Молекулярная биология клетки. Том 1. Молекулярная биология клетки 2Molecular Bruce Alberts, Dennis Bray,Biology
 Скачать 25.6 Mb.
|
|
Заключение Биологические мембраны состоят из непрерывного двойного слоя липидных молекул с погруженными в него различными белками. Липидный бислой представляет собой жидкость, в которой отдельные молекулы липидов способны быстро диффундировать в пределах своего монослоя, но чрезвычайно редко спонтанно перемещаются из одного монослоя в другой. Мембранные липиды - амфипатические молекулы и в водной среде самопроизвольно образуют бислой. Эти бислой самоорганизуются в закрытые компартменты, которые способны самопроизвольно восстанавливаться при повреждениях. В плазматической мембране имеются три основных класса липидных молекул - фосфолипиды, холестерол и гликолипиды, причем составы внутреннего и наружного монослоев отличаются друг от друга. Разный липидный состав характерен как для плазматических мембран различных типов клеток, так и для разных мембран одной и той же эукариотической клетки. Функциональное значение различных компонентов разных мембран в большинстве случаев остается неизвестным. 360 6.2. Мембранные белки Хотя основные структурные особенности биологической мембраны определяются свойствами липидного бислоя, большинство их специфических функций осуществляется белками. Вот почему типы белков и их количества в мембране сильно варьируют: в миелиновой мембране, которая служит преимущественно для изоляции аксонов, Белки составляют менее 25% массы мембраны, а в мембранах, связанных с процессами превращения энергии (например, во внутренних мембранах митохондрий и хлоропластов) на их долю приходится около 75% массы мембраны. В обычной плазматической мембране количество белков равно приблизительно половине ее массы, т. е. значение этого показателя среднее между указанными выше крайними величинами. Поскольку размер липидной молекулы весьма мал по сравнению с размерами молекулы белка, можно сделать вывод, что в мембране всегда содержится значительно больше молекул липидов, чем белков. Например, если белки составляют 50% массы мембраны, то на одну молекулу белка приходится приблизительно 50 липидных молекул. 6-10 6-11 6.2.1. Полипептидная цепь многих мембранных белков пронизывает липидный бислой один или несколько раз [8] Многие мембранные белки пронизывают бислой насквозь (пример 1 и 2 на рис. 6-14). Подобно их липидным соседям эти, так называемые трансмембранные белки, обладают амфипатическими свойствами: у них есть гидрофобные участки, проходящие через мембрану и взаимодействующие с гидрофобными хвостами липидных молекул внутри бислоя, и гидрофильные участки, обращенные к воде с обеих сторон мембраны. Гидрофобность некоторых мембранных белков увеличивается за счет ковалентного присоединения цепи жирной кислоты, которая внедряется в бислой с его цитоплазматической стороны (примеры 1 и 2 на рис. 6-14). Некоторые внутриклеточные мембранные белки присоединены к бислою только с помощью цепи жирной кислоты (пример 3 на рис. 6-14), есть и такие поверхностные белки, которые ассоциированы с бислоем за счет ковалентных взаимодействий (через специфический олигосахарид) с фосфатидилинозитолом - минорным фосфолипидом, находящимся во внешнем липидном монослое плазматической мембраны (пример 4 на рис. 6-14). Рис. 6-14. Пять способов ассоциации мембранных белков с липидным бислоем. Трансмембранные белки пронизывают бислой в виде одиночной α- спирали (1) или нескольких α-спиралей (2). Некоторые из таких белков (1 и 2) имеют присоединенную ковалентно цепь жирной кислоты, погруженную в цитоплазматический монослой (1). Другие мембранные белки ассоциируют с бислоем только за счет ковалентно присоединенного к ним липида - либо цепи жирной кислоты, погруженной в цитоплазматический монослой (3), либо, гораздо реже, через фосфолипид фосфатидилинозитол, погруженный во внешний монослой и соединенный с белком через олигосахарид (4). Наконец, многие белки ассоциируют с мембраной только благодаря нековалентным взаимодействиям с другими мембранными белками (5). Детали обсуждаются в гл. 8. 361 Рис. 6-15. Сегмент цепи трансмембранного полипептида, пронизывающего липидный бислой в виде α-спирали (по данным рентгеноструктурного анализа кристаллов мембранного белка). Показана только скелетная модель полипептидной цепи. Гидрофобные аминокислоты выделены цветом. Торчащие неполярные боковые группы аминокислотных остатков (не показаны) взаимодействуют с гидрофобными цепями жирных кислот внутри липидного бислоя. Полярные пептидные группы образуют между собой водородные связи (не показаны) и, таким образом, экранируются от гидрофобного окружения бислоя. Представлен фрагмент полипептида из бактериального фотосинтезирующего реакционного центра, изображенного на рис. 6-32. (J. Deisenhofer et al., Nature 318, 618-624, 1985 и H. Michel et al., EMBO J., 5, 1149-1158, 1986.) Рис. 6-16. Типичный трансмембранный гликопротеин, пересекающий мембрану 1 раз. Обратите внимание, что полипептидная цепь пронизывает липидный бислой в виде правозакрученной α-спирали, и что олигосахаридные группы и дисульфидные связи в цитоплазматическом домене не образуются из-за восстановительных условий в цитозоле клетки. Некоторые белки, связанные с мембранами, вовсе не взаимодействуют с гидрофобной внутренностью липидного бислоя. Они соединены с той или другой стороной мембраны за счет нековалентных взаимодействий с другими мембранными белками (пример 5 на рис. 6-14). Многие из них высвобождаются из мембраны в сравнительно мягких условиях, например путем экстракции растворами с очень высокой или низкой ионной силой или растворами с крайними значениями рН, которые влияют на взаимодействия белок-белок, но оставляют интактным липидный бислой. Такие белки называют периферическими мембранными белками. Напротив, трансмембранные белки, белки, связанные с фосфатидилинозитолом, и некоторые белки, удерживаемые в бислое с помощью цепи жирной кислоты (так же как и другие, крепко связанные белки, которые могут быть высвобождены только после разрушения бислоя детергентами или органическими растворителями) называются интегральными мембранными белками. Та часть полипептидной цепи трансмембранных белков, которая погружена в гидрофобное окружение липидного бислоя, состоит в основном из аминокислотных остатков с неполярными боковыми группами. Однако, поскольку пептидные группы полярны, а молекулы воды недоступны, все пептидные группы в бислое стремятся образовать водородные связи между собой (см. рис. 3-26). Число водородных связей между пептидными группами оказывается максимальным, если участок полипептидной цепи, проходящей через бислой, образует регулярную α-спираль. Именно так большинство полипептидных цепей пересекает мембрану (рис. 6-15). В тех же случаях, когда через бислой проходит несколько участков полипептидной цепи, пептидные группы могут в принципе быть насыщены водородными связями, если эти участки организованы в виде Β - СЛОЕВ Однако чаще полипептидная цепь белков, пронизывающих мембрану несколько раз, образует серию α-спиралей, а не Β - СЛОЕВ (пример 2 на рис. 6-14). Строгое условие максимизации числа водородных связей в отсутствие молекул воды (запрет на дегидратацию) означает также, что полипептидная цепь, пронизывающая мембрану, вероятно, не меняет своего первоначального направления до полного пересечения мембраны, поскольку наличие изгиба в цепи привело бы к уменьшению числа регулярных водородных связей. Видимо, по этой причине до сих пор не обнаружено мембранных белков, погруженных в мембранный слой лишь частично. 362 Трансмембранные белки всегда имеют уникальную ориентацию в липидном бислое. Это отражает асимметричный характер их биосинтеза и встраивания в мембранный бислой эндоплазматического ретикулума, а также различные функции цитоплазматических и внеклеточных доменов этих белков. Основная масса трансмембранных белков гликозилирована. Как и в случае с гликолипидами, олигосахаридные цепи всегда присутствуют на внеклеточной стороне мембраны, поскольку сахарные остатки присоединяются в цистернах эндоплазматического ретикулума и аппарата Гольджи. Другая асимметрия заключена в белковых сульфгидрильных группах (SH), которые остаются восстановленными (цистеины) в цитоплазматических доменах, но часто используются для формирования внутри- или межцепных дисульфидных (S — S) связей во внеклеточных доменах (рис. 6-16). 6.2.2. Мембранные белки могут быть растворены и очищены в растворах детергентов [9] Как правило, трансмембранные белки (и некоторые другие, прочно связанные с мембраной) могут быть солюбилизированы только с помощью реагентов, разрушающих гидрофобные взаимодействия и, в конечном счете, бислой. Наиболее успешно это можно сделать, используя детергенты - небольшие амфипатические молекулы, стремящиеся образовать в воде мицеллы (рис. 6-17). При смешивании детергента с мембраной гидрофобные концы его молекул связываются с гидрофобными участками мембранных белков, вытесняя оттуда молекулы липидов. Поскольку противоположный конец молекулы детергента полярный, такое связывание приводит к тому, что мембранные белки переходят в раствор в виде комплексов с детергентом. Некоторые прочно связанные с белками молекулы липидов также остаются в этих комплексах (рис. 6-18). Полярные концы детергентов могут быть либо заряженными (ионными), как в додецилсулъфате натрия (ДСН), либо незаряженными (неионными), как в случае тритонов. Структуры этих двух используемых повсеместно детергентов изображены на рис. 6-19. Сильным ионным детергентом типа ДСН можно солюбилизировать даже самые гидрофобные белки мембран. Это позволяет анализировать такие белки методом электрофореза в полиакриламидном геле, содержащем ДСН. Разработка данной методики произвела настоящую революцию в изучении мембранных белков. Детергенты такого типа разворачивают (денатурируют) полипептидную цепь белка, внедряясь в его внутреннее «гидрофобное ядро» (см. рис. 3-22). Обычно при этом белки утрачивают активность и становятся непригодными для исследования их функции. Тем не менее белки могут быть легко очищены в денатурированной под действием ДСН форме. В некоторых случаях удаление детергента приводит к ренатурации и восстановлению функциональной активности. Менее гидрофобные мембранные белки можно солюбилизировать при низких концентрациях мягкого детергента. Это позволяет получить их если не в нативной, то по крайней мере в функционально активной форме. Если же детергент затем удалить в отсутствие фосфолипидов, то мембранные белки обычно агрегируют и выпадают в осадок (рис. 6-20). Однако если очищенные белки смешать с фосфолипидами до удаления детергента, то белки в активной форме обычно встроятся в липидный бислой, формируемый молекулами фосфолипидов (рис. 6-21). Таким образом можно реконструировать функционально активные системы мембранных белков из очищенных компонентов. Это один из возможных подходов к изучению их функциональной активности. Например, если удается показать, что очищенный белок перекачивает ионы через Рис. 6-17. Поперечный разрез мицеллы, образовавшейся в воде из молекул детергента. Молекулы детергента являются амфипатическими, поскольку имеют полярный и неполярный концы. Рис. 6-18. Солюбилизация мембранных белков с помощью детергента. Детергент разрушает липидный бислой, в результате чего белки оказываются в растворе в виде комплексов с молекулами липидов и детергента. Фосфолипиды мембран также солюбилизируются с помощью детергента. 363 Рис. 6-19. Структуры молекул двух широко распространенных детергентов: додецилсульфата натрия (ДСН, анионного детергента) и тритона Х-100 (неионного детергента). Заметьте, что участок в скобках повторяется семь раз. синтетический липидный бислой в отсутствие других белков, можно со всей определенностью сказать, что это ионный насос. Более того, контролируя в экспериментах условия реакции (доступность белков для АТР и ионов), можно выяснить детальный механизм действия этого белка (см. разд. 6.4.4). 6-12 6.2.3. Поверхность мембранных белков, обращенную к цитоплазме, можно изучать на примере «теней» эритроцитов [10] О плазматической мембране эритроцитов человека (рис. 6-22) известно гораздо больше, чем о любой другой мембране эукариотической клетки. Такая ситуация сложилась вследствие ряда причин. 1) Эритроциты можно получать в большом количестве (например, из банков крови). При этом они практически не загрязнены клетками других типов. 2) Поскольку эритроциты не имеют ядра и внутренних органелл, их плазматическая мембрана - это единственная мембрана данных клеток и ее можно выделить в чистом виде, без примеси внутренних мембран. Между тем при получении плазматической мембраны из клеток других типов, в которых она обычно составляет менее 5% от массы всех мембран (см. табл. 8-2), это представляет серьезную проблему. 3) Мембраны эритроцитов, или «тени» (пустые оболочки), легко получить, поместив клетки в гипотетический солевой раствор. Концентрация соли в таком растворе ниже, чем в клетке, поэтому вода устремляется внутрь эритроцитов, заставляя их разбухать и лопаться (лизис), высвобождая гемоглобин (главный немембранный белок). 4) Мембранные «тени» можно изучать как в поврежденном виде (в этом случае реагенты взаимодействуют с молекулами на обеих сторонах мембраны), так и после самопроизвольного восстановления их целостности, когда водорастворимые реагенты не могут проникать во внутреннее пространство. Кроме того, из теней эритроцитов можно получить замкнутые, вывернутые наизнанку пузырьки (рис. 6-23); это дает возможность изучать независимо друг от друга внешнюю и внутреннюю (цитоплазматическую) стороны мембраны. Использование теней эритроцитов с разрывами и без разрывов впервые позволило установить, что некоторые мембранные белки пронизывают липидный бислой (см. ниже), и что состав липидов на двух сторонах бислоя различен. Как и в большинстве основных принципов, первоначально установленных при изучении мембран эритроцитов, эти факты постепенно были подтверждены и при изучении мембран ядерных клеток. Характер расположения в мембране того или иного белка можно определить несколькими способами. Один из них основан на том, что меченные (флуоресцентными красителями или радиоактивными изотопами) водорастворимые реагенты не способны проникать через мембрану и поэтому ковалентно связываются со специфическими группами только на ее наружной стороне. После этого мембраны растворяют, белки разделяют методом электрофореза в полиакриламидном геле, а меченые белки идентифицируют либо по радиоактивности (радиоавтография гелей), либо по флуоресценции в ультрафиолетовом свете. Используя такое направленное мечение, можно определить, как конкретный белок (полоса в геле) ориентирован в мембране: если он метится одновременно и на внешней стороне (вместе с нативными клетками и тенями без разрывов), и на цитоплазматической стороне (вместе с замкнутыми вывернутыми наизнанку пузырьками), то это, несомненно, трансмембранный белок. Альтернативный подход состоит в обработке либо наружной, либо внутренней поверхности мембраны не проникающими через нее протеолитическими ферментами: если какой- 364 Рис. 6-20 . Схема, показывающая, что при удалении детергента из солюбилизированных с его помощью мембранных белков, почти не защищенные от контактов с водой гидрофобные участки на поверхности белков стремятся взаимодействовать друг с другом, в результате чего образуются большие агрегаты белков, осаждающиеся из раствора. Рис. 6-21. Солюбилизация, очистка и реконструкция функциональных молекул (Na + + К + )-АТРазы в фосфолипидных пузырьках (Na + + К + )-АТРаза - это анионный насос, присутствующий в плазматических мембранах большинства животных клеток. Он использует энергию гидролиза АТР для перекачки ионов Na + из клетки, а К + внутрь клетки. Реконструкция проводится в присутствии высоких концентраций Na + и АТР, так как АТРаза функционирует в качестве насоса только при достаточной концентрации этих веществ внутри пузырьков. Детергент удаляется продолжительным диализом или с помощью хроматографии. 365 Рис. 6-22 . Микрофотография эритроцитов человека, полученная с помощью сканирующего электронного микроскопа. Клетки имеют двояковогнутую форму и не содержат ядер. (С любезного разрешения Barnadette Chialley.) Рис. 6-23 . Получение теней эритроцитов с разрывами и без разрывов, а также замкнутых пузырьков с правильной ориентацией бислоя и вывернутых наизнанку. Показано, что эритроциты разрываются только в одном месте, давая тени с единственным отверстием. Маленькие пузырьки получаются при механическом разрушении теней. Ориентация мембран в пузырьках определяется ионными условиями во время процедуры разрушения. Рис. 6-24. Картина, полученная при электрофорезе белков, входящих в состав мембраны эритроцитов человека, в присутствии ДСН. Окрашивание проводилось кумасси синим (А). Положение в геле некоторых белков (Б); полоса, соответствующая гликофорину, выделена цветом для облегчения её идентификации вблизи полосы 3. Другие полосы в геле на рисунке опущены. Многочисленные углеводные остатки в гликофорине замедляют движение молекул этого белка настолько, что они движутся почти так же, как значительно более крупные молекулы полосы 3. (С любезного разрешения Ted Steck.) либо белок частично расщепляется в обоих случаях, то он должен быть трансмембранным. Кроме того, с помощью меченых антител можно определить, на какой стороне мембраны находится специфическая часть трансмембранного белка. При изучении белков плазматической мембраны эритроцитов человека методом электрофореза в ПААГ в присутствии ДСН удается идентифицировать около 15 главных белков с молекулярной массой от 15000 до 250000. Три из них - спектрин, гликофорин и так называемая полоса 3- составляют в сумме более 60% (по весу) всех мембранных белков (рис. 6-24). Все три белка связываются с мембраной по-разному. Поэтому мы рассмотрим данные белки в качестве примеров трех главных способов ассоциации белков с мембранами. |