Молекулярная биология клетки. Том 1. Молекулярная биология клетки 2Molecular Bruce Alberts, Dennis Bray,Biology
 Скачать 25.6 Mb.
|
|
316 Рис. 5-71. Схематическое изображение (масштабы не соблюдены) различных типов вирусных геномов. У самых мелких вирусов геном состоит всего из нескольких генов и генетическим материалом может быть у них как ДНК, так и РНК; у наиболее крупных вирусов геном всегда представлен двухцепочечной ДНК, включающей сотни генов. Такие особенности хромосом, как кольцевая форма молекул ДНК или особое строение концов цепей у линейных молекул, позволяют вирусам избежать трудностей, связанных с репликацией нескольких последних нуклеотидов на конце цепи ДНК. хромосомы вируса может играть одноцепочечная РНК (вирус табачной мозаики), двухцепочечная спираль РНК (реовирус), кольцевая одноцепочечная ДНК (бактериофаги М13 и ФХІ74) или линейная одноцепочечная ДНК (парвовирусы). Правда, первыми среди хромосом вирусов были изучены простые линейные двойные спирали ДНК, но потом выяснилось, что столь же часто встречаются кольцевые двойные спирали или более сложные формы линейных двойных спиралей ДНК. Есть вирусы, у которых к 5'-концам цепей ДНК ковалентно присоединен белок, а у очень крупных вирусов оспы две комплементарные цепи ДНК на одних концах соединены фосфодиэфирными связями (рис. 5-71). Для каждого типа вирусного генома характерна своя особая энзимология репликации, а потому он должен нести в себе информацию не только о белках, образующих оболочку вируса, но также и об одном или нескольких ферментах, необходимых для репликации вирусной нуклеиновой кислоты. 5-40 5.5.4. Хромосома вируса содержит информацию для синтеза ферментов, участвующих в репликации вирусной нуклеиновой кислоты [46] Количество информации, которую вирус привносит в инфицируемую клетку, чтобы обеспечить себе воспроизведение, различается у разных вирусов весьма заметно. Так, в ДНК сравнительно крупного бактериофага Т4 закодировано не менее 30 различных ферментов, обеспечивающих избирательную и быструю репликацию хромосомы бактериофага Т4 в ущерб репликации ДНК клетки-хозяина, т. е. Е. coli (рис. 5- 72). Эти белки участвуют в непрерывных циклах репликации Т4-ДНК и осуществляют избирательное включение 5-гидроксиметилцитозина, который в Т4-ДНК замещает цитозин. В геноме бактериофага Т4 закодированы также и нуклеазы, избирательно разрушающие ДНК Е. coli (геном самого бактериофага из-за необычного состава оснований не подвержен действию этих нуклеаз). Кроме того, в нем закодированы белки. изменяющие молекулы бактериальной РНК-полимеразы таким образом, что они на разных стадиях инфекции транскрибируют различные группы генов бактериофага. Более мелкие ДНК-содержащие вирусы, например обезьяний вирус SV40 или мельчайший бактериофаг ФХІ74, несут в себе гораздо меньше генетической информации и гораздо больше зависят от ферментов клетки-хозяина как в синтезе своих белков, так и в синтезе своей ДНК. Они подчиняют себе и используют для своих нужд клеточные ферменты, участвующие в репликации ДНК, в том числе и ДНК-полимеразу. 317 Однако даже в геноме самых мелких ДНК-вирусов закодированы ферменты, избирательно инициирующие синтез их собственной ДНК, для чего они узнают на хромосоме вируса особую нуклеотидную последовательность - точку начала репликации. Это существенно, потому что вирус может успешно размножаться лишь при том условии, если ему удастся игнорировать регуляторные сигналы клетки, которые в противном случае не дадут вирусной ДНК удваиваться более чем один раз в каждом клеточном цикле. Мы до сих пор не знаем, как эукариотические клетки регулируют синтез своей ДНК, и можно надеяться, что знакомство с механизмами, при помощи которых вирусы избавляются от этой регуляции (а их изучать, разумеется, гораздо легче), даст нам ключ к пониманию регуляторных механизмов клетки-хозяина. К репликации РНК-вирусов предъявляются особые требования, поскольку для воспроизведения своего генома они должны копировать молекулы РНК, что означает полимеризацию нуклеозидтрифосфатов на РНК-матрице. Клетки, как правило, не располагают ферментами для осуществления этой реакции, поэтому даже в мельчайших вирусах должны быть закодированы их собственные РНК-зависимые полимеразы нуклеиновых кислот. Рассмотрим теперь более подробно механизмы репликации разных типов вирусов. 5-42 5.5.5. РНК-вирусы и ДНК-вирусы реплицируются путем образования комплементарных цепей [47] Репликация геномов РНК-вирусов точно так же, как и репликация ДНК, связана с образованием комплементарных полинуклеотидных цепей. У большинства РНК-вирусов этот процесс катализируют РНК-зависимые РНК-полимеразы (репликазы), кодируемые РНК-хромосомой вируса. Эти ферменты часто включаются в дочерние вирусные частицы, и тогда при вирусной инфекции они уже сразу имеются в наличии, т.е. могут немедленно начинать репликацию вирусной РНК. У так называемых вирусов с негативным геномом, к которым принадлежат, в частности, вирусы гриппа и везикулярного стоматита, репликазы всегда включаются в капсид. Вирусы этой группы называются так потому, что у них инфицирующая цепь не кодирует никаких белков; только комплементарная ей цепь несет необходимые для этого нуклеотидные последовательности. Таким образом, инфицирующая цепь не может индуцировать размножение вируса без предобразованной репликазы. У РНК- вирусов с позитивным геномом, например у вируса полиомиелита, дело обстоит иначе: здесь вирусная РНК может выступать в роли мРНК, и у этих вирусов «голый» геном инфекционен. Синтез вирусной РНК начинается всегда на 3'-конце РНК-матрицы (т. е. с 5'-конца новой молекулы РНК) и идет до тех пор, пока не будет достигнут 5'-конец матрицы. Никаких механизмов, которые корректировали бы синтез вирусной РНК, нет, и частота ошибок здесь примерно та же, что и при транскрипции ДНК (в среднем одна ошибка на 10 4 нуклеотидов). Однако отсутствие корректирующих механизмов серьезным образом не сказывается на репликации из-за небольших размеров РНК-хромосомы вируса. Геномы всех РНК-вирусов невелики в сравнении с геномами крупных ДНК-содержащих вирусов, и это является прямым следствием того, что у них механизм репликации более примитивен. У всех ДНК-вирусов репликация инициируется в точке начала репликации, к которой присоединяются специальные инициаторные белки, способные привлекать к себе репликационные ферменты клетки- Рис. 5-72. Хромосома бактериофага Т4, на которой обозначены больше 30 генов, участвующих в репликации его ДНК. Геном бактериофага Т4 насчитывает свыше 160000 пар нуклеотидов, кодирующих более 200 различных белков, в том числе и белков, участвующих в репликации ДНК (некоторые из них здесь отмечены). Среди остальных белков много таких, которые участвуют в сборке головки и хвостового отростка (см. рис. 5- 68, А). 318 Рис. 5-73. Примеры, иллюстрирующие разнообразные способы репликации вирусных геномов. В двух случаях, как мы видим, к концам цепей ДНК ковалентно присоединены терминальные белки, эти белки играют важную роль в соответствующем процессе репликации. Обратите внимание на главное различие между РНК-вирусами с позитивными и негативными геномами: оно заключается в том, что вирусы с «минус»-цепью, прежде чем образовать вирусные белки, должны синтезировать «плюс»-цепь. Для этой цели капсид РНК-вируса должен нести в себе одну или несколько молекул вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразы (репликазы). Справа в рамке показан для каждого случая конечный РНК- или ДНК-продукт, идентичный инфицирующему вирусному геному, представленному слева. хозяина (см. разд. 5.3.9). Существует много различных путей репликации вирусных геномов. Их сложность объясняется необходимостью так или иначе решить проблему репликации концов простой линейной молекулы ДНК, при том что имеющаяся ДНК-репликаза не способна начинать синтез в отсутствие затравки. Проблема эта решается у ДНК-вирусов различными способами; есть вирусы с кольцевой хромосомой, которая вообще не имеет концов; у некоторых вирусов с линейным геномом терминальные нуклеотидные последовательности повторяются или концы хромосом образуют петли; наконец, имеются вирусы, геном которых несет особые терминальные белки, способные непосредственно «включать» ДНК-полимеразу. На рис. 5-73 представлены некоторые способы репликации геномов, встречающиеся у вирусов. 5-43 5.5.6. Хромосомы вирусов способны включаться в хромосомы клетки-хозяина [48] Проникновение вирусной хромосомы в клетку далеко не всегда приводит к немедленному размножению вирусных частиц. Многие вирусы могут существовать в латентной форме: их геномы при этом хотя и присутствуют в клетке, остаются неактивными; образования дочерних 319 Рис. 5-74 . Жизненный цикл бактериофага λ. Геном бактериофага состоит приблизительно из 50000 пар нуклеотидов и кодирует около 50 белков. Его двухцепочечная ДНК способна существовать как в линейной, так и в кольцевой форме. Развитие бактериофага может пойти, как это здесь изображено, и по литическому, и по лизогенному пути. Повреждение ДНК клетки, находящейся в лизогенном состоянии, вынуждает интегрированную фаговую ДНК (профаг) выйти из хромосомы хозяина и начать литический цикл. Включение фаговой ДНК в хромосому хозяина и выход из хромосомы осуществляются путем сайт-специфической генетической рекомбинации, катализируемой особым белком бактериофага λ, так называемой интегразой. частиц не происходит. О способности вирусов существовать в латентной форме стало известно, когда выяснилось, что многие бактерии, казалось бы неинфицированные, продуцируют бактериофаг, если их подвергнуть облучению ультрафиолетом. После этого были проведены эксперименты, которые показали, что у таких лизогенных бактерий в хромосому включена полная хромосома вируса. Эти интегрированные вирусные хромосомы стали называть провирусами (профагами). Бактериофаги, способные включаться в бактериальные хромосомы, называются лизогенизирующими бактериофагами. Наиболее полно изучен среди них бактериофаг лямбда (λ), о ферменте которого, лямбда-интегразе, мы уже говорили. Когда бактериофаг X заражает подходящую клетку Е. coli, он обычно размножается в ней и образует несколько сотен дочерних фаговых частиц, которые выходят наружу в момент лизиса клетки; это так называемый литический путь инфекции. Гораздо реже линейные инфицирующие молекулы ДНК замыкаются в кольцо и включаются в кольцевую хромосому бактерии-хозяина путем сайт-специфической рекомбинации (см. разд. 5.4.7). По завершении такой интеграции образовавшаяся лизогенная бактерия, несущая хромосому бактериофага λ в виде профага, размножается, как обычно, до тех пор, пока на нее не воздействует какой-нибудь повреждающий внешний 320 фактор, например ультрафиолетовые лучи или ионизирующее излучение. Это воздействие вынуждает интегрированный профаг выйти из хромосомы хозяина и начать обычный, свойственный вирусу цикл размножения. Интегрированный профаг, таким образом, не осужден на гибель вместе с поврежденной клеткой-хозяином; у него есть шанс ускользнуть из нее и перейти в соседнюю неповрежденную клетку Е. coli (рис. 5-74). 5.5.7. Непрерывный синтез вирусных белков может превращать нормальные клетки в раковые [49] В животных клетках, как и у бактерий, для размножения вирусов существует помимо литического еще и другой путь. Те животные клетки, в которых ДНК-вирусы размножаются литическим путем, ведущим к гибели клетки, принято называть пермиссивными. Клетки, в которых размножение вирусов блокируется, называются непермиссивными; вирусная хромосома в таких случаях либо включается в геном клетки-хозяина и в дальнейшем размножается вместе с ним, либо образует плазмиду - кольцевую молекулу ДНК, репликация которой регулируется и не ведет к гибели клетки. Иногда это вызывает в непермиссивных клетках определенное генетическое изменение, в результате которого начинается их неконтролируемый рост, т.е. нормальные клетки превращаются в раковые. Соответствующий ДНК-вирус называют в таких случаях опухолевым ДНК-вирусом, а превращение, о котором идет речь, - вирусной неопластической трансформацией. Среди опухолевых ДНК-вирусов наиболее полно изучены два представителя паповавирусов, а именно SV40 и вирус полиомы. Выяснилось, что их трансформирующая способность зависит от нескольких вирусных белков, кооперативное действие которых переводит покоящиеся клетки из G 0 -фазы в S-фазу (см. разд. 3.3). В пермиссивных клетках этот переход в S-фазу делает доступными вирусу все репликационные ферменты клетки-хозяина, необходимые для синтеза вирусной ДНК. В непермиссивной клетке синтез провирусом этих вирусных белков подавляет часть нормальных регуляторных механизмов и самой клетки, и всего ее потомства. 5.5.8. Опухолевые РНК-вирусы принадлежат к классу ретровирусов [50] Особым образом ведут себя опухолевые РНК-вирусы: проникновение их в пермиссивную клетку часто ведет одновременно и к нелетальному для клетки высвобождению дочерних вирусных частиц (отпочковывающихся от клеточной поверхности), и к стойкому генетическому изменению в инфицированной клетке, которое превращает эту клетку в раковую. Как может заражение вирусом вызвать стойкое генетическое изменение, было непонятно до тех пор, пока не был открыт фермент обратная транскриптаза, с помощью которого цепи инфицирующей РНК этих вирусов транскрибируются в комплементарные им цепи ДНК. Опухолевые РНК-вирусы, к которым относится первый хорошо изученный опухолевый вирус, а именно вирус саркомы Рауса, являются представителями крупного класса вирусов, так называемых ретровирусов. Название это отражает тот факт, что часть их жизненного цикла составляет процесс, обратный нормальной транскрипции, т. е. транскрипции ДНК в РНК. К ретровирусам относится и вирус СПИДа (спонтанно приобретенного иммунодефицита). Рис. 5-75 иллюстрирует жизненный цикл одного из ретровирусов. Фермент обратная транскриптаза представляет собой необычную форму ДНК-полимеразы, способную использовать в качестве матрицы и РНК. 321 и ДНК; этот фермент закодирован в РНК ретровируса и при образовании дочерних вирусных частиц всегда упаковывается в их капсид. Когда одноцепочечная РНК ретровируса проникает в клетку, обратная транскриптаза сначала синтезирует ДНК-копию этой цепи РНК, в результате чего образуется гибридная ДНК-РНК-спираль, которую тот же фермент использует затем для образования двойной спирали, состоящей уже из двух цепей ДНК. Эта ДНК-копия вирусного РНК-генома включается в хромосому клетки-хозяина. Включению способствует закодированный вирусом фермент, осуществляющий сайт-специфическую рекомбинацию; он узнает определенную нуклеотидную последовательность в вирусной ДНК и катализирует включение вирусной ДНК практически в любой участок хромосомы клетки-хозяина (см. рис. 5-67, Б). Следующий этап инфекционного процесса составляет транскрипция интегрированной вирусной ДНК РНК-полимеразой клетки-хозяина; в результате появляется большое число молекул вирусной РНК, идентичных исходному инфицирующему геному. Завершается процесс трансляцией этих молекул РНК с образованием капсидных и мембранных белков, а также обратной транскриптазы; наконец, происходит сборка новых вирусных частиц, окруженных оболочкой, которые отпочковываются от клеточной мембраны (см. рис. 5-75). Как РНК-, так и ДНК-содержащие опухолевые вирусы вызывают неопластическую трансформацию клеток, потому что присутствие в клетке вирусной ДНК индуцирует синтез новых белков, нарушающих регуляцию клеточного деления. Гены, кодирующие синтез таких белков, называются онкогенами. У опухолевых ДНК-вирусов онкогены обычно кодируют нормальные вирусные белки, необходимые для размножения вируса. Иначе обстоит дело у опухолевых РНК-вирусов: онкогены, которые они несут, представляют собой модифицированные формы нормальных генов клетки-хозяина - они для размножения вируса не требуются. Поскольку в капсид ретровируса может уместиться лишь некоторое ограниченное количество РНК, необходимые онкогенные последовательности нуклеотидов часто замещают собой существенную часть генома ретровируса и вирус оказывается дефектным. Мы расскажем позже (см. разд. 13.4.2 и разд. 21.2.1), почему изучение вирусных онкогенов послужило ключом к пониманию причин и природы рака, а также к познанию тех механизмов, которые в норме регулируют рост и деление клеток у многоклеточных организмов. 5.5.9. Некоторые транспозоны очень сходны с ретровирусами [51] Поскольку многие вирусы способны включаться в хромосомы клеток-хозяев и выходить из них, можно предположить, что все крупные геномы содержат то или иное число различных провирусов. Вполне вероятно, что в этих геномах имеется также и ряд мобильных последовательностей ДНК, которые не образуют вирусных частиц и не могут покинуть клетку; их называют транспозонами. Транспозоны (размеры их колеблются от нескольких сотен до десятков тысяч нуклеотидных пар) обычно присутствуют в клетке в нескольких копиях. Они представляют собой нечто вроде крошечных паразитов, таящихся в хромосомах. Время от времени любой такой транспозон активируется и под влиянием собственного фермента, катализирующего сайт-специфическую рекомбинацию, переходит в какой-нибудь иной участок ДНК в пределах той же клетки. Этот процесс носит название транспозиции. Ферменты, катализирующие транспозицию, - их называют транспозазами - по большей части закодированы в ДНК самого транспозона. Большинство транспозонов переходит с места на место крайне редко (у бактерий приблизительно 1 раз на 10 5 генераций), так что их очень трудно отличить от 322 Рис. 5-75. Жизненный цикл одного из ретровирусов. Геном ретровируса представляет собой молекулу РНК, насчитывающую около 8500 нуклеотидов; в каждой вирусной частице упаковано две такие молекулы. Фермент обратная транскриптаза представляет собой ДНК-полимеразу, которая образует сначала ДНК-копию вирусной молекулы РНК, а затем вторую цепь ДНК, так что в итоге получается ДНК-копия РНК-генома. Включение этой двойной спирали ДНК в хромосому клетки-хозяина, катализируемое вирусным белком, необходимо для синтеза новых молекул вирусной РНК, осуществляемого РНК-полимеразой клетки-хозяина. неподвижных участков хромосомы. Не знаем мы также и того, что служит пусковым механизмом для этого процесса. Механизмы транспозиции могут быть различными. У одного крупного семейства транспозонов используемый для этой цели механизм полностью совпадает с частью жизненного цикла ретровируса. Такие элементы - их называют ретротранспозонами - известны у столь далеких друг от друга организмов, как дрожжи, плодовая мушка и млекопитающие. Одним из наиболее хорошо изученных ретротранспозонов является обнаруженный у дрожжей элемент Ту1. На первом этапе его транспозиции происходит транскрипция всего элемента с образованием РНК-копии, состоящей более чем из 5000 нуклеотидов. В этом РНК-транскрипте закодирована обратная транскриптаза, которая синтезирует кольцевую двухцепочечную ДНК-копию молекулы РНК через промежуточное соединение - гибридную двойную спираль РНК-ДНК точно так же, как это происходит в клетке, инфицированной ретровирусом (см. рис. 5-75). Аналогия сохраняется и далее, когда кольцевая ДНК включается в случайно выбранный участок хромосомы. Как и у ретровируса, включение осуществляется по типу сайт-специфической рекомбинации, представленной на рис. 5-67, Б; для этого, по всей вероятности, используется транспозаза, также закодированная в упомянутом выше длинном РНК-транскрипте. При всем поразительном сходстве с ретровирусом элемент Ту1 отличается от него тем, что будучи лишен функциональной белковой оболочки, он может перемещаться лишь внутри какой-нибудь одной клетки или может быть передан ее потомкам. |