Молекулярная биология клетки. Том 1. Молекулярная биология клетки 2Molecular Bruce Alberts, Dennis Bray,Biology
 Скачать 25.6 Mb.
|
|
Рис. 7-25. Схема важного эксперимента, который показал, что АТР-синтетазу можно привести в действие простым током протонов. Путем сочетания светозависимого бактериального протонного насоса (бактериородопсина), АТР-синтетазы, выделенной из митохондрий бычьего сердца, и фосфолипидов были получены липосомы, синтезирующие при воздействии света АТР. 449 Рис. 7-26. АТР-синтетаза представляет собой обратимое сопрягающее устройство для взаимопревращения энергии электрохимического протонного градиента и энергии химических связей. Она известна также как F 0 F 1 -АТРаза и состоит по меньшей мере из девяти различных полипептидных цепей. Пять из этих цепей образуют сферическую головку комплекса, называемую F 1 -АТРазой. АТР-синтетаза способна либо синтезировть АТР за счет энергии протонодвижущей силы (вверху), либо перекачивать протоны против электрохимического градиента за счет гидролиза АТР (внизу). Как объяснено в тексте, направление действия фермента в любой данный момент зависит от суммарного изменения свободной энергии для сопряженных процессов - для перемещения протонов через мембрану и для синтеза АТР из ADP и P i Ранее мы уже показали, что свободная энергия гидролиза АТР зависит от концентрации трех реагирующих веществ - АТР, ADP и Р i (см. рис. 7-22). ∆G для синтеза АТР - это та же величина, взятая с минусом. Свободная энергия перемещения протонов через мембрану равна сумме (1) ∆G для перемещения одного моля любых ионов между областями с разностью потенциалов ∆V и (2) ∆G для перемещения моля любых молекул между областями с различной их концентрацией. Уравнение для протонодвижущей силы, приведенное в разд. 7.1.7, объединяет те же самые составляющие, но только разность концентраций заменена эквивалентным ей приращением мембранного потенциала, так что получается выражение для «электрохимического потенциала» протона. Таким образом, ∆G для перемещения протонов и протонодвижущая сила учитывают один и тот же потенциал, только в первом случае он измеряется в килокалориях, а во втором - в милливольтах. Коэффициентом для перевода из одних единиц в другие служит число Фарадея. Таким образом, ∆G Н + = -0,023 (протонодвижущая сила), где ∆G Н + выражается в килокалориях на 1 моль (ккал/моль), а протонодвижущая сила - в милливольтах (мВ). Если электрохимический протонный градиент равен 220 мВ, то ∆G Н + = 5,06 ккал/моль. Как будет работать в данный момент АТР-синтетаза - в направлении синтеза или гидролиза АТР, - зависит от точного баланса между изменениями свободной энергии для прохождения трех протонов через мембрану в матрикс (∆G 3H+ меньше нуля) и для синтеза АТР в матриксе (∆G СИНТ. АТР больше нуля). Как уже говорилось, величина ∆G СИНТ. АТР определяется концентрациями трех веществ в матриксе митохондрии - АТР, ADP и Р i (см. рис. 7-22). С другой стороны, величина ∆G ЗН+ будет пропорциональна протонодвижущей силе на внутренней мембране. Приводимый ниже пример поможет понять, каким образом соотношение между этими двумя изменениями свободной энергии влияет на работу АТР-синтетазы. Как объяснено в подписи к рис. 7-26, переход одного протона в матрикс по электрохимическому градиенту, равному 220 мВ, высвобождает 5,06 ккал/моль, а переход трех протонов - в три раза больше энергии (∆G ЗН + = -15,2 ккал/моль). Таким образом, при постоянной протонодвижущей силе (220 мВ) АТР-синтетаза будет синтезировать АТР до тех пор, пока отношение АТР к ADP и Р i не достигнет такого значения, при котором величина ∆G CИHT. АТР станет в точности равна + 15,2 ккал/моль (при этом ∆G СИНT. АТР + ∆G ЗН + = 0). При таких условиях синтез АТР будет точно уравновешиваться его гидролизом. Предположим, что в связи с реакциями, требующими затраты энергии, в цитозоле внезапно гидролизовалось большое количество АТР, и это привело к падению отношения АТР: ADP в матриксе митохондрии. В этом случае ∆G СИНТ. АТР понизится (см. рис. 7-22) и АТР-синтетаза вновь переключится на синтез АТР, пока не восстановится исходное отношение АТР: ADP. Если же протонодвижущая сила внезапно снизится и будет поддерживаться на постоянном уровне 200 мВ, то ∆G 3H + уменьшится до —13,8 ккал/моль. В результате 450 АТР-синтетаза начнет расщеплять АТР, и эта реакция будет продолжаться до тех пор, пока соотношение между концентрациями АТР и ADP не достигнет какого-то нового значения (при котором ∆G синт. АТР — +13,8 ккал/моль), и так далее. Как мы увидим позже, у многих бактерий АТР-синтетаза обращает свое действие при каждом переходе от аэробного метаболизма к анаэробному и обратно. Подобная обратимость свойственна и другим мембранным ферментам, сопрягающим перенос ионов с синтезом или гидролизом АТР. Например, натрий-калиевый й кальциевый насосы (второй из них описан в гл. 6) гидролизуют АТР и используют высвобождаемую энергию для перекачки через мембрану определенных ионов (см. разд. 6.4.5). Если любой из этих насосов заставить работать в условиях необычно крутого градиента транспортируемых ионов, то он будет действовать в обратном направлении - синтезировать АТР из ADP и P I , вместо того чтобы осуществлять гидролиз АТР. Таким образом, подобно АТР-синтетазе, эти насосы способны преобразовывать энергию, запасаемую в трансмембранном ионном градиенте, непосредственно в энергию фосфатных связей АТР. 7.2.4. Дыхательная цепь переносит ионы Н + через внутреннюю митохондриальную мембрану [16] Если АТР-синтетаза в норме не транспортирует Н + из матрикса, то дыхательная цепь, находящаяся во внутренней митохондриальной мембране, при нормальных условиях переносит через эту мембрану протоны, создавая таким образом электрохимический протонный градиент, доставляющий энергию для синтеза АТР. При определенных условиях можно экспериментально продемонстрировать способность дыхательной цепи откачивать протоны из матрикса. Можно, например, обеспечить взвесь изолированных митохондрий подходящим субстратом для окисления, а поток протонов через АТР-синтетазу блокировать. В анаэробных условиях небольшая добавка кислорода к такому препарату вызовет вспышку дыхательной активности, которая будет длиться одну-две секунды - пока весь кислород не израсходуется. Во время такой вспышки дыхания с помощью чувствительного рН-электрода можно зарегистрировать внезапное подкисление среды в результате выталкивания ионов Н + из матрикса митохондрий. Сходный эксперимент можно провести и на взвеси субмитохондриальных частиц. В этом случае при продувании кислорода среда будет подщелачиваться, так как мембрана здесь «вывернута наизнанку» и потому протоны будут накачиваться внутрь частиц. 7.2.5. Многие переносчики электронов могут быть идентифицированы с помощью методов спектроскопии [17] , Большинство переносчиков электронов, входящих в состав дыхательной цепи, поглощают свет, и их окисление или восстановление сопровождается изменением цвета. Обычно спектр поглощения и реакционноспособность каждого переносчика достаточно характерны, что позволяет даже в неочищенном экстракте прослеживать изменения его состояний с помощью спектроскопии. Это дало возможность выделить такие переносчики задолго до того, как стала понятна их истинная функция. Например, цитохромы были открыты в 1925 г. как соединения, которые быстро окисляются и восстанавливаются у таких различных организмов, как дрожжи, бактерии и насекомые. Наблюдая клетки и ткани с помощью спектроскопа, удалось идентифицировать три типа 451 цитохромов, которые различались по спектрам поглощения и были названы цитохромами a, b и с. Эта номенклатура сохранилась до сих пор, хотя сейчас известно, что клетки содержат несколько видов цитохромов каждого типа, и классификация по типам не отражает их функцию. Цитохромы образуют семейство окрашенных белков, объединяемых наличием в их молекуле связанной группы гема; принимая один электрон, атом железа, входящий в состав гема, восстанавливается - переходит из состояния Fe III в состояние Fe II. Гем содержит порфириновое кольцо и атом железа, прочно связанный с помощью четырех азотных атомов, расположенных в углах квадрата (рис. 7-27). Близкие по строению порфириновые кольца определяют красный цвет крови и зеленый цвет листьев, связывая железо в гемоглобине (разд. 10.5.3) и магний в хлорофилле (разд. 7.3.6). Из множества белков дыхательной цепи лучше всего изучен цитохром с; его трехмерная структура была определена методом рентгеноструктурного анализа (рис. 7-28). Железо-серные белки образуют вторую важную группу переносчиков электронов. В молекулах этих белков два или четыре атома железа связаны с тем же числом атомов серы и с боковыми цепями цистеина, образуя железо-серный центр белка (рис. 7-29). Железо-серных центров в дыхательной цепи больше, чем цитохромов, но для их выявления нужны методы электронного спинового резонанса (ЭСР), поэтому железо-серные центры менее изучены. Самый простой переносчик электронов представляет собой небольшую гидрофобную молекулу, растворенную в липидном бислое и называемую убихиноном или коферментом Q. Он способен принять или отдать как один, так и два электрона и временно захватывает из среды протон при переносе каждого электрона (рис. 7-30). Рис. 7-27. Строение гема, ковалентно связанного с цитохромом с. Четыре из шести координационных положений железа заняты порфириновым кольцом. Пятое и шестое координационные положения ориентированы перпендикулярно к плоскости кольца. Почти во всех цитохромах эти два положения заняты боковыми цепями аминокислот, что не позволяет связывать здесь другие лиганды. Исключением служит цитохром а ъ ; так же как в гемоглобине и миоглобине, шестое координационное положение железа в этом компоненте цитохромоксидазы свободно и потому может связывать кислород. В дыхательной цепи имеется пять различных цитохромов. Поскольку гемы, входящие в состав разных цитохромов, несколько различаются по своему строению и не одинаковым образом связаны с соответствующими белками, не одинаково и их сродство к электронам. Рис. 7-28. Трехмерная модель цитохрома с - одного из переносчиков электронов в дыхательной цепи. Этот небольшой белок, содержащий немногим больше 100 аминокислотных остатков, может перемещаться в мембране, так как связан лишь ионными взаимодействиями (см. рис. 7-35). Атом железа (выделен более темным цветом) в составе связанного гема (окрашенного слабее) способен переносить один электрон (см. также рис. 3- 52, А). 452 Рис. 7-29. Строение железо-серных центров двух типов. А. Центр типа 2Fe2S. Б. Центр типа 4Fe4S. Хотя в состав центра входят несколько атомов железа, каждый из центров способен переносить за один раз только один электрон. В дыхательной цепи имеется более шести различных железо- серных центров. Помимо шести различных гемов в молекулах цитохромов, более чем шести железо-серных центров и убихинона, имеются еще два атома меди и флавин, служащие переносчиками электронов и прочно связанные с белками дыхательной цепи на всем пути от NADH до кислорода. Путь переноса электронов включает всего около 40 различных белков. Порядок расположения различных переносчиков в дыхательной цепи был определен с помощью сложных спектроскопических измерений (рис. 7-31), и вначале многие белки были выделены и описаны как отдельные полипептиды. Однако истинное понимание функции дыхательной цепи пришло позднее, когда выяснилось, что белки организованы в три больших ферментных комплекса. 7.2.6. Дыхательная цепь содержит три больших ферментных комплекса, встроенных во внутреннюю мембрану [18] Мембранные белки трудно выделить в виде интактных комплексов, так как они нерастворимы в большинстве водных растворов, а такие вещества, как детергенты и мочевина, необходимые для их солюбилизации, могут нарушать нормальное белок-белковое взаимодействие (разд. 6.2.2). Однако в начале 1960-х гг. было обнаружено, что с помощью относительно мягких ионных детергентов, таких как дезоксихолат (рис. 7-32), можно солюбилизировать некоторые компоненты митохондриальной внутренней мембраны в нативной форме. Это позволило идентифицировать и выделить три главных связанных с мембраной комплекса дыхательных ферментов на пути от NADH до кислорода (рис. 7-33). 1. NADH-дегидрогеназный комплекс самый большой из дыхательных ферментных комплексов - имеет мол. массу свыше 800000 и содержит более 22 полипептидных цепей. Он принимает электроны от NADH и передает их через флавин и по меньшей мере пять железо-серных центров на убихинон - небольшую жирорастворимую молекулу (см. рис. 7-30), передающую электроны на второй комплекс дыхательных ферментов - комплекс b-с 1 . 2. Комплекс b-c 1 состоит по меньшей мере из 8 разных полипептидных цепей и, вероятно, существует в виде димера с мол. массой 500 000. Каждый мономер содержит три гема, связанных с цитохромами, и железо-серный белок. Комплекс принимает электроны от убихинона и передает цитохрому с, небольшому периферическому мембранному белку (см. рис. 7-28), который затем переносит их на цитохромоксидазный комплекс. 3. Цитохромоксидазный комплекс (цитохром аа 3 ) - наиболее изученный из трех комплексов. Он состоит не менее чем из восьми различных Рис. 7-30. Хиноны - важные переносчики электронов в дыхательной цепи. На каждый принятый электрон хинон захватывает из окружающей водной среды по одному протону; при этом он способен переносить как один, так и два электрона. Когда хинон отдает свои электроны следующему переносчику, протоны высвобождаются. В митохондриях млекопитающих хинон представлен убихиноном (коферментом Q), показанным на рисунке; длинный гидрофобный хвост, удерживающий убихинон в мембране, обычно состоит из 10 пятиуглеродных изопреновых единиц. У растений соответствующим переносчиком служит пластохинон, который почти не отличается от убихинона. Для простоты убихинон и пластохинон обычно называют просто хинонами и обозначают Q. 453 полипептидных цепей и выделен как димер с мол. массой 300000; каждый мономер содержит два цитохрома и два атома меди. Этот комплекс принимает электроны от цитохрома с и передает их на кислород. Цитохромы, железо-серные центры и атомы меди способны переносить одновременно только один электрон. Между тем каждая молекула NADH отдает два электрона и каждая молекула О 2 должна принять четыре электрона при образовании молекул воды. В электрон- транспортной цепи имеется несколько электронсобирающих и электронраспределяющих участков, где согласовывается разница в числе электронов. Так, например, цитохромоксидазный комплекс принимает от молекул цитохрома с по отдельности четыре электрона и в конечном итоге передает их на одну связанную молекулу О 2 , что ведет к образованию двух молекул воды. На промежуточных ступенях этого процесса два электрона, прежде чем перейти к участку, связывающему кислород, поступают в гем цитохрома а и связанный с белком атом меди, Сu a . В свою очередь участок связывания кислорода содержит еще один атом меди и гем цитохрома а 3 . Однако механизм образования двух молекул воды в результате взаимодействия связанной молекулы О 2 с четырьмя протонами в точности не известен. В большинстве клеток с цитохромоксидазой взаимодействует около 90% всего поглощаемого кислорода. Токсичность таких ядов, как цианид и азид, связана с их способностью прочно присоединяться к цитохромоксидазному комплексу и блокировать тем самым весь транспорт электронов. 7.2.7. Перенос электронов осуществляется путем случайных столкновений между донорами и акцепторами электронов, диффундирующими во внутренней митохондриальной мембране [19] Два компонента, переносящие электроны между тремя главными ферментными комплексами дыхательной цепи, - убихинон и цитохром с - быстро перемещаются путем диффузии в плоскости мембраны. Рис. 7-31. Общая схема метода, с помощью которого определяют путь перемещения электронов по дыхательной цепи. Степень окисленности переносчиков электронов а, b, с и d непрерывно прослеживают по изменениям их спектров в окисленном и восстановленном состоянии. А. В обычных условиях все переносчики находятся в частично окисленном состоянии. Если добавить специфический ингибитор электронного транспорта, то все переносчики, находящиеся «ниже» места действия ингибитора, становятся более окисленными, а те, что находятся «выше», - более восстановленными. Б. В отсутствие кислорода все переносчики находятся в своих полностью восстановленных состояниях. При внезапном поступлении кислорода переносчики переходят в частично окисленную форму; этот процесс окисления идет с запаздыванием, которое тем больше, чем «выше» расположен в цепи переносчик. Рис. 7-32. Строение молекул относительно мягких анионных детергентов холата и дезоксихолата. Хотя оба детергента достаточно сильны, чтобы солюбилизировать мембранные белки, их часто можно применять без ущерба для активности ферментов. Рис. 7-33. Относительные размеры и форма трех дыхательных ферментных комплексов. Эти грубые трехмерные модели были построены на основе изображений, полученных от двумерных кристаллов (кристаллических слоев) при исследовании их под разными углами с помощью электронного микроскопа. 454 Столкновения между этими подвижными переносчиками и ферментными комплексами вполне позволяют объяснить наблюдаемую скорость переноса электронов (каждый комплекс отдает и принимает один электрон каждые 5-20 миллисекунд). Поэтому нет необходимости предполагать структурную упорядоченность цепи белков-переносчиков в липидном бислое; в самом деле, ферментные комплексы, видимо, существуют в мембране как независимые компоненты и упорядоченный перенос электронов обеспечивается только специфичностью функциональных взаимодействий между компонентами цепи. В пользу этого говорит и тот факт, что различные компоненты Дыхательной цепи присутствуют в совершенно разных количествах. Например, в митохондриях сердца на каждую молекулу NADH-детидрогеназного комплекса приходятся 3 молекулы комплекса b-с 1 , 7 молекул цитохромоксидазного комплекса, 9 молекул цитохрома с и 50 молекул убихинона; весьма различные соотношения этих белков обнаружены и в некоторых других клетках. |