Молекулярная биология клетки. Том 1. Молекулярная биология клетки 2Molecular Bruce Alberts, Dennis Bray,Biology
 Скачать 25.6 Mb.
|
|
неорганических ионов в матрикс [9] Внутренняя мембрана митохондрий отличается необычно высоким содержанием белка - в ней по весу примерно 70% белка и 30% 443 фосфолипидов. Многие из этих белков входят в состав электронтранспортной цепи, поддерживающей протонный градиент на мембране. Другой важный компонент - фермент АТР-синтетаза, катализирующий синтез АТР. Это большой белковый комплекс, через который протоны перетекают обратно в матрикс по электрохимическому градиенту. Подобно турбине, АТР-синтетаза преобразует одну форму энергии в другую, синтезируя АТР из ADP и Р i в митохондриальном матриксе в ходе реакции, сопряженной с током протонов в матрикс (рис. 7-20). Но синтез АТР - это не единственный процесс, идущий за счет энергии электрохимического градиента. В матриксе, где находятся ферменты, участвующие в цикле лимонной кислоты и других метаболических реакциях, необходимо поддерживать высокие концентрации различных субстратов; в частности, для АТР-синтетазы требуются ADP и фосфат. Поэтому через внутреннюю мембрану должны транспортироваться разнообразные несущие заряд субстраты. Это достигается с помощью различных белков-переносчиков, встроенных в мембрану (см. разд. 6.4.4), многие из которых активно перекачивают определенные молекулы против их электрохимических градиентов, т. е. осуществляют процесс, требующий затраты энергии. Для большей части метаболитов источником этой энергии служит сопряжение с перемещением каких-то других молекул «вниз» по их электрохимическому градиенту (см. разд. 6.4.9). Например, в транспорте ADP участвует система антипорта ADP-ATP: при переходе каждой молекулы ADP в матрикс из него выходит по своему электрохимическому градиенту одна молекула АТР. В то же время система симпорта сопрягает переход фосфата внутрь митохондрии с направленным туда же потоком Н + : протоны входят в матрикс по своему градиенту и при этом «тащат» за собой фосфат. Подобным образом переносится в матрикс и пируват (рис. 7-21). Энергия электрохимического протонного градиента используется также для переноса в матрикс ионов Са 2+ , которые, по-видимому, играют важную роль в регуляции активности некоторых митохондриальных ферментов; большое значение может иметь и поглощение митохондриями этих ионов для удаления их из цитозоля, когда концентрация Са 2+ в последнем становится опасно высокой (см. разд. 12.3.7). Чем больше энергии электрохимического градиента затрачивается на перенос молекул и ионов в митохондрию, тем меньше остается для синтеза АТР. Например, если изолированные митохондрии поместить в среду с высоким содержанием Са 2+ , то они полностью прекратят синтез АТР; вся энергия градиента будет расходоваться на транспорт Са 2+ в матрикс. В некоторых специализированных клетках электрохимический протонный градиент «шунтируется» таким образом, что митохондрии вместо синтеза АТР образуют тепло (см. разд. 7.2.12). Очевидно, клетки способны регулировать использование энергии электрохимического протонного градиента и направлять ее на те процессы, которые наиболее важны в данный момент. 7.1.9. Быстрое превращение ADP в АТР в митохондриях позволяет поддерживать высокое отношение концентраций ATP/ADP в клетках [10] С помощью особого белка, встроенного во внутреннюю мембрану, ADP транспортируется в матрикс в обмен на АТР по принципу антипорта (рис. 7-21). В результате молекулы ADP, высвобождаемые при гидролизе АТР в цитозоле, быстро поступают в митохондрию для «перезарядки», в то время как молекулы АТР, образующиеся в матриксе в процессе окислительного фосфорилирования, тоже быстро выходят в цитозоль, где они нужны. В организме человека молекулы АТР за Рис. 7-20. Общий механизм окислительного фосфорилирования. По мере прохождения высокоэнергетических электронов по электрон- транспортной цепи некоторая часть высвобождаемой энергии используется для приведения в действие трех дыхательных ферментных комплексов, откачивающих протоны из матрикса. В результате этого на внутренней мембране создается электрохимический протонный градиент, под действием которого протоны возвращаются обратно в матрикс через АТР-синтетазу - трансмембранный белковый комплекс, использующий энергию протонного тока для синтеза в матриксе АТР из ADP и Р i. 444 Рис. 7-21 . Некоторые из процессов активного транспорта, идущих за счет энергии электрохимического протонного градиента, который поддерживается на внутренней мембране. Указан заряд каждой из транспортируемых молекул. Наружная мембрана свободно проницаема для всех этих соединений. Транспортные механизмы типа симпорта и антипорта подробно рассмотрены в гл. 6. сутки оборачиваются несколько тысяч раз, что позволяет поддерживать в клетке концентрацию АТР, более чем в 10 раз превышающую концентрацию ADP. Как уже говорилось в гл. 2, биосинтетические ферменты клетки направляют превращения своих субстратов по определенным метаболическим путям, часто осуществляя энергетически невыгодные реакции путем сопряжения их с энергетически выгодным гидролизом АТР (см. рис. 2-27). Таким образом, высококонцентрированный пул АТР обеспечивает внутриклеточные процессы энергией подобно аккумулятору, приводящему в действие электромотор: если митохондрии прекратят свою активность, то клеточная «аккумуляторная батарея» начнет разряжаться и наступит момент, когда энергетически невыгодные реакции уже не смогут осуществляться за счет гидролиза АТР. На первый взгляд может показаться, что такого состояния не будет до тех пор, пока концентрация АТР не упадет до нуля. Фактически же это состояние наступает значительно раньше - при определенном уровне АТР, зависящем от концентраций ADP и Р i . Для того чтобы объяснить, почему так происходит, нужно обратиться к некоторым элементарным принципам термодинамики. 7.1.10. Разница между ∆G° и ∆G. Для того чтобы клетка могла использовать гидролиз АТР, необходима большая отрицательная величина ∆G [11] Согласно второму закону термодинамики, химические реакции протекают спонтанно только в направлении, повышающем «неупорядоченность» во Вселенной. В гл. 2 говорилось о том, что реакции, при которых высвобождаемая энергия рассеивается в виде тепла в окружающую среду (такие, как гидролиз АТР), способствуют увеличению этой неупорядоченности, так как усиливают хаотическое движение молекул. Кроме того, химические реакции могут влиять на степень неупорядоченности, изменяя концентрации реагирующих веществ и продуктов реакции. Суммарное изменение неупорядоченности Вселенной в результате какой-либо реакции определяется изменением свободной энергии, ∆G, сопровождающим эту реакцию: чем больше уменьшается свободная энергия (т. е. больше отрицательное значение ∆G), тем в большей 445 Рис. 7-22. Принципиальная связь между изменениями свободной энергии и равновесием реакции иллюстрируется здесь на примере гидролиза АТР. Приводимая константа равновесия К выражена в литрах на моль. (Вопрос о свободной энергии иллюстрируется на схеме 2-7, с. 96-97; определение константы равновесия дано на рис. 3-7). степени возрастает неупорядоченность Вселенной и тем легче протекает реакция (см. схему 2-7). Величина изменения свободной энергии для гидролиза АТР с образованием ADP и неорганического фосфата при условиях, обычно существующих в клетке, варьирует в пределах от — 11 до — 13 ккал/моль. Однако столь благоприятные условия для протекания этой реакции связаны с тем, что концентрация АТР в клетке поддерживается на очень высоком уровне по сравнению с концентрациями ADP и Р i . При так называемых «стандартных условиях», когда концентрации АТР, ADP и Р i одинаковы и равны 1 моль/л, величину ∆G для гидролиза АТР называют изменением стандартной свободной энергии для данной реакции, ∆G°; она составляет — 7,3 ккал/моль. При какой-то еще более низкой концентрации АТР по сравнению с ADP и P i величина ∆G упадет до нуля. В этом случае скорость образования АТР из ADP и Р i будет равна скорости гидролиза АТР; иными словами, при ∆G = 0 реакция находится в состоянии равновесия (рис. 7-22). При постоянной температуре величина ∆G° постоянна и зависит только от природы реагирующих веществ, тогда как ∆G изменяется при изменении концентраций реагирующих веществ и указывает, насколько данная реакция далека от равновесия. Поэтому именно ∆G, а не ∆G° определяет, может ли данная реакция служить источником энергии для других реакций. Высокая концентрация АТР в клетке (относительно ADP и P I ) при активном синтезе этого вещества в митохондриях обусловливает большую отрицательную величину ∆G для реакции гидролиза АТР и удерживает эту реакцию в состоянии, далеком от равновесия. В противном случае гидролиз АТР не мог бы использоваться клеткой для осуществления других процессов и многие биосинтетические реакции пошли бы в обратном направлении. 446 7.1.11. Клеточное дыхание необычайно эффективно В процессе окислительного фосфорилирования каждая пара электронов NADH обеспечивает энергией образование примерно трех молекул АТР. Пара электронов FADH 2 , обладающая меньшей энергией, дает энергию для синтеза только двух молекул АТР. В среднем каждая молекула ацетил-СоА, поступающая в цикл лимонной кислоты, дает около 12 молекул АТР. Это означает, что при окислении одной молекулы глюкозы образуются 24 молекулы АТР, а при окислении одной молекулы пальмитата - жирной кислоты с 16 углеродными атомами - 96 молекул АТР. Если учесть также экзотермические реакции, предшествующие образованию ацетил-СоА, окажется, что полное окисление одной молекулы глюкозы дает около 36 молекул АТР, тогда как при полном окислении пальмитата образуется примерно 129 молекул АТР. Это максимальные величины, так как фактически количество синтезируемого в митохондриях АТР зависит от того, какая доля энергии протонного градиента идет на синтез АТР, а не на другие процессы. Если сравнить изменение свободной энергии при сгорании жиром и углеводов прямо до СО 2 и Н 2 О с общим количеством энергии запасаемой в фосфатных связях АТР в процессах биологического окисления, окажется, что эффективность преобразования энергии окисления в энергию АТР часто превышает 50%. Это значительно выше эффективности большинства энергопреобразующих устройств, созданных человеком. Если бы клетка работала с эффективностью (к.п.д) электромотора или автомобильного двигателя (10-20%), то организму для поддержания жизни требовалось бы намного больше пищи. Кроме того, поскольку вся неиспользованная энергия высвобождается в виде тепла, крупные организмы нуждались бы в более эффективных способах отвода тепла в окружающую среду. Изучая клеточное дыхание, студенты иногда удивляются, почему химические взаимопревращения в клетке идут таким сложным путем. Казалось бы, вполне можно обойтись без цикла лимонной кислоты и многих звеньев дыхательной цепи и окислять сахара до СО 2 и Н 2 О более прямым способом. Но, хотя в этом случае ход процессов дыхания было бы легче запомнить, для клетки подобный путь оказался бы катастрофическим. Огромное количество свободной энергии, высвобождаемое при окислении, может эффективно использоваться только мелкими порциями. В сложном процессе окисления участвует много промежуточных продуктов, каждый из которых лишь незначительно отличается от предыдущего. Благодаря этому высвобождаемая энергия дробится на меньшие количества, которые можно эффективно преобразовывать с помощью сопряженных реакций в высокоэнергетические связи молекул АТР и NADH (см. рис. 2-17). Заключение Митохондрии осуществляют большую часть клеточных процессов окисления и производят почти весь АТР животной клетки. Митохондриальный матрикс содержит множество разнообразных ферментов, в том числе ферменты, окисляющие пируват и жирные кислоты до ацетил-СоА, и ферменты, окисляющие этот ацетил-СоА до СО г в цикле. лимонной кислоты. В ходе этих реакций окисления образуются большие количества NADH (и FADH 2 ). Энергия, получаемая при соединении кислорода с переносимыми NADH и FADH 2 реакционноспособными электронами, используется электронтранспортной цепью, находящейся во внутренней мембране митохондрии и называемой дыхательной цепью. Дыхательная цепь «откачивает» протоны из матрикса, что приводит 447 к созданию трансмембранного электрохимического протонного градиента, слагающегося из мембранного потенциала и разности рН. Энергия трансмембранного градиента в свою очередь используется для синтеза АТР и для активного транспорта необходимых метаболитов через внутреннюю митохондриальную мембрану. Сочетание этих реакций обеспечивает эффективный обмен ATP-ADP между митохондрией и цитозолем, что позволяет поддерживать в клетке высокий уровень АТР. 7.2. Дыхательная цепь и АТР-синтетаза [12] Ознакомившись в общих чертах с функцией митохондрий, перейдем теперь к более детальному рассмотрению цепи дыхания - электрон- транспортной цепи, имеющей столь важное значение для окислительного метаболизма в целом. Большинство элементов этой цепи составляет неотъемлемую часть внутренней митохондриальной мембраны и может служить одним из самых ярких примеров сложного взаимодействия между отдельными белками биологической мембраны. 7.2.1. Из митохондрий можно выделить функционально активные частицы, «вывернутые наизнанку» [13] В интактных митохондриях дыхательная цепь относительно недоступна для экспериментального анализа. Однако путем обработки митохондрий ультразвуком можно получить функционально активные субмитохондриальные частицы - обрывки крист, замкнувшиеся в маленькие пузырьки около 100 нм в диаметре (рис. 7-23). При использовании метода негативного контрастирования на электронных микрофотографиях субмитохондриальных частиц видно, что их наружная поверхность усеяна крошечными шариками, прикрепленными к мембране с помощью «ножки» (рис. 7-24). В интактных митохондриях эти грибовидные структуры локализованы на внутренней (обращенной к матриксу) стороне внутренней мембраны. Таким образом, субмитохондриальные частицы представляют собой как бы вывернутые наизнанку фрагменты внутренней мембраны: поверхности их, ранее обращенные к матриксу, обращены теперь к окружающей среде. В результате на них легко воздействовать теми не проходящими через мембрану веществами, которые в обычных условиях находились в матриксе. При добавлении NADH, ADP и неорганического фосфата эти частицы осуществляют перенос электронов с NADH на О 2 , сопрягая это окисление с синтезом АТР. Такая бесклеточная система дает возможность выделять в функционально активной форме многочисленные белки, ответственные за окислительное фосфорилирование. 7.2.2. АТР-синтетазу можно выделить и снова встроить в мембрану в активной форме [14] В 1960 г. было впервые показано, что различные мембранные белки, участвующие в окислительном фосфорилировании, могут быть выделены без потери активности. От поверхности субмитохондриальных частиц удалось отделить и перевести в растворимую форму усеивающие их крошечные белковые структуры. Хотя субмитохондриальные частицы без этих сферических структур продолжали окислять NADH в присутствии кислорода, синтеза АТР при этом не происходило. С другой стороны, выделенные структуры действовали как АТРазы, гидролизуя АТР до ADP и Р i . Когда сферические структуры (названные F 1 – Рис. 7-23. Методика получения субмитохондриальных частиц из митохондрий. Частицы представляют собой обрывки разрушенных крист, образовавшие замкнутые пузырьки. 448 Рис. 7-24. Электронная микрофотография субмитохондриальных частиц. (С любезного разрешения Efraim Racker.) АТРазами) добавляли к лишенным их субмитохондриальным частицам, реконструированные частицы вновь синтезировали АТР из АDP и Р i , Впоследствии было показано, что F 1 -АТРаза - это часть большого, пронизывающего всю толщу мембраны комплекса (массой около 500000 дальтон), который состоит но меньшей мере из девяти различных полипептидных цепей. Этот комплекс получил название АТР-синтетазы (или F 0 F 1 -АТРазы); он составляет около 15% всего белка внутренней митохондриальной мембраны. Весьма сходные АТР-синтетазы имеются в мембранах хлоропластов и бактерий. Такой белковый комплекс содержит трансмембранные каналы для протонов, и синтез АТР происходит только тогда, когда через эти каналы проходят протоны вниз по своему электрохимическому градиенту. В экспериментах, проведенных в 1974 г., было очень наглядно показано, как работает АТР-синтетаза. К тому времени уже были разработаны методы введения интегральных мембранных белков, предварительно солюбилизированных с помощью детергента, в липидные пузырьки (липосомы), приготовленные из очищенных фосфолипидов (см. разд. 6.1.2). Это позволило создать «гибридную» мембрану, которая одновременно содержала очищенную митохондриальную АТР-синтетазу и бактериородопсин, выполняющий у бактерий функцию светозависимого протонного насоса (см. разд. 6.2.7). При освещении таких пузырьков протоны, накачиваемые внутрь бактериородопсином, выходили наружу через АТР-синтетазу, и в результате в окружающем растворе накапливался АТР (рис. 7-25). Так как прямое взаимодействие между бактериальным протонным насосом и АТР-синтетазой млекопитающих вряд ли возможно, этот эксперимент указывает на то, что и в митохондриях активный перенос протонов и синтез АТР - это, по всей вероятности, два раздельных процесса в общем механизме окислительного фосфорилирования. 7.2.3. АТР-синтетаза может действовать в обратном направлении - расщеплять АТР и перекачивать протоны [16] Действие АТР-синтетазы обратимо: она способна использовать как энергию гидролиза АТР для перекачивания протонов через внутреннюю митохондриальную мембрану, так и энергию потока протонов по электрохимическому градиенту для синтеза АТР (рис. 7-26). Таким образом, АТР-синтетаза - это обратимая сопрягающая система, которая осуществляет взаимопревращение энергии электрохимического протонного градиента и химических связей. Направление ее работы зависит от соотношения между крутизной протонного градиента и локальной величиной ∆G для гидролиза АТР. АТР-синтетаза получила свое название в связи с тем, что в обычных условиях протонного градиента, поддерживаемого дыхательной цепью (см. рис. 7-20), синтезирует большую часть всего АТР клетки. Число протонов, необходимое для синтеза одной молекулы АТР, в точности не известно. Для упрощения приводимых ниже расчетов мы будем предполагать, что при прохождении через АТР-синтетазу каждых трех протонов синтезируется одна молекула АТР. |