Молекулярная биология клетки. Том 1. Молекулярная биология клетки 2Molecular Bruce Alberts, Dennis Bray,Biology
 Скачать 25.6 Mb.
|
|
К + - проточным каналам, которые обеспечивают свободный переход этих ионов через мембрану и позволяют им засасываться внутрь клетки за счет отрицательного заряда фиксированных анионов (даже при отсутствии какой бы то ни было работы (Na + + К + )-АТРазы. Таким образом, устанавливается равновесие, при котором электрическая сила, «втягивающая» ионы калия внутрь клетки, уравновешивается стремлением К + вытекать из клетки по градиенту концентрации. Мембранный потенциал является выражением этой электрической энергии и его величина может быть рассчитана из крутизны градиента концентрации К + , необходимой для уравновешивания электрических сил. Поясним на таком примере. Предположим, что электрический градиент через плазматическую мембрану первоначально отсутствует (т. е. мембранный потенциал равен нулю), но концентрация К + внутри клетки выше (для уравновешивания 397 УРАВНЕНИЕ НЕРНСТА И ПОТОК ИОНОВ Поток любых ионов через белковый мембранный канал зависит от их электрохимического градиента. Этот градиент представляет собой комбинацию двух компонентов: градиента напряжения и градиента концентрации ионов через мембрану. Когда эти две составляющие уравновешивают друг друга, электрохимический градиент для данного иона равен нулю. Это значит, что суммарный поток ионов через канал будет отсутствовать. Градиент напряжения (мембранный потенциал), при котором наблюдается такое равновесие, называется потенциалом равновесия. Он может быть вычислен из уравнения, которое будет выведено ниже и называется уравнением Нернста. Уравнение Нернста V = RT/ zF lnC 0 /C i , где V — потенциал равновесия в вольтах (потенциал внутри клетки минус потенциал снаружи), C 0 и С i — внешняя и внутренняя концентрация ионов, соответственно, R — универсальная газовая постоянная (2 кал х моль -1 х °К) Т — абсолютная температура (°К), F — постоянная Фарадея (2,3 х 10 4 кал х В -1 х моль -1 ) , z — заряд иона. Уравнение Нерста выводится следующим образом: молекулы в растворе всегда движутся из области с высокой концентрацией в область с низкой. Следовательно, движение по градиенту концентрации сопровождается понижением свободной энергии (∆G < 0), тогда как движение против градиента концентрации ведет к возрастанию свободной энергии (∆G > 0). (Понятие свободной энергии вводится и обсуждается на схеме 2-7.). Изменение свободной энергии на моль растворенного вещества, перенесенного через мембрану (∆G conc ) равно — RT lnC 0 /C i . Если растворенным веществом являются ионы, то их перемещение внутрь клетки через мембрану (со скачком напряжения на ней, равным V) будет вызывать дополнительное изменение свободной энергии (на моль перемещенного вещества) ∆G = -zFV. При условии равновесия ∆G conc + ∆G volt = 0 распределение ионов на двух сторонах Мембраны будет равновесным. Таким образом, zF - RT lnC 0 /C i = 0, и, следовательно, V = RT/zF In C 0 /C i = 2,3 RT/zF Ig C o /C i Для одновалентных ионов 2,3 RT/F - 58 мВ при 20°С и 61,5 мВ при 37°С. Поэтому, когда мембранный потенциал имеет значение 61,5 lg( [К + ] 0 / [К + ],) милливольт (-89 мВ, когда [К + ] о = 5 мМ и [К + ] = 140 мВ), он является потенциалом равновесия для К + (V k ), при котором отсутствует суммарный ток К через мембрану. Аналогично, когда мембранный потенциал имеет значение 61,5 Ig ( [Na + ] o / [Na + ] i ) — равновесный потенциал для Na + (V Na ), отсутствует ток Na + . Для типичной клетки V k колеблется от — 70 мВ до — 100 мВ, a V Na от +50 мВ до +65 мВ. Для какого-либо отдельного мембранного потенциала V M , суммарная сила, стремящаяся вывести отдельный тип ионов из клетки, пропорциональна разнице между V M и равновесным потенциалом для этих ионов. Например, для K + : V M — V k и для Na + : V M — V Nа. Реальный ток, осуществляемый каждым видом ионов зависит не только от движущей силы, но также и от степени проницаемости мембраны для данного иона через каналы, которая есть функция проводимости каналов для данного иона. Если проводимость набора каналов для К + и Na + соответственно g К и g Na , из закона Ома следует, что токи К + и Na + соответственно будут равны g К ( V м - V к ) и g Na (V M - V Na ) (пpoводимость есть величина, обратная сопротивлению, а единица измерения, обратная ому, есть сименс, S). Большинство индивидуальных ионных каналов имеет проводимость в пределах 1 — 150 х 10 -12 S или 1 — 150 pS). При мембранном потенциале покоя в большинстве клеток К -каналы являются основным типом открытых каналов. Поэтому g k доминирует в общей проводимости мембраны. В процессе возникновения потенциала действия в нервных или мышечных клетках открывается на короткое время множество потенциал-зависимых Nа + -каналов, в результате проводимость g Na становится доминирующей в общей проводимости мембраны. Схема 6-2. Вывод уравнения Нернста. 398 заряда фиксированных анионов), чем снаружи. В этом случае ионы калия будут стремиться выйти из клетки через проточные К + -каналы по направлению градиента их концентрации. Если ионы выйдут из клетки, то внутри останется отрицательный заряд и, таким образом, возникнет электрическое поле, другими словами, мембранный потенциал, стремящийся вернуть ионы К + в клетку. Вытекание ионов калия прекратится, как только образовавшийся мембранный потенциал достигнет значения, при котором электрическая движущая сила, действующая на ионы калия, точно уравновесит действие градиента концентрации К + , т.е. когда электрохимический градиент ионов калия окажется равным нулю. Таким же образом создается одновременно и равновесие для ионов Сl - , но, поскольку их заряд отрицательный, они удерживаются вне клетки. Равновесные условия, при которых отсутствует электрический ток через мембрану, определяют клеточный мембранный потенциал покоя. Существует простая, но очень важная формула, количественно выражающая условия равновесия - уравнение Нернста. Как показано на схеме 6-2, она позволяет рассчитать мембранный потенциал покоя, если известно соотношение внутренней и внешней концентраций ионов. Для того чтобы установился мембранный потенциал, достаточно перенести через мембрану совсем небольшое количество ионов. Таким образом, мембранный потенциал можно представить себе как перемещение зарядов, оставляющее концентрации ионов практически неизменными. В результате происходит лишь небольшое перераспределение числа положительно и отрицательно заряженных ионов между сторонами мембраны (рис. 6-57). Более того, это перемещение зарядов происходит очень быстро, за несколько миллисекунд или даже быстрее. Рассмотрим, что случится, если инактивировать (Na + + К + )-АТРазу. Прежде всего произойдет небольшое быстрое падение мембранного потенциала, поскольку (Na + + К + )-насос является электрогенным и в активном состоянии вносит свой вклад в мембранный потенциал (см. разд. 6.4.6). Однако выключение этого насоса не приводит к исчезновению главного компонента потенциала покоя, основанного на механизме уравновешивания ионами калия (как описано выше). Он существует до тех пор, пока концентрация Na + внутри клетки остается низкой, т.е. многие минуты. Но поскольку плазматическая мембрана хоть и плохо, все же проницаема для ионов Na + , то Na + будет медленно входить внутрь клетки по своему электрохимическому градиенту. Приток натрия уменьшает мембранный потенциал и, таким образом, вызывает дополнительный отток ионов К + из клетки. В это время нарушается осмотическое равновесие (см. разд. 6.4.6), но, если клетка не лопнула, со временем установится новое состояние равновесия между ионами Na + , К + и С1 - . При этом мембранный потенциал будет намного ниже, чем в нормальной клетке с активным (Na + + К + )-насосом. Точное равенство зарядов на обеих сторонах мембраны; мембранный потенциал = 0 Несколько положительно заряженных ионов (цветные) пересекли мембрану справа налево, оставив с другой стороны отрицательно заряженные противоионы (цветные); при этом мембранный потенциал отличен от нуля Рис. 6-57 . Небольшой поток ионов несет достаточный заряд для создания большого изменения мембранного потенциала. Ионы, определяющие мембранный потенциал, располагаются вблизи мембраны, удерживаясь за счет взаимодействия с противоионами другой стороны мембраны. Для типичной клетки 1 микрокулон заряда (6 х 10 12 одновалентных иона) на 1 см 2 мембраны, перенесенный с одной стороны на другую, изменит мембранный потенциал примерно на I В. Это значит, что для сферической клетки диаметром 10 мкм вытекание из клетки лишь 1/100000 доли ионов К + будет изменять потенциал на 100 мВ. 399 Разность потенциалов на сторонах плазматической мембраны клетки, находящейся в покое, варьирует в зависимости от организма или типа клеток от — 20 мВ до — 200 мВ. Хотя градиент К + всегда вносит наибольший вклад в этот потенциал, значительным эффектом обладают также и градиенты других ионов (плюс неравновесные эффекты ионных насосов). Чем более проницаема мембрана для данного иона, тем в большей степени мембранный потенциал зависит от равновесных условий для этого иона. Следовательно, практически при любом изменении проницаемости мембраны для ионов происходит изменение и мембранного потенциала. Это ключевой принцип, связывающий электрическую возбудимость клеток с активностью ионных каналов. 6-25 6.4.16. Потенциал-зависимые воротные ионные каналы ответственны за электрическую возбудимость нервных и мышечных клеток [33] В плазматических мембранах электрически возбудимых клеток (главным образом нервных и мышечных) содержится множество потенциал-зависимых воротных ионных каналов, ответственных за генерацию потенциалов действия - быстрых, скоротечных самораспространяющихся электрических возбуждений мембраны. Этот процесс начинается при деполяризации мембраны - смещении мембранного потенциала к менее отрицательному значению. Стимул, который вызывает моментальную частичную деполяризацию, сразу же открывает потенциал-зависимые воротные Na + -каналы, что позволяет небольшому количеству Na + войти в клетку. Приток положительных зарядов в свою очередь деполяризует мембрану еще больше, приводя к открыванию других Na + -каналов, пропускающих дополнительное количество ионов натрия и, таким образом, дальнейшую деполяризацию. Этот процесс продолжается до тех пор, пока потенциал локального участка мембраны не изменится от своего значения покоя около — 70 мВ до равновесного потенциала Na + , равного примерно + 50 мВ (см. схему 6-2). При этом значении, когда суммарный электрохимический потенциал Na + равен нулю, клетки пришли бы в новое состояние равновесия (или покоя), в котором все натриевые каналы перманентно открыты, если бы открытая конформация канала была стабильной. Однако клетки защищены от такого непрерывного электрического спазма, поскольку Na + -каналы находятся под контролем автоматического инактивирующего механизма. Они быстро закрываются после открытия, несмотря на деполяризацию мембраны. В таком инактивированном состоянии каналы не могут вновь открыться до тех пор, пока не пройдет несколько миллисекунд после падения мембранного потенциала до первоначального отрицательного значения. На рис. Рис. 6-58. Потенциал-зависимый Na + -канал может находиться в одном из трех по крайней мере состояний (конформаций). Внутренние силы, представленные здесь в виде взаимодействия зарядов, находящихся на различных сторонах канала, стабилизируют каждое состояние и защищают от влияния небольших возмущений. Однако взаимодействия с другими молекулами могут привести к переходу из одного состояния канала в другое. Состояние с наименьшей энергией определяется мембранным потенциалом, так как различные конформаций имеют различное распределение зарядов. В состоянии покоя (мембрана сильно поляризована) канал закрыт, но не инактивирован. Это наиболее стабильное состояние с наименьшей свободной энергией. При деполяризации мембраны более низкой энергией будет обладать открытая конформация и, следовательно, канал откроется. Но свободная энергия инактивированного состояния еще ниже и после некоторого случайного периода времени в открытом состоянии канал переходит в инактивированное состояние. Таким образом, открытая конформация соответствует метастабильному состоянию, существующему недолго. Черные стрелки показывают последовательность событий при деполяризации мембраны, а красная стрелка обозначает возврат в первоначальное состояние с наименьшей свободной энергией после реполяризации мембраны. 400 Рис. 6-59 . Индукция потенциала действия коротким электрическим импульсом (показан на верхнем графике). Импульс частично деполяризует мембрану (средний график). Сплошная линия на графике мембранного потенциала показывает возникновение потенциала действия при открывании и последующей инактивации потенциал-зависимых Na + -каналов. Мембранный потенциал автоматически возвращается к своему первоначальному значению — 70 мВ при закрытии Na + -каналов благодаря непрерывному вытеканию К + через К -каналы. Возникновение второго потенциала действия невозможно до тех пор, пока Na + -каналы (их состояния показаны внизу) не вернутся в закрытое, но не инактивированное состояние (см. рис. 6-58). До этого мембрана остается нечувствительной к раздражению. Прерывистая линия показывает релаксацию мембранного потенциала при слабых воздействиях, не приводящих к открыванию каналов. 6-58 схематически изображены эти три различных состояния потенциал-зависимого воротного Na + -канала - закрытое, но не инактивированное, открытое и инактивированное. Рис. 6-59 показывает, как этот канал работает при повышении и понижении потенциала действия. Рассмотренный выше процесс образования потенциала действия относится лишь к небольшому участку плазматической мембраны. Однако самоусиливающейся деполяризации этого участка достаточно для деполяризации соседних областей мембраны, которые вовлекаются при этом в тот же цикл генерации потенциала действия. Таким образом, потенциал действия распространяется от первоначального участка деполяризации по всей плазматической мембране. Более детальное рассмотрение функций и свойств потенциала действия приводится в гл. 19. В нейронах и мышечных клетках имеется несколько тысяч потенциал-зависимых Na + -каналов. Ток, протекающий через мембрану, - это сумма всех микротоков через каждый канал. Суммарный ток можно записать с помощью микроэлектрода (см. разд. 19.2.3). Однако существует возможность зарегистрировать и токи, протекающие через индивидуальные каналы. Это делают с помощью специальной техники, позволяющей выделить совсем небольшой участок мембраны, который содержит лишь несколько каналов, и записать затем протекающие через него токи. Такая методика (patch-clamp) дает более детальную картину работы этих каналов. 6-27 6.4.17. Регистрация токов, проходящих через изолированный участок мембраны, показывает, что индивидуальные Na + -каналы открываются по принципу «все или ничего» [34]. Разработка метода patch-clamp позволила существенно продвинуться в изучении ионных каналов. С помощью этого метода можно анализировать транспорт через единичную молекулу белкового канала, находящегося на маленьком участке мембраны (рис. 6-60), записывать сигналы 401 от ионных каналов любых типов клеток, включая и электрически невозбудимые. Многие из этих клеток, например дрожжевые, слишком малы, чтобы исследовать их традиционным методом электрофизиологов - введением внутриклеточных электродов. Регистрация сигналов методом patch-clamp показала, что индивидуальные Na + -каналы открываются по принципу «все или ничего». В открытом состоянии их проводимость не меняется, а времена открывания и закрывания случайны. Поэтому суммарный ток, протекающий через большую популяцию Na + -каналов мембраны целой клетки дает представление не о степени открытия индивидуального канала, а лишь о средней вероятности того, что он открыт (рис. 6-61). Явление потенциал-зависимого открывания и закрывания можно понять исходя из простых физических принципов. Внутри покоящейся нервной или мышечной клетки электрический потенциал на 50- 100 мВ ниже, чем снаружи. Такая разность потенциалов на двух сторонах мембраны может показаться незначительной, однако, учитывая, что толщина мембраны составляет всего лишь около 5 нм, градиент оказывается равным примерно 100 000 В/см. Следовательно, мембранные белки находятся в очень сильном электрическом поле. Естественно, мембранные белки, как и все другие, содержат на своей поверхности некоторое количество заряженных групп. Электрическое поле увеличивает силы, действующие на структуру молекулы. На многие мембранные белки изменения электрического поля через мембрану не оказывают значительного влияния. Ионные каналы, однако, приобрели в процессе эволюции тонкую сбалансированную чувствительность к электрическому полю: они могут принимать несколько альтернативных конформаций, стабильность которых зависит от величины электрического поля. Малые возмущения не отражаются на конформации каналов, но при достаточно сильных воздействиях, например случайных тепловых движениях окружающих молекул, может произойти и переход к другой конформации (см. рис. 6-58). Функции потенциал-зависимых Na + -каналов специфически блокируются двумя паралитическими ядами: тетродотоксином (ТТХ), получаемым из иглобрюхих рыб и сакситоксином, который выделяют из определенных видов морских динофлагеллят. Из-за высокой аффинности и специфичности эти токсины оказались незаменимыми для фармакологических исследований, подсчета числа Na + -каналов в мембране и для очистки этих каналов. Было показано, что в плазматической мембране клеток скелетных мышц находится лишь несколько сотен Na + -каналов на 1 мкм 2 , т.е. один канал на 10 000 молекул фосфолипидов. Несмотря на такую малую плотность каналов, эти мембраны электрически возбудимы, поскольку каждый канал обладает высокой проводимостью, пропуская более 8000 ионов за 1 миллисекунду. В 1984 году была определена нуклеотидная последовательность ДНК, детерминирующая образование потенциал-зависимого Na + -канала (у угря). Установлено, что она кодирует одну длинную полипептидную цепь (около 1800 аминокислотных остатков), содержащую четыре гомологичных трансмембранных домена (каждый из которых имел в своем составе шесть предполагаемых α-спиралей, пронизывающих мембрану). Эти спирали, по-видимому, взаимодействуют друг с другом, образуя стенки поры, заполненной водой. Совсем недавно был секвенирован ген, кодирующий потенциал-зависимый Са 2+ -канал. Оказалось, что это также длинный полипептид, первичная структура которого высоко гомологична обнаруженной для Na + -канала. Весьма вероятно, что потенциал-зависимые ионные каналы относятся к семейству эволюционно и структурно родственных белков. В каждом из этих каналов один из |