Молекулярная биология клетки. Том 1. Молекулярная биология клетки 2Molecular Bruce Alberts, Dennis Bray,Biology
 Скачать 25.6 Mb.
|
6.4.5. (Na + + К + )-насос плазматической мембраны - это АТРаза [22] Концентрация К + внутри клетки, как правило, в 10-20 раз выше, чем снаружи. Для ионов Na + - картина прямо противоположная (см. табл. 6-3). Такая разница в концентрациях ионов обеспечивается работой (Na + + К + )-насоса, обнаруженного в плазматических мембранах практически всех животных клеток. Этот насос работает по принципу антипорта, активно перекачивая Na + из клеток, а К + внутрь клеток против их крутых электрохимических градиентов. Ниже будет показано, что градиент Na + , создаваемый насосом, регулирует объем клеток за счет осмотических эффектов. Он также используется для осуществления транспорта Сахаров и аминокислот в клетку. Почти треть всей энергии, необходимой для жизнедеятельности животной клетки, тратится именно на работу этого насоса. В электрически активных нервных клетках при распространении потенциала действия происходит многократное накапливание небольших порций Na + и потери небольших количеств К + (см. ниже). При этом на восстановление уходит около 2/3 энергии, необходимой клетке. Значительный шаг вперед в понимании молекулярного механизма работы натриево-калиевого насоса был сделан в 1957 г., когда обнаружилось, что для оптимальной активности фермента, гидролизующего АТР до ADP и фосфата, требуется Na + и К + . Кроме того, было показано, что известный ингибитор (Na + + К + )-насоса уабаин ингибирует также и АТРазу. Таким образом, была установлена связь между (Na + + К + )-АТРазой и натриево-калиевым насосом. Однако главное доказательство того, что именно гидролиз АТР обеспечивает насос 385 Рис. 6-48. (Na + + К + )-АТРаза активно качает Na + наружу, а К + внутрь клетки против их электрохимических градиентов. При гидролизе внутри клетки каждой молекулы АТР три иона Na + выкачиваются из клетки и два иона К + накачиваются в клетку. Специфический ингибитор насоса уабаин и ионы К + конкурируют за общий участок на внеклеточной стороне АТРазы. необходимой для работы энергией, было получено при изучении замкнутых теней эритроцитов. В этих опытах можно было варьировать концентрации ионов с каждой стороны мембраны и наблюдать, как эти изменения влияют на транспорт ионов и гидролиз АТР. Было обнаружено, что 1) транспорт ионов натрия и калия и гидролиз АТР тесно связаны между собой, так что ни один из этих процессов не может осуществляться без другого; 2) транспорт ионов и гидролиз АТР происходят лишь в том случае, когда N + и АТР присутствуют внутри теней, а К + - снаружи; 3) уабаин ингибирует АТРазу только находясь с внешней стороны теней, где он конкурирует за К + -связывающий участок; 4) при гидролизе каждой молекулы АТР (одна молекула АТРазы может гидролизовать 100 молекул АТР за 1 с) три иона натрия выкачиваются наружу и два иона калия накачиваются внутрь (рис. 6-48). Эти эксперименты неопровержимо доказали, что АТР поставляет энергию для перекачивания ионов натрия и калия через плазматическую мембрану; тем не менее оставалось непонятным, как именно гидролиз АТР связан с транспортом ионов. Дальнейшие исследования показали, что концевая фосфатная группа АТР в присутствии Na + переносится на остаток аспарагиновой кислоты в молекуле АТРазы. Связанная с АТРазой фосфатная группа затем гидролизуется в присутствии К + , и именно этот последний этап ингибируется уабаином. Na + -зависимое фосфорилирование сопряжено с изменением конформации АТРазы, что приводит к выведению натрия из клетки. Наоборот, К + -зависимое дефосфорилирование, осуществляемое вслед за этим, обусловливает транспорт ионов калия внутрь клетки и возвращение АТРазы в первоначальное состояние (рис. 6-49). (Na + + К + )-насос в тенях эритроцитов можно заставить работать в противоположном направлении - для синтеза АТР. Если градиенты концентраций ионов натрия и калия в эксперименте увеличить до такой степени, что энергия их электрохимических градиентов будет выше химической энергии гидролиза АТР, то ионы будут проходить через мембрану по их электрохимическим градиентам, а АТР будет синтезироваться из ортофосфата и ADP с помощью натриево-калиевой АТРазы. Таким образом, фосфорилированная форма АТРазы (позиция 2 на рис. 6-49) может релаксироваться либо перенося фосфат на ADP (от позиции 2 к позиции 1), либо изменяя свою конформацию (от позиции 2 к позиции 3). Будет ли общее изменение свободной энергии использоваться для синтеза АТР или же для выкачивания Na + из теней эритроцитов, зависит от относительных концентраций АТР, ADP и фосфата и от электрохимических градиентов ионов натрия и калия. 386 Рис. 6-49. Модель функционирования (Na + + К + )-АТРазы. Связывание Na + (1) и последующее фосфорилирование (2) АТРазы со стороны цитоплазмы индуцируют в белке конформационные изменения, в результате которых Na + переносится через мембрану и высвобождается в межклеточное пространство (3). Затем связывание К + на внешней поверхности (4) и последующее дефосфорилирование (5) возвращают белок в первоначальную конформацию; при этом К + проходит через мембрану и высвобождается в цитоплазму (6). Эти конформационные изменения аналогичны переходам типа «пинг-понг», изображенным на рис. 6-47, за исключением того, что здесь конформационные переходы индуцируются Na + -зависимым фосфорилированием и К + -зависимым дефосфорилированием белка, вследствие чего он совершает полезную работу. Для простоты показано только по одному участку связывания Na + и К + . В реальном насосе, видимо, существует три участка связывания Na + и два - К + После того как (Na + + К + )-АТРаза была получена в чистом виде, выяснилось, что она состоит из двух субъединиц - большой (длиной около 1000 аминокислотных остатков) трансмембранной, пересекающей бислой несколько раз и обладающей каталитической активностью, и ассоциированного с ней более мелкого гликопротеина. Первая субъединица имеет участки связывания для Na + и АТР на цитоплазматической стороне, а для К + и уабаина на наружной. Кроме того, она обратимо фосфорилируется и дефосфорилируется. Функция гликопротеина неизвестна. Работающий натриево-калиевый насос можно реконструировать из очищенного комплекса: АТРазу солюбилизируют в детергенте, очищают и смешивают с соответствующими фосфолипидами. После удаления детергента образуются мембранные пузырьки, которые в присутствии АТР качают Na + и К + в противоположных направлениях (см. рис. 6-21). 6.4.6. (Na + + К + )-АТРаза необходима для поддержания осмотического равновесия и стабилизации объема клеток [23] Поскольку (Na + + К + )-АТРаза выкачивает три положительно заряженных иона на каждые два, накачанные внутрь клетки, она оказывается «электрогенной». Это значит, что через мембрану течет ток, создающий электрический потенциал с отрицательным значением во внутренней части клетки по отношению к ее наружной поверхности. Однако этот эффект насоса дает не более 10% вклада в мембранный потенциал. Остальные 90% потенциала создаются, как мы увидим, работой насоса косвенным образом и связаны с различной концентрацией К + по разные стороны мембраны. Повышенные концентрации калия внутри клетки 387 Рис. 6-50. Реакция эритроцитов человека на изменение осмотических условий во внеклеточной жидкости. Вода всасывается в клетку или выходит из нее по градиенту концентрации, поскольку плазматическая мембрана хорошо проницаема для молекул воды. Этот процесс называется осмосом. При помещении клеток в гипотонический раствор (т.е. в раствор с низкой концентрацией соли и, следовательно, с высокой концентрацией воды) молекулы воды движутся внутрь клеток, что приводит к их разбуханию и разрыву (лизису). Наоборот, при помещении клеток в гипертонический раствор они будут сморщиваться (см. также схему 2-1). необходимы для сбалансирования большого суммарного отрицательного заряда, обусловленного клеточными фиксированными анионами - множеством отрицательно заряженных органических молекул, находящихся внутри клетки и не способных проникать через плазматическую мембрану. (Na + + К + )-АТРаза играет непосредственную роль в регуляции клеточного объема. Она контролирует концентрацию растворов внутри клетки, а следовательно, и осмотические силы, приводящие к разбуханию или сжатию клетки (рис. 6-50). Как объясняется на схеме 6-1, растворы внутри клетки (включая фиксированные анионы и сопутствующие катионы, необходимые для уравновешивания их заряда) поддерживают большой осмотический градиент, насасывающий воду внутрь клетки. В животных клетках этот эффект нейтрализуется высокими концентрациями неорганических ионов (главным образом Na + и С1 - ), находящихся во внеклеточной жидкости. Натриево-калиевая АТРаза поддерживает осмотическое равновесие, выкачивая втекающие по ступенчатому градиенту ионы Na + из клетки; Сl - удерживаются вне клетки благодаря мембранному потенциалу. Важная роль (Na + + К + )-АТРазы в регуляции клеточного объема подтверждается тем фактом, что при обработке животных клеток уабаином, ингибирующим натриево-калиевую АТРазу, они разбухают и разрываются. Осмотические проблемы могут решаться в клетках и другими способами. У многих бактерий и растительных клеток плазматическая мембрана окружена полужесткой стенкой, предохраняющей клетку от разрыва. У амеб излишек воды, проникающий внутрь в результате осмоса, собирается в сократительных вакуолях, периодически выбрасывающих свое содержимое наружу (схема 6-1). Однако в большинстве животных клеток основная роль в предотвращении разрыва из-за осмотического давления принадлежит (Na + +K + )-АТРазе. 6.4.7. Некоторые Са 2+ -насосы - это тоже мембраносвязанные АТРазы [24] Концентрация ионов Са 2+ в цитозоле эукариотических клеток поддерживается на гораздо более низком уровне ( 10 -7 М) по сравнению с его концентрацией снаружи клетки ( 10 -3 М). Даже небольшой приток Са 2+ извне значительно увеличивает концентрацию свободного Са 2+ в цитозоле, а поток ионов кальция, устремляющийся по ступенчатому градиенту в ответ на внешние сигналы - один из способов передачи таких сигналов через плазматическую мембрану (см. разд. 12.3.7). Градиент Са 2+ частично поддерживается с помощью существующих в плазматической мембране Са 2+ -насосов, активно выводящих кальций из клетки. Известно, что один из таких насосов является АТРазой, а другой работает как антипорт, обусловленный электрохимическим градиентом Na + (см. ниже). 388 ИСТОЧНИКИ ВНУТРИКЛЕТОЧНОЙ ОСМОТИЧНОСТИ Макромолекулы слабо влияют на осмотическое давление внутри клетки, поскольку каждая из них, хотя и имеет большие размеры, есть всего лишь одна молекула, и число таких молекул просто мало по сравнению с числом малых молекул. Однако большинство биологических молекул сильно заряжены, и потому они удерживают около себя множество неорганических ионов противоположного заряда. Это большое число противоионов и вносит основной вклад во внутриклеточную осмотичность. В результате активного транспорта и метаболических процессов клетки содержат высокие концентрации малых органических молекул, таких, как сахара, аминокислоты и нуклеотиды, для которых плазматическая мембрана является практически непроницаемой. Поскольку большинство этих метаболитов заряжены, они также окружены противоионами. Таким образом, как сами малые метаболиты, так и их противоионы существенно влияют на осмотическое давление внутри клеток. Осмотичность внеклеточной жидкости определяется главным образом малыми неорганическими ионами Они медленно перемещаются внутрь клетки через плазматическую мембрану. Если бы они не выкачивались обратно и если бы внутри клетки не было бы других молекул, взаимодействующих с ними, то со временем система пришла бы в равновесие с одинаковыми концентрациями ионов внутри и снаружи клетки. Однако существование заряженных макромолекул и метаболитов в клетке, окруженных облаком противоионов, приводит к усилению эффекта Доннана. Этот эффект приводит к тому, что даже при равновесии общая концентрация неорганических ионов (и соответственно их вклад в осмотичность) внутри клетки должна быть выше, чем снаружи. ПРОБЛЕМА Если бы не существовала система осморегуляции, общая концентрация растворенных веществ внутри клетки оказалась бы больше, чем снаружи. Это означает, что концентрация воды снаружи была бы больше, чем внутри. Такая разница в концентрации воды по обеим сторонам плазматической мембраны приводила бы к постоянному притоку воды внутри клетки в результате осмоса, вызывая разрыв клетки. РЕШЕНИЕ ПРОБЛЕМЫ Животные клетки и бактерии контролируют осмотическое давление внутри клетки с помощью активного выкачивания неорганических ионов, таких, как Na + , так что их общая концентрация внутри клетки ниже, чем во внеклеточной жидкости. Клетки растений ограничивают набухание благодаря их жестким стенкам и, таким образом, могут выдерживать осмотическое давление на их плазматическую мембрану: в зависимости от количества поступающей внутрь воды увеличивается и внутриклеточное давление со стороны стенки, уравновешивающее разрывающие клетку силы. Многие простейшие избегают набухания, несмотря на осмотическое давление, благодаря способности периодически выбрасывать поступающую воду в специальных сократительных вакуолях. Схема 6-1. Внутриклеточный водный баланс: проблема и ее решение. 389 Наиболее изученным из Са 2+ -насосов является мембраносвязанная АТРаза из саркоплазматического ретикулума мышечных клеток. Саркоплазматический ретикулум образует сеть тонких каналов в цитоплазме мышечных клеток и служит внутриклеточным хранилищем ионов кальция. Когда потенциал действия деполяризует мембрану мышечной клетки, Са 2+ высвобождается из саркоплазматического ретикулума в цитозоль, стимулируя мышцу к сокращению (см. разд. 11.1.4). Кальциевый насос отвечает за перекачивание Са 2+ из цитозоля в саркоплазматический ретикулум. Подобно натриево-калиевому насосу, Са 2+ -насос - это АТРаза, которая фосфорилируется и дефосфорилируется в каждом цикле работы и накачивает два иона кальция внутрь саркоплазматического ретикулума в расчете на каждую гидролизованную молекулу АТР. Поскольку Са 2+ -АТРаза - это преобладающий белок в мембране саркоплазматического ретикулума (она составляет около 90% всего белка данной структуры), ее довольно легко очистить. Оказалось, что молекула этого белка состоит из одной длинной полипептидной цепи (около 1000 аминокислотных остатков), пронизывающей мембрану несколько раз; после включения в фосфолипидные пузырьки кальциевая АТРаза осуществляет сопряженный с гидролизом АТР перенос ионов Са 2+ . Эксперименты по клонированию и секвенированию ДНК свидетельствуют о гомологии Са 2+ -АТРазы большой каталитической субъединице (Na + + К + )-АТРазы, что говорит об эволюционном родстве этих двух ионных насосов. В немышечных клетках органеллы эквивалентные саркоплазматическому ретикулуму также содержат Са 2+ -АТРазу, выкачивающую Са 2+ из цитозоля. В ответ на специфические внеклеточные сигналы этот, изолированный от клетки, Са 2+ возвращается опять в цитозоль. 6.4.8. Мембранносвязанные ферменты, синтезирующие АТР, это транспортные АТРазы, действующие в обратном направлении [25] В плазматических мембранах бактерий, во внутренних мембранах митохондрий и тилакоидных мембранах хлоропластов обнаруживаются ферменты, очень похожие на две обсуждавшиеся выше транспортные АТРазы. Однако здесь они обычно действуют в обратном направлении. Вместо гидролиза АТР, обеспечивающего транспорт ионов, они катализируют синтез АТР из ADP и фосфата, осуществляемый благодаря наличию на этих мембранах градиента протонов. Градиент Н + возникает на отдельных этапах транспорта электронов в процессе окислительного фосфорилирования (у аэробных бактерий и в митохондриях) или фотосинтеза (в хлоропластах), а также с помощью фотоактивируемого протонного насоса (бактериородопсина у Halobacterium). Эти ферменты, в норме синтезирующие АТР, названы АТР- синтетазами. Как и транспортные АТРазы, они способны работать в обоих направлениях в зависимости от условий: либо гидролизовать АТР и качать Н + через мембрану во внутреннее пространство, либо синтезировать АТР при прохождении потока ионов Н + через молекулы ферментов в обратном направлении. АТР-синтетазы ответственны за продукцию практически всего АТР в большинстве клеток и более детально обсуждаются в гл. 9. 6.4.9. Активный транспорт может осуществляться с помощью ионных градиентов [26] Многие системы активного транспорта приводятся в действие за счет энергии, запасенной в ионных градиентах, а не путем прямого гидролиза АТР. Все ионы работают как парные транспортеры: одни функциони- 390 Рис. 6-51. Принципы использования градиента Na + для работы насоса, перекачивающего глюкозу. Насос осциллирует случайным образом между двумя состояниями: «пинг» и «понг», как на рис. 6-47. Na + связывается одинаково хорошо с белком в любой конформации. Связывание Na + индуцирует аллостерический переход белка в состояние с сильно увеличенным сродством к глюкозе. Поскольку концентрация Na + вне клетки выше, чем в цитозоле, связывание глюкозы с насосом более вероятно в конформации «понг». Поэтому перенос Na + и глюкозы в клетку (переход «понг» → «пинг») происходит намного чаще, чем наоборот, т.е. осуществляется направленный перенос. Поддерживая градиент Na + на определенном уровне (Na + + К + )-АТРаза косвенным образом обеспечивает такую транспортную систему энергией. Говорят, что переносчики, работающие по такому принципу, осуществляют вторичный активный транспорт, тогда как АТРаза осуществляет первичный активный транспорт. руют по принципу симпорта, а другие - антипорта. В животных клетках котранспортируемым ионом обычно оказывается Na + . Его электрохимический градиент обеспечивает энергией активный транспорт второго вида молекул. Проникающий при этом внутрь клетки Na + выкачивается (Na + + К + )-АТРазой, которая, обеспечивая градиент Na + , косвенным образом осуществляет транспорт. Например, клетки кишечника и эпителиальные клетки почек содержат разнообразные симпортные системы, работающие благодаря трансмембранному градиенту Na + . Каждая система специфична для переноса внутрь клетки небольшой группы родственных Сахаров или аминокислот. В этих системах растворенные молекулы и ионы натрия связываются с различными участками на белке-переносчике; Na + стремится войти в клетку по своему электрохимическому градиенту и как бы «тащит» молекулы сахара или аминокис- |