНК, введенные в растущие дрожжевые клетки, достаточно эффективно включаются в виде одиночных копий в гомологичные участки хромосом путем общей рекомбинации, так что на место эндогенной копии данного гена становится сконструированный ген. Это 339 открывает широкие возможности для изучения функций различных генов у дрожжей (см. разд. 4.6.15). Иначе обстоит дело с клетками млекопитающих. Здесь мы пока не в состоянии установить, как и куда включилась в хромосому введенная в клетку ДНК. В среднем лишь один акт интеграции на тысячу приводит к замене одного гена другим. Вместо этого клеточные ферменты быстро сшивают линейные фрагменты ДНК конец-в-конец и такой длинный тандем обычно включается в хромосому в каких-то, по-видимому, случайных, участках. Оплодотворенные яйца млекопитающих ведут себя в этом отношении так же, как и прочие клетки млекопитающих. Если ввести в яйцо мыши 200 копий линейной молекулы ДНК, то часто из него развивается мышь, у которой в одну из ее хромосом в случайном участке интегрированы эти тандемно повторяющиеся копии введенного гена (рис. 5-88). В том случае, когда модифицированная хромосома присутствует и в половых клетках (яйцеклетках или сперматозоидах), мышь передаст эти новые полученные ею гены своему потомству; животные с таким устойчивым изменением называются трансгенными. Поскольку нормальный ген у них, как правило, сохраняется, трансгенные животные по большей части непригодны для столь убедительной, как у дрожжей, демонстрации эффектов, связанных с изменением гена; однако с их помощью были уже получены важные сведения о том, как осуществляется регуляция генов млекопитающих (см. стр. 10.3.11) и каким образом некоторые гены (их называют онкогенами) обусловливают возникновение рака (см. разд. 21.2.5). Сходные эксперименты можно проводить с плодовой мушкой Drosophila, используя для этого методику, дающую возможность включать в геном мухи в каком-либо случайном его участке одну копию любого интересующего нас гена. Главная задача состоит здесь в том, чтобы встроить фрагмент ДНК, о котором идет речь, между двумя концевыми последовательностями определенного мобильного элемента Drosophila, так называемого Р-элемента. Эти концевые последовательности позволяют Р-элементу включаться в хромосомы Drosophila, если в клетке присутствует также особый фермент, катализирующий это включение (Р-элемент-транспозаза; см. разд. 5.5.10). Поэтому, для того чтобы получить трансгенных плодовых мушек, требуется инъецировать соответствующим образом модифицированный фрагмент ДНК в эмбрион мухи на одной из очень ранних стадий развития и одновременно ввести туда же отдельную плазмиду, содержащую ген транспозазы. В этом случае инъецированный ген в виде одиночной копии часто попадает (вследствие транспозиции) в клетки зародышевого пути (рис. 5-88). Недавно у мышей удалось осуществить замену гена косвенным, достаточно трудоемким путем. Процедура сводится к следующему. Сначала фрагмент ДНК, содержащий нужный мутантный ген, вводят путем трансфекции в специальную линию плюрипотентных стволовых клеток, выделенных из эмбриона и выращиваемых в культуре. Клеткам дают возможность размножаться в течение некоторого времени, после чего методом блот-анализа по Саузерну выявляют редкие колонии, в которых общая рекомбинация привела к замене гена, и отдельные клетки из этих колоний имплантируют в ранний эмбрион мыши. В этой новой для них среде выделенные из эмбриона стволовые клетки часто пролиферируют, образуя крупные участки в теле нормальной мыши. Мышей, у которых произошла замена гена в клетках зародышевого пути, скрещивают, чтобы получить самца и самку, которые окажутся гетерозиготными по этому признаку (т. е. будут иметь одну нормальную и одну мутантную копию данного гена). Если теперь скрестить этих животных, то одна четвертая часть их потомства будет гомозиготной по 340 Рис. 5-88. Сравнение стандартных процедур, используемых для получения трансгенной мыши и трансгенной плодовой мушки. В этих примерах ген, введенный в яйцо мыши, вызывает изменение окраски шерсти, а ген, введенный в эмбрион плодовой мушки, - изменение цвета глаз. В обоих случаях у части трансгенных организмов вставки ДНК обнаружены не в одном, а в нескольких участках хромосомы. измененному гену. Изучение таких гомозигот позволит наблюдать функцию измененного гена в отсутствие его нормального аллеля. Возможность получения трансгенных мышей и дрозофил дает в руки исследователей новый мощный инструмент для изучения функции генов в интактном организме. 341 5.6.11. Отобранные сегменты ДНК можно клонировать in vitro посредством полимеразной цепной реакции [65] Доступность очищенных ДНК-полимераз и химически синтезированных ДНК-олигонуклеотидов сделала возможным быстрое клонирование специфических последовательностей ДНК вне живой клетки. Методика, известная под названием полимеразной цепной реакции (ПЦР), позволяет амплифицировать ДНК из какого-нибудь выбранного участка генома более чем в миллион раз, при условии, что нам известна хотя бы часть его нуклеотидной последовательности. Участки этой последовательности, окружающие выбранную для амплификации область, используют для того, чтобы приготовить по ним два синтетических ДНК-олигонуклеотида, каждый из которых комплементарен одной из двух цепей молекулы ДНК. Эти олигонуклеотиды служат затравками при синтезе ДНК in vitro катализируемом ДНК-полимеразой; они определяют концы получаемого фрагмента ДНК (рис. 5-89, А). Принцип методики ПЦР ясен из рис. 5-89, Б. В каждом цикле реакции необходимо сначала кратковременное нагревание ДНК для разделения двух цепей двойной спирали (1-й этап). Последующее охлаждение ДНК в присутствии большого избытка двух упомянутых ДНК- олигонуклеотидов приводит к специфической гибридизации этих олигонуклеотидов с комплементарными последовательностями ДНК (2-й этап). После отжига смесь инкубируют с ДНК-полимеразой и четырьмя дезоксинуклеозидтрифосфатами, в результате чего избирательно синтезируются те участки ДНК, которые располагаются «книзу» от затравки (3-й этап). Для эффективной амплификации ДНК требуется от 20 до 30 циклов реакции. В каждом последующем цикле количество ДНК по сравнению с предыдущим циклом удваивается. Отдельный цикл занимает около 5 мин, поэтому при автоматизации всей процедуры для «бесклеточного молекулярного клонирования» какого-либо фрагмента ДНК требуется несколько часов, тогда как обычные процедуры клонирования растягиваются на несколько дней. Метод ПЦР отличается чрезвычайно высокой чувствительностью: он позволяет обнаружить в пробе всего одну присутствующую в ней молекулу ДНК. Тот же способ пригоден и для анализа следовых Рис. 5-89. Полимеразная цепная реакция (ПЦР), используемая для амплификации специфических нуклеотидных последовательностей in vitro А. Выделенную из клеток ДНК нагревают, чтобы разделить ее комплементарные цепи. Затем проводят отжиг этих цепей, добавив к ним избыток двух ДНК-олигонуклеотидов (по 15-20 нуклеотидов каждый), синтезированных химически с таким расчетом, чтобы они были комплементарны последовательностям, отделенным друг от друга расстоянием в X нуклеотидов (значение X варьирует от 50 до 2000). Эти два олигонуклеотида служат специфическими затравками для синтеза ДНК in vitro, катализируемого ДНК-полимеразой, которая копирует ДНК между соответствующими последовательностями. Б . Многократное повторение циклов реакции дает в итоге большое количество копий одного фрагмента ДНК (длиной X нуклеотидов). |