Молекулярная биология клетки. Том 1. Молекулярная биология клетки 2Molecular Bruce Alberts, Dennis Bray,Biology
 Скачать 25.6 Mb.
|
Запись сигналов методом patch-clamp. Благодаря плотному соединению между микропипеткой и мембраной ток может течь только через каналы, имеющиеся в участке мембраны, закрывающей кончик пипетки. Запись протекающего тока можно сделать как в случае А (в интактной клетке), так и в случае Б (удалив участок мембраны). Преимущества варианта Б состоят в легкости изменения условий с любой стороны мембраны для изучения воздействия различных растворов на поведение канала. Ориентацию удаленного участка мембраны можно изменить на противоположную (см. также рис. 4-33 и 4-34). 402 Рис. 6-61. Запись тока, протекающего через единичный потенциал-зависимый Na + -канал, находящийся в крошечном участке плазматической мембраны мышечной клетки эмбриона крысы (см. рис. 6-60). Мембрану деполяризуют импульсом (А). Три графика тока (Б) получены в трех экспериментах с одним и тем же участком мембраны. Каждое существенное изменение тока соответствует открытию и закрытию одного канала. Сравнение показывает, что время открытию и закрытию может существенно варьировать, при этом скорость протекания зарядов через канал остается практически постоянной. Маленькие флуктуации при записи тока являются электрическим шумом записывающей аппаратуры. Суммарный ток, записанный в 144 повторяющихся экспериментах, показан на В. Он эквивалентен току Na + через относительно большой участок мембраны, содержащий 144 канала. Сравнение Б и В показывает, что суммарный ток отражает вероятность открывания индивидуального канала. Эта вероятность со временем уменьшается, так как каналы деполяризованной мембраны переходят в инактивированную конформацию. Кинетика открывания и инактивации каналов мышечной клетки эмбриона намного медленнее, чем у типичной нервной клетки. (По данным J. Patlak и R. Horn, J. Gen. Physiol., 79, 333-351, 1982, с разрешения Rockefeller University Press.) предполагаемых трансмембранных сегментов содержит положительно заряженные аминокислотные остатки, разделенные между собой регулярными промежутками. Не исключено, что эти остатки вместе обладают функцией сенсора потенциала, обеспечивая открывание канала в ответ на достаточную деполяризацию мембраны (см. рис. 6-58). Намного больше известно о структуре другого класса ионных каналов, открывающихся в ответ на связывание специфических нейротрансмиттеров, а не на изменения мембранного потенциала. Эти трансмиттер-зависимые ионные каналы также принадлежат к одной группе родственных белков. Однако в отличие от потенциал-зависимых Na + - и Са 2+ -каналов, каждый из которых образован одной длинной полипептидной цепью, все изученные трансмиттер-зависимые ионные каналы построены из нескольких гомологичных субъединиц. 6.4.18. Ацетилхолиновый рецептор - это трансмиттер-зависимый катионный канал [35] Трансмиттер-зависимые ионные каналы приспособлены для превращения внеклеточных химических сигналов в электрические сигналы. Они располагаются обычно в специализированных соединениях (называемых химическими синапсами), расположенных между нервными клетками и клетками-мишенями. Эти каналы концентрируются на плазматической мембране клетки-мишени в области синапса. Каналы способны открываться на некоторое время в ответ на связывание нейротрансмиттера, высвобождаемого нервным окончанием. При этом меняется проницаемость постсинаптической мембраны клетки-мишени (рис. 6-62). В отличие от потенциал-зависимых каналов, ответственных за возникновение потенциалов действия, трансмиттер-зависимые каналы относительно нечувствительны к мембранному потенциалу и поэтому неспособны к самоусиливающемуся возбуждению. Вместо этого они изменяют проницаемость мембраны и, следовательно, влияют на мембранный потенциал. Величина этого изменения зависит от того, сколько трансмиттера высвободилось в синапсе и в течение какого времени он там присутствует. Ясно, что потенциал действия может возникнуть только при условии, что потенциал-зависимые каналы также присутствуют в этой же мембране клетки-мишени. Кроме характерной ионной селективности каждый трансмиттер-зависимый канал обладает высокоспецифичным участком связывания своего 403 Рис. 6-62. Химический синапс. Приходящий к нервному окончанию потенциал действия стимулирует высвобождение нейротрансмиттера, содержащегося в секреторных пузырьках и высвобождаемого из клетки при слиянии пузырьков с плазматической мембраной нервного окончания. Высвобожденный нейротрансмиттер связывается с трансмиттер-зависимыми ионными каналами, сконцентрированными на плазматической мембране постсинаптической клетки, и открывает их. В результате тока ионов изменяется мембранный потенциал клетки-мишени. Таким образом происходит передача нервного сигнала. Рис. 6-63. Три конформации ацетилхолинового рецептора. Связывание двух молекул ацетилхолина открывает ворота трансмиттер-зависимого ионного канала. Но, по-видимому, даже при связанном ацетилхолине рецептор остается открытым непродолжительное время, а затем закрывается. Ацетилхолин отсоединяется от рецептора, возвращая его в первоначальное состояние. нейротрансмиттера. Примером наиболее изученного трансмиттер-зависимого канала может служить ацетилхолиновый рецептор клеток скелетных мышц. Этот канал временно открывается при действии ацетилхолина, нейротрансмиттера высвобождаемого из нервного окончания в нервно-мышечное соединение (см. разд. 19.3.1). Ацетилхолиновый рецептор занимает особое место в истории изучения ионных каналов. Он был первым ионным каналом, выделенным в чистом виде, именно у него впервые была определена полная аминокислотная последовательность, ацетилхолиновый рецептор оказался первым каналом, для которого удалось добиться функциональной активности после реконструкции в синтетическом липидном бислое, и, наконец, первым каналом, у которого был записан электрический сигнал, получаемый при открывании одного канала. Ген этого канала также оказался первым из генов белков-каналов, которые были выделены, клонированы и секвенированы. Успех в изучении этого рецептора стал возможен по двум по крайней мере причинам. Во-первых, существует необычайно богатый источник для его выделения из электрических органов электрических рыб и скатов. Эти органы представляют собой модифицированные мышцы, приспособленные для того, чтобы вызвать у жертвы электрический шок. Во-вторых, некоторые нейротоксины типа α-бунгаротоксина из яда определенных змей с высокой эффективностью (К а = 10 9 л/моль) и специфичностью связываются с этим рецептором и могут быть использованы для его очистки методом аффинной хроматографии. Благодаря применению флуоресцентно или радиоактивно меченного α-бунгаротоксина показано, что ацетилхолиновые рецепторы плотно упакованы в плазматической мембране мышечных клеток в месте нейромышечного соединения (около 20000 рецепторов на мкм 2 ), а в других местах той же мембраны находится лишь несколько таких рецепторов. Ацетилхолиновый рецептор представляет собой гликопротеин, состоящий из пяти трансмембранных полипептидов. Два из них принадлежат к одному типу, а три остальных - к другому. Они кодируются четырьмя различными генами. Поскольку четыре этих гена обнаруживают тесную гомологию, предполагают, что все они произошли от одного гена-предшественника. Два идентичных полипептида в пентамере имеют участки связывания ацетилхолина. При связывании двух молекул трансмиттера с пентамерным комплексом происходит индуцированное конформационное изменение, приводящее к открыванию канала. Канал открывается примерно на 1 миллисекунду, а затем опять закрывается. По-видимому, как и для потенциал-зависимого Na + -канала, открытая форма является короткоживущей и быстро переходит в закрытое состояние с меньшей свободной энергией (рис. 6-63). После 404 Рис. 6-64. Одна из моделей образования трансмембранной поры, заполненной водой, из пяти гомологичных субъединиц (α, α, β, γ, δ) ацетилхолинового рецептора (А). Обратите внимание, что обе α-субъединицы содержат участок связывания ацетилхолина и что основная масса рецептора находится во внеклеточном пространстве. Каждая субъединица состоит из 500 аминокислотных остатков. М г рецептора 300 000 Да. Предполагается, что полипептидная цепь каждой субъединицы пересекает липидный бислой в виде четырех α-спиралей (Б). Одна из спиралей (показана в цвете) содержит более полярные аминокислотные остатки, чем другие. Она, видимо, и входит в состав стенки водяной поры при объединении пяти субъединиц (А). этого молекулы ацетилхолина диссоциируют из комплекса с рецептором и гидролизуются специфическим ферментом (ацетилхолинэстеразой). Освободившись от связанного нейротрансмиттера, ацетилхолиновый рецептор возвращается к исходному состоянию покоя. Для изучения структуры ацетилхолинового рецептора были использованы методы электронной микроскопии и малоугловой дифракции рентгеновских лучей, однако точный ответ на вопрос, как образуется трансмембранный гидрофильный канал, до сих пор не получен. Было предложено несколько моделей, основанных главным образом на аминокислотной последовательности субъединиц. Одна из моделей представлена на рис. 6-64. То, что кластеры отрицательно заряженных аминокислотных остатков выстилают отверстие канала, объясняет, по-видимому, известный факт, что отрицательно заряженные ионы не способны проходить через канал, а положительно заряженные ионы с размером до 0,65 нм могут это делать. Через канал проходят преимущественно ионы Na + и К + , а также некоторое количество Са 2+ . Строгих ограничений на вид катионов не существует, поэтому поток каждого из них через канал определяется главным образом их концентрациями и электрохимическими движущими силами. Так как градиент напряжения уравновешивает градиент концентрации К + через мембрану при наличии потенциала покоя, то и движущая сила для ионов К + близка к нулю (см. схему 6-2). Напротив, для ионов Na + как градиент напряжения, так и градиент концентрации действуют в одном направлении, способствуя движению ионов внутрь клетки. Это же справедливо и для Са 2+ , но его внеклеточная концентрация намного меньше концентрации ионов натрия, и, следовательно, вклад Са 2+ в общий ток ионов незначителен. Поэтому открывание ацетилхолиновых рецепторных каналов приводит к большому притоку ионов Na 2+ (максимальная скорость притока составляет около 30 000 ионов на 1 канал за 1 миллисекунду). Этот ток вызывает деполяризацию мембраны, что служит сигналом для мышечного сокращения, как описано ниже. Ранее были определены также последовательности нуклеотидов 405 ДНК, кодирующие субъединицы нескольких разны трансмиттер-зависимых ионных каналов. Выведенные из них аминокислотные последовательности гомологичны друг другу и соответствующим субъединицам ацетилхолинового рецептора, что говорит об эволюционном родстве этих ионных каналов. 6.4.19. Нервно-мышечная передача включает в себя последовательную активацию по крайней мере четырех различных наборов воротных каналов [36] Исключительную роль ионных каналов, имеющих «ворота» (или воротных каналов) для работы электрически возбудимых клеток, можно проиллюстрировать на примере стимуляции мышечной клетки к сокращению приходящим нервным импульсом. Этот с виду простой ответ состоит из последовательного открывания и закрывания по крайней мере четырех различных наборов каналов, имеющих ворота, и все это происходит менее чем за 1 секунду (рис. 6-65). 1. Процесс начинается, когда нервный импульс достигает нервного окончания и деполяризует его плазматическую мембрану. Деполяризация открывает на время потенциал-зависимые воротные Са 2+ -каналы в этой мембране. Поскольку концентрация Са 2+ снаружи клетки более чем в 1000 раз превышает концентрацию свободного Са 2+ в клетке, ионы кальция устремляются внутрь нервного окончания. Увеличение концентрации Са 2+ в цитозоле нервного окончания стимулирует локальное высвобождение ацетилхолина в синаптическую щель. 2. Высвобожденный ацетилхолин связывается с ацетилхолиновыми рецепторами на плазматической мембране постсинаптической мышечной клетки. Это вызывает временное открывание катионных каналов рецепторов. В результате приток Na + приводит к локальной деполяризации мембраны мышечной клетки. 3. Деполяризация плазматической мембраны мышечной клетки открывает ворота потенциал-зависимых Na + -каналов этой мембраны, способствуя засасыванию еще большего количества ионов Na + . Таким образом происходит усиление деполяризации мембраны. Это в свою очередь приводит к тому, что открываются следующие потенциал-зависимые Na + -каналы и в конце концов возникает волна деполяризации (потенциал действия), которая распространяется до тех пор, пока не охватит всю мышечную мембрану. 4. Общая деполяризация плазматической мембраны мышечной клет- Рис. 6-65. Схема нервно-мышечного соединения, показывающая, как некоторые имеющие ворота каналы участвуют в стимуляции мышечного сокращения нервным импульсом. Каналы пронумерованы в той последовательности, в которой они открываются (см. текст). Механизм открывания Са 2+ -каналов в саркоплазматическом ретикулуме неизвестен. 406 ки приводит к временному открытию Са 2+ -каналов в мембранах саркоплазматического ретикулума и высвобождению Са 2+ в цитозоль. В результате происходит повышение внутриклеточной концентрации Са 2+ , вызывающее сокращение миофибрилл в мышечной клетке (см. разд. 11.1.11). Пока неизвестно, каким образом изменения напряжения на мышечной плазматической мембране служат сигналом для открывания потенциал-зависимых Са 2+ -каналов в мембране саркоплазматического ретикулума. Другая возможность связана с тем, что деполяризация мышечной плазматической мембраны активирует медиаторные пути передачи сигнала с помощью инозитолфосфолипида, что обсуждается в гл. 12. 6.4.20. Ионофоры повышают ионную проницаемость мембран [37] Ионофоры - это небольшие гидрофобные молекулы, которые растворяются в липидных бислоях и повышают их проницаемость для ионов. Большинство ионофоров синтезируется микроорганизмами (вероятно, в качестве оружия против своих конкурентов), некоторые из них используются как антибиотики. Ионофоры широко применяются в клеточной биологии для повышения проницаемости мембран по отношению к определенным ионам в исследованиях на синтетических бислоях, клетках и клеточных органеллах. Существуют два класса ионофоров - подвижные переносчики ионов и каналообразующие ионофоры (рис. 6-66). Ионофоры обоих типов действуют, экранируя заряд транспортируемого иона так, чтобы последний мог пройти гидрофобную внутреннюю область липидного бислоя. Поскольку ионофоры не связаны ни с какими источниками энергии, они лишь позволяют ионам двигаться по их электрохимическим градиентам. Примером подвижного переносчика ионов может служить валиномицин. Он представляет собой полимер, повышающий проницаемость мембраны для ионов К + . Валиномицин имеет кольцеобразную структуру. Наружная гидрофобная часть его молекулы состоит из боковых цепей валина и контактирует с углеводородной сердцевиной липидного бислоя. Во внутренней полярной области как раз может поместиться один ион калия (рис. 6-67). Валиномицин переносит К + по его электрохимическому градиенту, он захватывает этот ион с одной стороны мембраны, диффундирует с ним через бислой и высвобождает его на другой стороне. Еще один пример подвижного переносчика ионов-ионофор А23187, который транспортирует двухвалентные катионы, такие, как Са 2+ и Mg 2+ . Этот ионофор обычно действует как ионообменный «челнок»: на каждый двухвалентный катион, вносимый им в клетку, он удаляет два иона Н + из клетки. Если клетки подвергнуть действию ионофора А23187, ионы Са 2+ устремляются в цитозоль по крутому электрохимическому градиенту. Поэтому ионофор А23187 широко используют в клеточной биологии для повышения концентрации свободного Са 2+ в цитозоле, моделируя, таким образом, определенные медиаторные механизмы передачи сигнала в клетке (см. разд. 12.3.10). Если температура мембраны опускается ниже точки ее замерзания, подвижные переносчики уже не могут диффундировать через липидный бислой, и ионный транспорт прекращается. Наличие такой температурной зависимости свидетельствует о том, что данный ионофор - это подвижный переносчик. Если же транспорт ионов продолжается даже в замороженном бислое, можно сделать вывод, что его осуществляет каналообразующий ионофор. Примером ионофора такого типа является грамицидин А. Он представляет собой линейный полипептид, состоящий из 15 аминокислотных Рис. 6-66 . Подвижный переносчик ионов и каналообразующий ионофор. В обоих случаях поток ионов проходит через мембрану только по электрохимическому градиенту. Рис. 6-67. Молекула валиномицина, связанная с расположенным в центре кольцевой структуры ионом К + при помощи шести атомов кислорода. 407 остатков, все они имеют гидрофобные боковые цепи. Две молекулы грамицидина, вероятно, объединяются в бислое и формируют трансмембранный канал, позволяющий моновалентным катионам (Н + наиболее легко, К + менее, a Na + с трудом) перетекать по их электрохимических градиентам. Подобные димеры нестабильны: они постоянно образуются и диссоциируют, так что время, в течение которого канал открыт, составляет в среднем 1 с. При наличии большого электрохимического градиента грамицидин А поможет пропустить около 20 000 катионов в расчете на один открытый канал за 1 миллисекунду, что в 1000 раз больше, чем может перенести за то же время одна молекула подвижного переносчика. Грамицидин - это антибиотик, вырабатываемый определенными штаммами бактерий для уничтожения других микроорганизмов. Его антибактериальное действие основано на том, что он нарушает нормальные градиенты концентраций Н + , Na + и К + , чрезвычайно важные для жизнедеятельности клеток. Заключение Липидные бислои в значительной степени не проницаемы для большинства полярных молекул. Для транспортировки малых водорастворимых молекул в клетку или из клетки в плазматических мембранах содержится большое число различных транспортных белков, каждый из которых ответствен за перенос определенного вещества через мембрану. Существуют два класса мембранных транспортных белков - переносчики и каналы. И те и другие формируют сквозные транспортные пути через липидный бислой. Белки-переносчики связывают специфические вещества и переносят их через бислой, подвергаясь ряду конформационных изменений, позволяющих экспонировать связывающие вещество участки последовательно: сначала с одной стороны мембраны, а затем с другой. Некоторые белки-переносчики транспортируют вещества только «с горки», другие же, испытывая ряд конформационных изменений, вызываемых гидролизом АТР или связыванием ионов, способны работать как насосы, активно качая связывающееся с ними растворенное вещество «в горку» против его электрохимического градиента. Белки-каналы образуют в бислое заполненные водой поры, позволяя, таким образом, неорганическим ионам подходящего размера и заряда перемещаться через мембрану по их электрохимическим градиентам. Скорость прохождения в этом случае по крайней мере в 1000 раз выше, чем при транспорте с помощью белков-переносчиков. Эти ионные каналы имеют «ворота» и обычно открываются на короткое время в ответ на специфические возбуждения в мембране, такие, как связывание нейротрансмиттеров (нейротрансмиттер-зависимые воротные каналы) или изменение мембранного потенциала (потенциал-зависимые воротные каналы) . |