Молекулярная биология клетки. Том 1. Молекулярная биология клетки 2Molecular Bruce Alberts, Dennis Bray,Biology
 Скачать 25.6 Mb.
|
|
7.2.8. Значительный перепад окислительно-восстановительного потенциала на каждом из трех комплексов дыхательной цепи доставляет энергию, необходимую для перекачивания протонов [12, 20] Такую пару, как Н 2 О и 1 / 2 О 2 (или NADH и NAD + ), называют сопряженной окислительно-восстановительной парой, так как один из ее членов превращается в другой, если добавить один или несколько электронов и один или несколько протонов (последних всегда достаточно в любом водном растворе). Так, например, 1 / 2 О 2 + 2е - + 2Н + → Н 2 О. Хорошо известно, что смесь соединений, образующих сопряженную кислотно-щелочную пару, в соотношении 50:50 действует как буфер, поддерживающий определенное «давление протонов» (рН), величина которого определяется константой диссоциации кислоты. Точно таким же образом смесь компонентов сопряженной окислительно-восстановительной пары в соотношении 50:50 поддерживает определенное «давление электронов», или окислительно-восстановительный потенциал (редокс-потенциал) Е, служащий мерой сродства молекулы-переносчика к электронам. Помещая электроды в раствор с соответствующими окислительно-восстановительными парами, можно измерить редокс-потенциал каждого переносчика электронов, участвующего в биологических окислительно-восстановительных реакциях. Пары соединений с наиболее отрицательными значениями редокс-потенциала обладают наименьшим средством к электронам, т. е. содержат переносчики с наименьшей тенденцией принимать электроны и наибольшей тенденцией их отдавать. Например, смесь NADH и NAD + (50:50) имеет редокс-потенциал — 320 мВ, что указывает на сильно выраженную способность NADH отдавать электроны, тогда как редокс-потенциал смеси равных количеств Н 2 О и 1 / 2 О 2 составляет +820 мВ, что означает сильную тенденцию О 2 к принятию электронов. Окислительно-восстановительные потенциалы можно измерять для всех переносчиков электронтранспортной цепи, различимых по их спектрам. Можно, например, шунтировать цепь, добавляя небольшие молекулы, способные легко отдавать и принимать электроны. При этом производят спектральные измерения, чтобы определить отношение 455 Рис. 7-34 . Возрастание редокс-потенциала (обозначаемого Е' 0 или Е h ) по мере прохождения электронов по дыхательной цепи к кислороду. На оси ординат справа - величины стандартной свободной энергии переноса каждого из двух электронов, отдаваемых одной молекулой NADH [∆G = - п (0,023)∆E 0 `, где n - число переносимых электронов при перепаде редокс-потенциала ∆E 0 ' мВ]. В каждом дыхательном ферментном комплексе электроны последовательно проходят через четыре или большее число переносчиков. Как уже говорилось, часть высвобождаемой энергии используется каждым ферментным комплексом для перекачивания протонов через внутреннюю митохондриальную мембрану. Число протонов, перекачиваемых на каждый переносимый электрон (п), точно не известно. Два электрона от FADH 2 , образованного при окислении жирных кислот (см. рис. 7-11) и в цикле лимонной кислоты (см. рис. 7-14), дают меньше полезной энергии, чем два электрона от NADH. Поскольку редокс-потенциал FADH 2 близок к 0 мВ, при переносе электронов с FADH 2 на убихинон не происходит запасания энергии (на схеме это не показано). Поэтому транспорт электронов от FADH 2 до кислорода приводит к перемещению протонов только на двух, а не на трех участках дыхательной цепи. концентраций окисленной и восстановленной форм для каждого переносчика; для этого ступенчатым образом изменяют редокс-потенциал шунтирующего раствора. Как и следовало ожидать, оказалось, что потенциалы возрастают вдоль по ходу цепи переносчиков. У большинства цитохромов они выше, чем у железо-серных центров; и соответственно цитохромы обычно располагаются вблизи О 2 -конца дыхательной цепи, а железо-серные белки - вблизи NADH-конца. На рис. 7-34 показаны уровни окислительно-восстановительного потенциала на различных участках дыхательной цепи. Резкий перепад имеет место в пределах каждого из трех главных дыхательных комплексов. Разность потенциалов между любыми двумя переносчиками электронов прямо пропорциональна энергии, высвобождаемой при переходе электрона от одного переносчика к другому (рис. 7-34). Каждый комплекс действует как энергопреобразующее устройство, направляя эту свободную энергию на перемещение протонов через мембрану, что приводит к созданию электрохимического протонного градиента по мере прохождения электронов по цепи. Такое преобразование энергии можно прямо продемонстрировать, включив по отдельности любой изолированный комплекс дыхательной цепи в липосомы (см. рис. 7-25). В присутствии подходящего донора и акцептора электронов такой комплекс будет переносить электроны, что приведет к перекачиванию протонов через мембрану липосомы. Для работы энергопреобразующего механизма, лежащего в основе окислительного фосфорилирования, нужно, чтобы каждый ферментный комплекс дыхательной цепи был ориентирован во внутренней митохондриальной мембране определенным образом - так, чтобы все протоны перемещались в одном направлении, т. е. из матрикса наружу (рис. 7-35). Такая векторная организация мембранных белков была продемонстрирована с помощью специальных зондов, не проходящих сквозь мембрану, которыми метили комплекс только с какой-нибудь одной стороны мембраны (разд. 6.2.3). Специфическая ориентация в бислое свойственна всем мембранным белкам и очень важна для их функции. 456 Рис. 7-35. Схема переноса двух электронов через три главных дыхательных комплекса от NADH к кислороду. В качестве переносчиков между комплексами выступают убихинон и цитохром с. 7.2.9. Механизмы перекачивания протонов компонентами дыхательной цепи еще не вполне ясны В процессе окислительного фосфорилирования при окислении одной молекулы NADH (т. е. при прохождении двух электронов через все три ферментных комплекса) образуется не более трех молекул АТР. Если предположить, что обратное прохождение трех протонов через АТР- синтетазу обеспечивает синтез одной молекулы АТР (разд. 7.2.3), можно будет заключить, что в среднем перенос одного электрона каждым комплексом сопровождается перемещением полутора протонов (иными словами, при транспорте одного электрона некоторые комплексы перекачивают один протон, а другие - два протона). Вероятно, у разных компонентов дыхательной цепи существуют разные механизмы сопряжения транспорта электронов с перемещением протонов. Аллостерические изменения конформации белковой молекулы, связанные с транспортом электронов, могут в принципе сопровождаться «перекачиванием» протонов, подобно тому как перемещаются протоны при обращении действия АТР-синтетазы (разд. 7.2.3). Кроме того, как уже упоминалось, при переносе каждого электрона хинон захватывает из водной среды протон, который затем отдает при высвобождении электрона (см. рис. 7-30). Поскольку убихинон свободно передвигается в липидном бислое, он может принимать электроны вблизи внутренней поверхности мембраны и передавать их на комплекс b-c 1 около ее наружной поверхности, перемещая при этом через бислой по одному Н + на каждый перенесенный электрон. С помощью более сложных моделей можно объяснить и перемещение комплексом b-c 1 двух протонов на каждый электрон, предположив, что убихинон повторно проходит через комплекс b-с 1 в определенном направлении. В отличие от этого молекулы, передающие электроны цитохромоксидазному комплексу, по-видимому, не переносят протонов, и в этом случае транспорт электронов, вероятно, связан с определенным аллостерическим изменением конформации белковых молекул, в результате которого какая-то часть белкового комплекса сама переносит протоны. 7.2.10. Н + -ионофоры рассеивают протонный градиент и тем самым разобщают транспорт электронов и синтез АТР [22] С 40-х годов известен ряд липофильных слабых кислот, способных действовать как разобщающие агенты, т. е. нарушать сопряжение 457 транспорта электронов с синтезом АТР. При добавлении к клеткам этих низкомолекулярных органических соединений митохондрии прекращают синтез АТР, продолжая при этом поглощать кислород. В присутствии разобщающего агента скорость транспорта электронов остается высокой, но протонный градиент не создается. Существует простое и изящное объяснение этого эффекта: разобщающие агенты действуют как переносчики Н + (Н + -ионофоры) и открывают дополнительный путь - уже не через АТР-синтетазу - для потока Н + через внутреннюю митохондриальную мембрану. Этот механизм показан на рис. 7-36 на примере широко используемого разобщителя 2,4-динитрофенола. 7.2.11. В нормальных условиях поток электронов по дыхательной цепи сдерживается дыхательным контролем [23] Когда к клеткам добавляют разобщающий агент, например динитрофенол, поглощение кислорода митохондриями значительно возрастает, так как скорость переноса электронов увеличивается. Такое ускорение связано с существованием дыхательного контроля. Полагают, что этот контроль основан на прямом ингибирующем влиянии электрохимического протонного градиента на транспорт электронов. Когда в присутствии разобщителя электрохимический градиент исчезает, не контролируемый более транспорт электронов достигает максимальной скорости. Возрастание градиента притормаживает дыхательную цепь, и транспорт электронов замедляется. Более того, если в эксперименте искусственно создать на внутренней мембране необычно высокий электрохимический градиент, то нормальный транспорт электронов прекратится совсем, а на некоторых участках дыхательной цепи можно будет обнаружить обратный поток электронов. Это позволяет предполагать, что дыхательный контроль отражает простой баланс между изменением свободной энергии при перемещении протонов, сопряженного с транспортом электронов, и изменением свободной энергии при самом транспорте электронов; другими словами, величина электрохимического градиента влияет как на скорость, так и на направление переноса электронов, так же как и на направление действия АТР-синтетазы (разд. 7.2.3). Дыхательный контроль - это лишь часть сложной системы взаимосвязанных регуляторных механизмов с обратными связями, координирующей скорости гликолиза, расщепления жирных кислот, реакций цикла лимонной кислоты и транспорта электронов. Скорости всех этих процессов зависят от отношения АТР: ADP - они возрастают, когда это отношение уменьшается в результате усиленного использования АТР. Например, АТР-синтетаза внутренней митохондриальной мембраны работает быстрее, когда концентрации ее субстратов, т. е. ADP и Р i , увеличиваются. Чем выше скорость этой реакции, тем больше протонов перетекает в матрикс, быстрее рассеивая тем самым электрохимический градиент; а уменьшение градиента в свою очередь приводит к ускорению транспорта электронов. Сходные регуляторные механизмы, в том числе ингибирование ряда ключевых ферментов аденозинтрифосфатом (АТР) по принципу обратной связи (см., например, рис. 7-13), координируют скорость образования NADH с его утилизацией дыхательной цепью. Благодаря этим многочисленным приспособлениям организм при большой физической нагрузке окисляет жиры и сахара в 5-10 раз быстрее, чем во время отдыха. Рис. 7-36. Перенос протонов через внутреннюю митохондриальную мембрану при участии разобщающего агента 2,4-динитрофенола (ДНФ). Заряженная (протонированная) форма ДНФ может свободно проходить через липидный бислой. Полагают, что перенос заряженной формы ДНФ через мембрану осуществляется с помощью анион-транспортного белка (на схеме не представленного). Как показано на рисунке, благодаря электрохимическому протонному градиенту молекулы динитрофенола будут переносить больше протонов в матрикс, чем из него, до тех пор, пока протонодвижущая сила не исчезнет полностью. 458 7.2.12. Природные разобщители превращают митохондрии бурой жировой ткани в генераторы тепла [24] В некоторых специализированных клетках - клетках бурой жировой ткани - митохондриальное дыхание может естественным путем отделяться от синтеза АТР, и тогда большая часть энергии окисления рассеивается в виде тепла, а не превращается в энергию АТР. Внутренняя мембрана крупных митохондрий этих клеток содержит особый транспортный белок, позволяющий протонам перемещаться по их электрохимическому градиенту без активации АТР-синтетазы. В результате клетки окисляют запасы жира с большой скоростью и образуют много тепла, но мало АТР. Таким образом, бурая жировая ткань служит своего рода печкой, которая в нужный момент пробуждает животное, погруженное в зимнюю спячку, а у новорожденного ребенка защищает наиболее чувствительные части тела от переохлаждения. 7.2.13. Все бактерии используют хемиосмотические механизмы Бактерии извлекают энергию из самых разнообразных источников. Некоторые бактерии, подобно животным клеткам, синтезируют АТР, окисляя сахара до СО, и Н 2 О в процессе гликолиза и затем в цикле лимонной кислоты; в плазматической мембране таких бактерий имеется дыхательная цепь, сходная с аналогичной цепью внутренней митохондриальной мембраны. Бактерии других типов - строгие анаэробы получают энергию только за счет реакций гликолиза (брожения) или же за счет окислительных процессов, но конечным акцептором электронов у них служит не кислород, а какая-либо иная молекула. Такими альтернативными акцепторами могут быть соединения азота (нитрат или нитрит), серы (сульфат или сульфит) или углерода (фумарат или карбонат). Электроны передаются на эти акцепторы с помощью ряда переносчиков, находящихся в плазматической мембране и сходных с компонентами дыхательной цепи митохондрий. Несмотря на все эти различия, в плазматической мембране большинства бактерий имеется АТР-синтетаза, очень сходная с АТР- синтетазой митохондрий (и хлоропластов). У анаэробов, не имеющих цепи переноса электронов, АТР-синтетаза работает в обратном направлении - использует образованный в результате гликолиза АТР для создания на плазматической мембране протонодвижущей силы. У аэробных бактерий протонодвижущую силу, заставляющую АТР-синтетазу синтезировать АТР, создает цепь переноса электронов. Почти все бактерии, включая строгих анаэробов, поддерживают на своей мембране протонодвижущую силу. Энергия электрохимического протонного градиента используется у них для вращения бактериального жгутика, что позволяет клетке передвигаться (разд. 12.5.4), и для Рис. 7-37. Протонодвижущая сила, генерируемая на плазматической мембране бактериальной клетки, обеспечивает перенос внутрь питательных веществ и выведение наружу натрия. В присутствии кислорода (А) дыхательная цепь аэробных бактерий создает электрохимический протонный градиент, который используется АТР-синтетазой для синтеза АТР, а также для переноса в клетку некоторых питательных веществ. В анаэробных условиях (Б) те же бактерии получают АТР в результате гликолиза. За счет гидролиза части этого АТР под действием АТР-синтетазы создается трансмембранная протонодвижущая сила, доставляющая энергию для транспортных процессов. (Как описано в тексте, существуют бактерии, у которых цепь переноса электронов откачивает протоны при анаэробных условиях; конечным акцептором электронов в этом случае служит не кислород, а какая-то другая молекула.) 459 откачивания из клетки ионов Н + с помощью механизма антипорта, заменяющего здесь Na + K + -ATPaзy эукариотических клеток. В животных клетках активное поглощение веществ через плазматическую мембрану осуществляется в основном за счет энергии натриевого градиента, создаваемого Na + K + -ATPaзой (разд. 6.4.9). В отличие от этого у бактерий активный перенос питательных веществ в клетку происходит путем Н + -симпорта, при котором необходимые метаболиты поступают в клетку вместе с одним или несколькими протонами при участии специального белка-переносчика. Таким способом в клетку транспортируются многие сахара и большинство аминокислот (рис. 7-37). Среди многообразных типов бактерий есть формы, которые приспособились к крайне неблагоприятным условиям среды. Например, некоторые бактерии живут в сильнощелочной среде и для защиты своих неустойчивых к щелочи молекул, таких, как РНК, должны поддерживать внутри клетки более низкие значения рН, чем снаружи. В таких случаях созданию электрохимического протонного градиента препятствовал бы значительный градиент концентрации протонов, направленный в обратную сторону (уровень Н + выше внутри, чем снаружи). Вероятно, по этой причине толерантные к щелочи морские бактерии Vibrio alginolyticus используют во всех хемиосмотических механизмах Na + , а не Н + . Дыхательная цепь этих бактерий откачивает из клетки Na + , поглощение метаболитов сопряжено с переходом внутрь Na + , жгутик движется за счет входящего тока Na + , и, по-видимому, большая часть АТР синтезируется АТР-синтетазой, приводимой в действие ионами Na + . Существование таких бактерий показывает, что принцип хемиосмоса более фундаментален, чем его обычный частный случай - использование электрохимического протонного градиента. Заключение Дыхательная цепь внутренней митохондриальной мембраны содержит три главных ферментных комплекса, участвующих в переносе электронов с NADH на О 2 . Если любой из этих комплексов выделить и встроить в мембрану липосомы, то можно продемонстрировать способность его переносить через эту мембрану протоны одновременно с транспортом электронов. В естественной мембране цепь переноса электронов дополняют мобильные переносчики - убихинон и цитохром с, передвигающиеся, подобно челнокам, от одного ферментного комплекса к другому и обратно. Путь электронов в этой цепи можно представить следующей схемой: NADH → NADH-дегидрогеназный комплекс → убихинон → комплекс b-с 1 → цитохром с → цитохромоксидазный комплекс - молекулярный кислород (О 2 ). Дыхательные ферментные комплексы сопрягают транспорт электронов, сопровождающийся выделением энергии, с откачиванием протонов из матрикса. Создаваемый при этом электрохимический протонный градиент доставляет энергию для синтеза АТР еще одним трансмембранным белковым комплексом-АТР-синтетазой, через которую протоны возвращаются в матрикс. АТР-синтетаза - это обратимый сопрягающий комплекс; в норме он преобразует энергию потока протонов, направленного в матрикс, в энергию фосфатных связей АТР, но при уменьшении электрохимического протонного градиента он способен также использовать энергию гидролиза АТР для перемещения протонов из матрикса наружу. Хемиосмотические механизмы свойственны как митохондриям и хлоропластам, так и бактериям, что указывает на исключительную важность их для всех клеток. |