Молекулярная биология клетки. Том 1. Молекулярная биология клетки 2Molecular Bruce Alberts, Dennis Bray,Biology
 Скачать 25.6 Mb.
|
|
5.6.3. Два типа библиотек ДНК используются для разных целей [57] Описанное выше в качестве одного из этапов клонирования разрезание генома на фрагменты с помощью рестрицирующей нуклеазы называют иногда «методом дробовика» (шотган-клонирование). Фрагменты ДНК образуются при этом в огромном количестве - до миллиона, если речь идет о геноме млекопитающих, а это значит, что и число различных колоний трансфицированных клеток также должно достигать миллионов. Каждая такая колония представляет собой клон, т. е. совокупность потомков одной клетки-родоначальницы, и рекомбинантная плазмида в любой клетке клона несет одну и ту же включенную в нее нуклеотидную последовательность геномной ДНК. Плазмиды одной колонии содержат клон геномной ДНК, а вся совокупность плазмид вмещает библиотеку геномной ДНК. Однако, поскольку разрезание геномной ДНК на фрагменты определяется случаем, лишь некоторые образовавшиеся фрагменты содержат полноценные гены; во многие из них попадает только часть какого- нибудь гена, а в большинстве клонов геномной ДНК, полученных из ДНК высших эукариотических клеток, 329 Рис. 5-80. Синтез кДНК. Обратная транскриптаза синтезирует ДНК-копию (кДНК) молекулы мРНК, образуя таким путем гибридную спираль ДНК/РНК. Под действием щелочи РНК-цепь этой гибридной спирали распадается на отдельные нуклеотиды, после чего оставшаяся одноцепочечная кДНК копируется ДНК-полимеразой с образованием двухцепочечной кДНК. Как видно из схемы, для начала синтеза обоим ферментам необходима затравка. Для обратной транскриптазы затравкой служит небольшой олигонуклеотид, в данном случае к длинной последовательности polyA, имеющейся на 3'-конце почти всех мРНК, присоединяется oligo(dT). Отметим, что у образовавшейся здесь двухцепочечной молекулы кДНК отсутствуют липкие концы; такие молекулы ДНК, с «тупыми» концами, можно клонировать при помощи нескольких процедур, сходных с той, какая представлена на рис. 5-78, хотя и менее эффективно. Можно, например, пришить к концам кДНК синтетические олигонуклеотиды, содержащие участки, в которых рестрицирующий фермент вызывает разрыв, или присоединить ферментативным путем к концам молекулы кДНК одноцепочечные «хвосты», чтобы облегчить включение этой молекулы в клонирующий вектор присутствует лишь некодирующая ДНК, составляющая, как известно, большую часть массы такого генома (см. разд. 9.1.3). Альтернативный метод начинает процесс клонирования с отбора тех последовательностей ДНК, которые транскрибируются в РНК и, значит, предположительно соответствуют генам. Осуществляется это путем извлечения из клеток мРНК (или очищенной субфракции мРНК) и затем получения комплементарной ДНК-копии (кДНК) каждой наличной молекулы мРНК; эта реакция катализируется обратной транскриптазой- ферментом ретровирусов, синтезирующим цепь ДНК на РНК-матрице (см. разд. 5.5.8). Одноцепочечные молекулы ДНК, синтезированные обратной транскриптазой, превращаются в двухцепочечные молекулы ДНК под действием ДНК-полимеразы, а эти двухцепочечные молекулы включаются в плазмиды и образуют клоны (рис. 5-80). Каждый полученный таким путем клон называется клоном кДНК, а вся совокупность клонов, происходящих от одного препарата мРНК, составляет библиотеку кДНК. Как видно из рис. 5-81, клоны геномной ДНК и клоны кДНК существенным образом различаются. Геномные клоны представляют собой случайную выборку из всех нуклеотидных последовательностей ДНК данного организма. Состав геномной библиотеки не зависит от того, какой тип клеток был выбран для ее получения. В отличие от этого клоны кДНК содержат лишь те участки генома, которые транскрибируются в мРНК, а так как в клетках разных тканей наборы синтезируемых молекул мРНК различны, то и библиотеки кДНК различны для разных типов клеток, используемых при их конструировании. 330 Рис. 5-81. Схема, иллюстрирующая различия между клонами кДНК и клонами геномной ДНК. В этом примере ген А транскрибируется редко, а ген В - часто. Оба типа РНК-транскриптов подвергаются процессингу путем сплайсинга, в результате чего при образовании мРНК удаляется единственный представленный здесь интрон. Большинство генов содержит много интронов (см. табл. 9-1). Клонирование генов на основе библиотек кДНК имеет ряд преимуществ. Первое из них связано с тем, что многие белки вырабатываются специализированными клетками в очень больших количествах, а значит, в избытке синтезируется и мРНК, кодирующая подобный белок. Библиотека кДНК для таких клеток, естественно, обогащена молекулами кДНК, кодирующей данный белок (рис. 5-81). Это обилие именно нужных молекул кДНК сильно облегчает задачу распознавания требуемого клона в библиотеке. Гемоглобин, например, синтезируется в больших количествах в развивающихся эритроцитах, и как раз по этой причине в числе первых подвергнутых клонированию генов были гены глобина. Другое преимущество клонов кДНК заключается в том, что в них кодирующая нуклеотидная последовательность гена ничем не прерывается. Эукариотические гены, как известно, состоят из кодирующих последовательностей ДНК, разделенных некодирующими, так что синтез мРНК на таких генах должен сопровождаться удалением из исходного РНК-транскрипта некодирующих (интронных) участков и сплайсингом (сращиванием) остающихся фрагментов, т. е. кодирующих последовательностей. Ни бактериальные, ни дрожжевые клетки не способны осуществить такую модификацию РНК, образовавшейся путем транскрипции гена высшей эукариотической клетки. Поэтому, если цель клонирования состоит в определении аминокислотной последовательности белка по данной ДНК или в получении больших количеств белка путем экспрессии клонированного гена в бактериальной или дрожжевой клетке, то начинать предпочтительнее именно с кДНК. Библиотеки геномной ДНК и к ДНК - неисчерпаемый источник для соответствующих работ и исследователи часто пользуются ими сообща; неуклонно растет также и число таких библиотек, поставляемых специализированными фирмами. Рис. 5-82. Применение субтрактивной гибридизации для очистки тех редких клонов кДНК, которые соответствуют молекулам мРНК, имеющимся в Т-лимфоцитах, но отсутствующих в В-лимфоцитах. Поскольку два этих типа клеток очень сходны, большая часть мРНК должна быть свойственна как тому, так и другому типу. Данная процедура, таким образом, представляет собой очень эффективный способ обогащения теми специализированными молекулами, по которым два этих типа клеток отличаются друг от друга. → 331 10-5 5.6.4. Библиотеки кДНК могут быть получены из отобранных популяций молекул мРНК [58] Если кДНК получают из клеток, в которых уровень экспрессии интересующего нас гена очень высок, то большинство клонов кДНК содержит нуклеотидную последовательность этого гена, и, значит, отбор его не представляет трудностей. Для генов, транскрибируемых не столь интенсивно, необходимы какие-то приемы, которые позволили бы обогатить имеющуюся смесь молекул мРНК нужным ее видом и лишь после этого приступать к получению библиотеки кДНК. Если, например, в нашем распоряжении имеются антитела к данному белку, то ими можно воспользоваться для избирательного осаждения тех изолированных полирибосом, которые содержат его растущие полипептидные цепи. В этих рибосомах будет находиться также и мРНК, кодирующая данный белок, вследствие чего преципитат может быть обогащен интересующей нас мРНК иногда в 1000 раз. Субтрактивная гибридизация представляет собой еще один высокоэффективный метод для обогащения смеси молекул определенными нуклеотидными последовательностями перед клонированием кДНК. Эту процедуру отбора можно использовать, например, в том случае, если имеются два типа клеток от одного и того же вида организма, очень близких, но отличающихся тем, что лишь один из них продуцирует интересующий нас белок (или белки). Впервые этот метод был применен для идентификации рецепторных белков, имеющихся на поверхности у Т- лимфоцитов, но отсутствующих у В-лимфоцитов. Его можно использовать и в том случае, если у клетки, вырабатывающей определенный белок, имеется мутантный двойник, лишенный такой способности. На первом этапе требуется осуществить синтез кДНК, используя для этого мРНК из того типа клеток, который вырабатывает нужный белок. Затем проводят гибридизацию этих кДНК с молекулами мРНК из клеток второго типа, добавленными в большом избытке. При этом небольшая часть нуклеотидных последовательностей кДНК не находит себе партнера, т.е. комплементарной последовательности мРНК. Очевидно, что именно эти немногие последовательности кДНК соответствуют последовательностям мРНК, имеющимся только у клеток первого типа. Их можно подвергнуть очистке, воспользовавшись для этого простой биохимической процедурой, дающей возможность отделить одноцепочечные нуклеиновые кислоты от двухцепочечных (рис. 5-82). Библиотеки кДНК, полученные путем субтрактивной гибридизации, удобны не только для клонирования тех генов, продукты которых приурочены к определенному типу дифференцированных клеток; они позволяют также определять различия в экспрессии генов между любыми двумя близкими типами клеток. 5-52 5.6.5. Для выявления нужных клонов в генной библиотеке можно использовать гибридизацию с радиоактивным ДНК-зондом [59] При клонировании генов самой трудной задачей является распознавание в библиотеке тех редких колоний, которые содержат интересующий нас фрагмент ДНК. Это особенно справедливо в отношении геномной библиотеки, так как здесь, для того чтобы выделить нужный ген млекопитающего, приходится среди миллиона клеток разыскивать какую-нибудь одну. Чаще всего для этой цели пользуются особой формой гибридизации in situ, основанной на высокой специфичности 332 Рис. 5-83 . Эффективный метод, широко применяемый для выявления бактериальной колонии, содержащей определенный клон ДНК (см. также рис. 5-79). Каждая бактериальная клетка, несущая рекомбинантную плазмиду, дает начало колонии из идентичных клеток, которая на питательном агаре выглядит как белое пятнышко. Прижимая к поверхности чашки кружок из фильтровальной бумаги, получают реплику бактериальной культуры. Эту реплику обрабатывают щелочью, чтобы разрушить прилипшие к бумаге клетки и денатурировать плазмидную ДНК, а затем проводят гибридизацию с высокорадиоактивным ДНК-зондом. Колонии бактерий, связавшие ДНК-зонд, выявляют методом радиоавтографии. комплементарных взаимодействий между двумя комплементарными молекулами нуклеиновых кислот. Растущие на чашках колонии бактерий промакивают куском фильтровальной бумаги. При этом часть клеток от каждой колонии прилипает к бумаге. Это прилипшие колонии - их называют репликами - обрабатывают щелочью, а затем инкубируют с радиоактивным ДНК-зондом, содержащим часть нуклеотидной последовательности искомого гена (рис. 5-83). При необходимости такому Рис. 5-84. Выбор участков с известной аминокислотной последовательностью для приготовления синтетических олигонуклеотидных зондов. В действительности кодирует данный белок только одна какая-то нуклеотидная последовательность. Однако вследствие вырожденности генетического кода несколько разных нуклеотидных последовательностей могут дать одну и ту же аминокислотную последовательность, так что нельзя заранее сказать, какая из них окажется правильной. Желательно, чтобы в смеси олигонуклеотидов, используемых в качестве зонда, правильная нуклеотидная последовательность составляла наибольшую фракцию, поэтому выбирают участки, для которых число возможностей минимально, как это видно на рисунке. После того как смесь олигонуклеотидов будет синтезирована химическим путем, 5'-конец каждого олигонуклеотида метят радиоактивной меткой (см. рис. 4-65, Б). 333 скринингу можно подвергнуть миллионы бактериальных клонов, для того чтобы выявить тот клон, который способен к гибридизации с данным зондом. Способ получения специфического ДНК-зонда зависит от той информации, которой мы располагаем в отношении клонируемого гена. Во многих случаях интересующий нас белок можно идентифицировать химическими методами и выделить хотя бы в малых количествах в очищенном виде. Нескольких микрограмм чистого белка достаточно для того, чтобы определить последовательность первых трех десятков аминокислот в его молекуле. Из этой аминокислотной последовательности на основе генетического кода можно вывести соответствующую нуклеотидную последовательность. Получив эти данные, синтезируют химическим путем два набора олигонуклеотидов ДНК, каждый длиной приблизительно 20 нуклеотидов, и вводят в них радиоактивную метку. Два набора используют в расчете обеспечить соответствие двум разным участкам предсказанной нуклеотидной последовательности клонируемого гена (рис. 5-84). Колонии клеток, обнаружившие способность к гибридизации с обоими наборами ДНК-зондов, скорее всего содержат требуемый ген; поэтому именно их сохраняют для дальнейшего исследования (см. ниже). 5.6.6. Выделение перекрывающихся клонов ДНК («прогулка по хромосоме») позволяет идентифицировать ген, находящийся по соседству с тем, который уже клонирован [60] Многие гены из числа тех, что представляют наибольший интерес (например гены, регулирующие развитие), известны нам только из генетического анализа мутантов у таких организмов, как плодовая мушка Drosophila или нематода С. elegans. Белковые продукты этих генов не выделены; возможно, что они присутствуют лишь на какой-то определенной стадии развития. Тем не менее, изучая генетическое сцепление различных мутаций, можно составлять хромосомные карты, дающие представление об относительном расположении этих генов. Если один из картированных таким образом генов удалось клонировать, то клоны в библиотеке геномной ДНК, соответствующие соседним генам, можно идентифицировать при помощи методики, известной как «прогулка по хромосоме». Для этого используют две разные библиотеки геномной ДНК, полученные из одной и той же ДНК путем разделения ее на фрагменты двумя разными рестрицирующими нуклеазами. Рис. 5-85 показывает, как клон одной из библиотек может служить ДНК-зондом для выявления перекрывающегося клона другой библиотеки. Из этого нового клона получают затем ДНК-зонд, используемый для нахождения другого перекрывающегося клона в первой библиотеке, и т.д. Таким путем, отыскивая клон за клоном, можно продвигаться по хромосоме всякий раз на расстояние порядка 30000 пар нуклеотидов и более. Как узнать, однако, когда мы, наконец, дойдем до интересующего нас гена (идентифицированного изначально по какой-нибудь вредной мутации)? Обычный прием состоит в том, чтобы непрерывно сравнивать размеры рестрикционных фрагментов ДНК мутантных и нормальных хромосом посредством блот-анализа по Саузерну, используя в процессе «прогулки» в качестве зонда каждый новый клон. Некоторые из мутантов возникают вследствие небольших делеций или, наоборот, вставок последовательностей ДНК в соответствующем гене, и определить такие нарушения, как правило, бывает нетрудно. Известно, например, что среди вредных мутаций, затрагивающих типичный ген человека, примерно одна из десяти представляет собой делецию, легко обнаруживаемую блот-ана- 334 Рис. 5-85. Использование перекрывающихся фрагментов для картирования интересующего нас гена путем «прогулки по хромосоме». Для того чтобы сократить время «прогулки», наиболее пригодны геномные библиотеки, содержащие очень крупные клонированные молекулы ДНК. Зондом для каждого следующего клона служит короткий 32 Р-фрагмент ДНК одного из концов предыдущего идентифицированного клона. Если, например, используется «правый» конец, то и перемещение происходит «вправо», как в случае, представленном на этом рисунке. Короткий концевой фрагмент удобен в качестве зонда еще и потому, что это снижает вероятность присутствия в зонде повторяющейся последовательности ДНК, которая могла бы гибридизоваться со многими клонами из разных частей генома и тем самым прервать «прогулку». лизом по Саузерну. Число выявленных таким путем молекулярных дефектов, ответственных за наследственные болезни человека, в последнее время непрерывно растет. С помощью сходных методов можно расположить в правильном порядке (картировать) в хромосомах С. elegans почти весь набор крупных геномных клонов. Такие крупные клоны, каждый примерно по 30000 п.н., вводят в специальные векторы, приготовленные на основе фага λ, так называемые космиды, пригодные для включения больших вставок ДНК. Нескольких тысяч космидных клонов достаточно для того, чтобы охватить весь геном такого организма, как С. elegans или Drosophila, а чтобы картировать таким способом геном человека, необходимо более 100000 космидных клонов. Эта процедура заняла бы, конечно, очень много времени, но технически она выполнима. Кроме того, фрагменты ДНК человека, в 10 раз более крупные, чем космидные клоны (300000 п. н.), можно клонировать, как искусственные хромосомы в дрожжевых клетках; в принципе геном человека можно было бы картировать с помощью 10000 клонов такого типа (см. рис. 9-5). 335 Рис. 5-86. Методика гибридизационной селекции. Молекулы очищенной мРНК элюируются с фильтра в условиях, вызывающих разделение РНК- ДНК-спирали на одиночные цепи. В недалеком будущем исследователи, несомненно, получат возможность приобретать систематизированные наборы геномных клонов в специальных центрах, располагающих библиотеками ДНК. Там можно будет получить полную библиотеку для всякого обычного объекта исследования с указанием в каталогах для каждой вставки ДНК как хромосомы, из которой она взята, так и ее порядкового номера относительно всех других фрагментов ДНК, происходящих из той же хромосомы. Тогда начать «прогулку по хромосоме» можно будет просто, получив из библиотеки все клоны, охватывающие тот ее участок, в котором содержится интересующий исследователя мутантный ген. Эти клоны послужат затем для приготовления ДНК-зондов, которые позволят точно локализовать измененный ген. В конце концов таким путем удастся выделить многие из мутантных генов, обусловливающих наследственные заболевания у человека. |