Молекулярная биология клетки. Том 1. Молекулярная биология клетки 2Molecular Bruce Alberts, Dennis Bray,Biology
 Скачать 25.6 Mb.
|
|
310 Рис. 5-65. Гипотетический механизм общей рекомбинации, приводящий к конверсии генов. На 1-м этапе ДНК-полимераза начинает синтез дополнительной копии одной из цепей красной спирали, вытесняя прежнюю копию из спирали в виде одиночной цепи. Эта одиночная цепь спаривается с гомологичным участком черной спирали способом, который иллюстрирует рис. 5-60. На 2-м этапе короткий неспаренный участок черной цепи подвергается разрушению, чем и завершается перенос нуклеотидной последовательности из одной спирали в другую. Общий результат произошедших изменений выявляется обычно в следующем клеточном цикле, после того как репликация ДНК приведет к разделению двух «неподходящих» цепей (3-й этап). может быть исправлено репаративным аппаратом (см. разд. 5.2.7): он либо удаляет какие-то нуклеотиды из отцовской цепи и заменяет их нуклеотидами, комплементарными материнской цепи, либо выполняет противоположную операцию - репарирует материнскую цепь. Результатом этой репарации неправильного спаривания оказывается конверсия генов. Существуют и некоторые другие механизмы, способные осуществлять конверсию генов, но во всех случаях для этого требуется некое событие, имеющее отношение к общей генетической рекомбинации, которое сведет вместе две копии ДНК с очень близкой нуклеотидной последовательностью. Поскольку при этом образуется лишняя копия одной из двух последовательностей, должен иметь место также и синтез некоторого количества ДНК. Генетический анализ показывает, что конверсия генов происходит обычно лишь на небольшом отрезке ДНК, а во многих случаях изменяется вообще только часть одного какого-нибудь гена. При митозе также может происходить конверсия генов, хотя и несколько реже. Вероятно, как и в процессе мейоза, она возникает здесь вследствие репарации гетеродуплексов ДНК, содержащих неправильные пары. Рис. 5-65 иллюстрирует еще один гипотетический механизм конверсии генов, пригодный и для мейоза, и для митоза. 5-36 5.4.7. Ферменты сайт-специфической рекомбинации вводят в геном особые нуклеотидные последовательности ДНК и выводят их из геномов [41] Сайт-специфическая рекомбинация отличается от общей тем, что в этом случае особый рекомбинационный фермент узнает специфические нукле- 311 Рис. 5-66. Сайт-специфическая рекомбинация, посредством которой ДНК бактериофага λ внедряется в хромосому клетки-хозяина (Е. соli). Особые участки (сайты), которые узнает интеграза (серый круг), представляют собой определенные нуклеотидные последовательности ДНК. Здесь их символизируют красные прямоугольники (см. также рис. 5-74 и 9-19). отидные последовательности в одной или в двух рекомбинирующих молекулах ДНК. Спаривания оснований здесь не требуется (даже в тех системах, где оно все-таки происходит, в образовании гетеродуплекса участвует не более нескольких пар оснований). Эта форма рекомбинации дает возможность различным типам мобильных последовательностей ДНК перемещаться в пределах хромосом или переходить из одной хромосомы в другую. Сайт-специфическая рекомбинация впервые была описана для бактериофага лямбда. Именно с ее помощью происходит включение этого фага в хромосому Е. coli и его исключение из нее. В интегрированном состоянии бактериофаг лямбда реплицируется как составная часть ДНК клетки-хозяина (см. разд. 5.5.6). Когда фаговая частица проникает в клетку, в этой клетке синтезируется фермент лямбда-интеграза, кодируемый одним из фаговых генов. Этот фермент катализирует процесс рекомбинации, начинающийся с того, что многие копии интегразного белка прочно связываются с особыми нуклеотидными последовательностями на кольцевой хромосоме бактериофага. Возникший таким путем ДНК-белковый комплекс присоединяется теперь к другой специфической последовательности ДНК, на этот раз на хромосоме бактерии, тесно сближая таким образом хромосомы бактерии и бактериофага (рис. 5-66). Сведя их вместе, интеграза катализирует необходимые реакции разрыва и сшивания ДНК; при этом короткий участок, на котором нуклеотидные последовательности гомологичны, используется для образования в точке соприкосновения небольшого ступенчатого соединения (рис. 5-67, A). Интеграза обладает ДНК-топоизомеразной активностью, однако отдельные этапы рекомбинации следуют друг за другом столь быстро, что уловить какие-либо промежуточные формы ДНК, которые, по-видимому, все же образуются, не представляется возможным. Механизм сайт-специфической рекомбинации обеспечивает и исключение фага из бактериальной хромосомы, после чего начинается его быстрое размножение в бактериальной клетке. Реакция исключения катализируется комплексом, в состав которого входит помимо интегразы еще один белок бактериофага, который этот вирус начинает продуцировать лишь в том случае, если клетка-хозяин подвергается стрессу (см. рис. 9-20). Многие другие ферменты, катализирующие сайт-специфическую рекомбинацию, сходны с лямбда-интегразой в том отношении, что им также необходим короткий участок гомологии в двух отрезках ДНК, подлежащих соединению. Данное требование предполагает довольно высокую избирательность каждого из этих ферментов в отношении рекомбинируемых последовательностей ДНК. В другом классе ферментов, осуществляющих сайт-специфическую рекомбинацию, эта избирательность выражена не столь сильно. Подобно лямбда-интегразе, каждый из этих ферментов узнает специфическую последовательность ДНК в том мобильном генетическом элементе, рекомбинацию которого он катализирует. Отличает же эти ферменты от лямбда-интегразы то обстоятельство, что им не требуется специфической последовательности-мишени, а также то, что они не образуют ступенчатого (гетеродуплексного) соединения. Вместо этого под их воздействием в ДНК-мишени возникает ступенчатый (зигзагообразный) разрыв и появляются свободные концы цепей ДНК, которые затем ковалентно связываются со специфической последовательностью ДНК мобильного генетического элемента (рис. 5-67, Б). Благодаря этому весь мобильный элемент оказывается включенным в молекулу ДНК-мишени. По обе стороны от включившегося мобильного элемента в рекомбинантной молекуле ДНК остаются короткие одноцепочечные участки, 312 Рис. 5-67. Два механизма, используемых разными классами ферментов сайт-специфической рекомбинации. В обоих случаях специфичный фермент (показан серым) связывается с особой нуклеотидной последовательностью в хромосоме мобильного генетического элемента (отмечена штриховкой) и удерживает эту последовательность в тесном контакте с определенным участком хромосомы-мишени. А. Фермент делает ступенчатый разрез по обе стороны очень короткой гомологичной последовательности на обеих хромосомах (12 нуклеотидов в случае лямбда- интегразы), а затем соединяет цепи партнеров коротким ступенчатым соединением. Б. Фермент делает ступенчатый разрез в хромосоме-мишени и присоединяет выступающие ее концы к ровно срезанным концам мобильного элемента. В этом случае по обе стороны включившегося элемента появляются две короткие идентичные нуклеотидные последовательности - дупликации соответствующего участка ДНК-мишени (от 3 до 12 нуклеотидов, в зависимости от фермента). которые достраиваются ДНК-полимеразой, завершающей процесс рекомбинации. Как ясно из рис. 5-61, Б, при этом по обе стороны от включившегося элемента появляются две короткие идентичные нуклеотидные последовательности; по всей вероятности, ферменты сайт- специфической рекомбинации узнают именно эти примыкающие к мобильному элементу идентичные последовательности. Один из таких неизбирательно действующих ферментов был выделен 313 в активной форме из бактериофага Ми. Подобно ДНК-топоизомеразе он способен катализировать все реакции разрыва и воссоединения без какого бы то ни было источника энергии (например, АТР). Данный фермент принадлежит одному из бактериофагов, однако есть все основания полагать, что подобные ферменты имеются и у других организмов, таких, например, как бактерии, плодовая мушка или человек. Предположение это вытекает из того, что мобильные генетические элементы у всех этих организмов сходны. Заключение Механизмы генетической рекомбинации обеспечивают возможность перемещения из хромосомы в хромосому больших фрагментов ДНК. Выработавшиеся для этого в процессе эволюции последовательности реакций таковы, что две спирали ДНК, разрываясь и воссоединяясь вновь, претерпевают минимальное повреждение, так что легко происходит восстановление двух целых хромосом. Существует два класса рекомбинационных событий. При общей рекомбинации начальные реакции зависят от комплементарных взаимодействий, происходящих на обширных участках между цепями двух двойных спиралей ДНК, вовлекаемых в рекомбинацию. Общая рекомбинация может поэтому происходить лишь между двумя гомологичными молекулами ДНК; и, хотя хромосомы при этом обмениваются генами, общая последовательность расположения генов в хромосоме не нарушается. При сайт-специфической рекомбинации реакции спаривания зависят от узнавания - при посредстве специального белка - двух нуклеотидных последовательностей, которым предстоит рекомбинировать; сколько-нибудь заметной гомологии при этом не требуется. Сайт-специфическая рекомбинация обычно изменяет относительное расположение нуклеотидных последовательностей в хромосомах. 5.5. Вирусы, плазмиды и транспозоны [42] Знакомясь с основными генетическими механизмами, мы до сих пор сосредоточивали свое внимание на селективных преимуществах, которые они обеспечивают клетке. Мы убедились в том, что клетке для выживания совершенно необходимо сохранение генетической информации путем репарации ее ДНК, а для размножения клеток столь же необходимо быстрое и точное ее воспроизведение. Выживание вида в целом связано, как известно, с появлением новых, более приспособленных генетических вариантов, а оно в значительной мере облегчается перегруппировкой генов и случайным перераспределением последовательностей ДНК в результате генетической рекомбинации. Теперь нам предстоит познакомиться с группой генетических элементов, которые ведут себя как паразиты, т.е. используют генетические механизмы клетки для своих собственных нужд. При некоторых условиях определенные нуклеотидные последовательности ДНК могут воспроизводиться независимо от остального генома. По степени независимости от клетки-хозяина эти последовательности весьма существенно различаются. Наиболее независимы хромосомы вирусов, потому что у вирусов есть белковые оболочки, благодаря которым они могут свободно переходить из клетки в клетку. В той или иной степени близки к вирусам (хотя и более зависимы от клетки) нуклеотидные последовательности, называемые плазмидами и транспозонами; у них нет белковой оболочки, и потому они могут реплицироваться только в одной-единственной клетке или в ее потомстве. Еще более примитивны некоторые последовательности ДНК, которые можно 314 Рис. 5-68. Электронные микрофотографии вирусных частиц (метод негативного контрастирования). Все вирусы сфотографированы при одном и том же увеличении, масштаб указан на фото Б. А. Бактериофаг Т4 -крупный ДНК-содержащий вирус, заражающий бактерию Е. соli . ДНК находится в головке бактериофага и впрыскивается в бактериальную клетку при помощи его цилиндрического хвоста. (С любезного разрешения James Paulson.) Б. Вирус X картофеля. Нитевидные частицы этого вируса растений содержат РНК-геном. (С любезного разрешения Graham Hills.) В. Аденовирус - ДНК-содержащий вирус, заражающий различные клетки человека. Снаружи вирусные частицы окружены белковой оболочкой - капсидом. (С любезного разрешения Mei Lie Wong.) Г. Вирус гриппа крупный РНК-содержащий вирус животных. Помимо белкового капсида у него имеется еще мембранная оболочка липидный бислой с выступающими из него включениями вирусного гликопротеина. (С любезного разрешения R. С. Williams, H. W. Fisher.) предположительно рассматривать как мобильные генетические элементы на том основании, что в хромосомах клеток они встречаются во многих копиях, однако эти последовательности перемещаются или размножаются столь редко, что трудно решить, представляют ли они собой вообще отдельные генетические элементы. Все такие псевдонезависимые элементы могут размножаться, лишь всемерно используя метаболизм клетки-хозяина, поэтому они служат удобным инструментом для исследования нормальных клеточных механизмов. Мы начнем свое обсуждение с вирусов, так как из всех мобильных генетических элементов они изучены наиболее полно. Затем мы рассмотрим свойства плазмид и транспозонов, которые иногда удивительно сходны с вирусами и, быть может, являются их предками. 5-39 5.5.1. Вирусы - это мобильные генетические элементы [43] Вирусы впервые были описаны как болезнетворные агенты, которые размножаются только в клетках и имеют настолько малые размеры, что способны проходить через ультратонкие фильтры, задерживающие самые мелкие бактерии. До появления электронного микроскопа природа их оставалась неясной, хотя уже тогда высказывалось мнение, что это, возможно, просто гены, которые приобрели способность переходить из одной клетки в другую. В 1930-х годах использование ультрацентрифуги сделало возможным отделение вирусов от компонентов клетки-хозяина. В результате уже в начале 1940-х годов стало более или менее ясно, что все вирусы содержат нуклеиновые кислоты. Это укрепило исследователей в мысли, что вирусы и генетический материал выполняют сходные функции. Подтверждение такой точки зрения было получено при изучении вирусов бактерий (бактериофагов). В 1952 г. удалось показать, что в клетку бактерии-хозяина проникает одна только ДНК бактериофага (без его белка) и что именно она инициирует здесь процесс репликации, приводящий в конечном счете к появлению в инфицированной клетке нескольких сотен дочерних вирусных частиц. Таким образом, вирусы можно рассматривать как генетические элементы, одетые в защитную оболочку и способные переходить из одной клетки в другую. Размножение вирусов само по себе часто оказывается летальным для клетки, в которой оно происходит. Многие вирусы разрушают инфицированную клетку (вызывают ее лизис), что и дает возможность потомству вируса переходить в соседние клетки. Клинические симптомы вирусной инфекции во многих случаях отражают именно эту цитолитическую способность вируса. Высыпание при 315 инфекции вирусом герпеса или оспенная сыпь отражают, например, гибель эпителиальных клеток на отдельных пораженных участках кожи. Строение оболочки вируса, тип его нуклеиновой кислоты, способ проникновения в клетку и механизм размножения в клетке - все эти свойства у разных вирусов сильно варьируют. Электронные микрофотографии на рис. 5-68 дают представление о некоторых структурных различиях между вирусами. 5.5.2. Вирус заключен в белковый капсид или в мембранную оболочку [44] Первоначально предполагалось, что наружная оболочка вирусов построена из белковых молекул какого-нибудь одного типа. Считалось, что вирусные инфекции начинаются с разъединения внутри клетки-хозяина хромосомы (т. е. нуклеиновой кислоты) вирусa и его белковой оболочки. Далее следует самовоспроизведение хромосомы с образованием большого числа ее копий и синтез вирусоспецифичных белков оболочки. Затем происходит образование дочерних вирусных частиц в результате спонтанной сборки белковой оболочки вокруг дочерних вирусных хромосом (рис. 5-69). Теперь мы отдаем себе отчет в том, что эти первые описания, хотя и верные в общем виде, давали упрощенное представление о чрезвычайно разнообразных жизненных циклах вирусов. Во-первых, белковая оболочка (или капсид) почти у всех вирусов состоит из полипептидных цепей более чем одного типа, причем эти цепи нередко сгруппированы в несколько слоев. Во-вторых, у многих вирусов их белковый капсид окружен еще и мембраной, в которую помимо белка входят и липиды. У многих из этих вирусов сборка наружной оболочки происходит в плазматической мембране клетки-хозяина, и дочерние вирусные частицы выходят наружу, отпочковываясь от этой плазматической мембраны (рис. 5-70). Отпочковывание позволяет потомству вируса покидать клетку, не нарушая ее плазматической мембраны, т. е. не убивая клетку. Липидные компоненты мембраны вируса идентичны липидам плазматической мембраны клетки-хозяина, тогда как белки, присутствующие в липидном бислое, вирусоспецифичны. Сборку вирусной мембраны в плазматической мембране клетки-хозяина мы обсудим в гл. 8, что же касается сборки белкового капсида вируса, то ее иллюстрирует рис. 3-43. 5-45 5.5.3. Геномы вирусов представлены разнообразными формами, а генетическим материалом у них может быть как ДНК, так и РНК [45] Когда удалось расшифровать структуру ДНК, естественно было сделать вывод, что вся генетическая информация хранится именно в этой двухспиральной форме, поскольку ее преимущества в поддержании стабильности ДНК и в смысле возможности репарации казались совершенно неоспоримыми. Случайное повреждение одной из полинуклеотидных цепей, действительно, всегда может быть исправлено при помощи комплементарной цепи. Однако это преимущество представляется несущественным, когда речь идет о крошечных вирусных хромосомах, насчитывающих всего несколько тысяч нуклеотидов, - вероятность их случайного повреждения очень невелика в сравнении с риском, которому подвергается клеточный геном, содержащий миллионы нуклеотидов. По этой причине генетическая информация вирусов может храниться в разнообразных и необычных формах, в частности в форме РНК. Роль Рис. 5-69. Простейший жизненный цикл вируса. Представленный здесь гипотетический вирус содержит небольшую двухцепочечную молекулу ДНК, кодирующую единственный вирусный белок, из которого построен капсид вируса. Вирусов с таким простым строением мы не знаем. Рис. 5-70. Электронная микрофотография тонкого среза животной клетки, от которой отпочковывается несколько частиц вируса, заключенного в мембранную оболочку (вирус леса Семлики). Геном этого вируса представлен одноцепочечной РНК. (С любезного разрешения М. Olsen, G. Griffiths.) |