Молекулярная биология клетки. Том 1. Молекулярная биология клетки 2Molecular Bruce Alberts, Dennis Bray,Biology
 Скачать 25.6 Mb.
|
|
отстающей. Наращивание второй цепи отстает, потому что образование каждого фрагмента Оказаки оказывается возможным лишь после того, как продвижение ведущей цепи откроет соответствующий участок матрицы. Хотя в целом вся эта цепь строится в направлении 3' → 5', каждый из ее фрагментов синтезируется в направлении 5' → 3'. Благодаря тому что ДНК на отстающей части вилки строится при помощи механизма, работающего прерывисто по типу «шитья назад иголкой» (backstitching), в репликационной вилке не требуется никакого другого фермента, кроме (5' → 3')-ДНК-полимеразы. 5-24 5.3.3. Высокая точность репликации ДНК предполагает наличие механизма, осуществляющего коррекцию [27] Точность копирования при репликации ДНК столь велика, что в среднем на каждые 1-10 9 комплементарных пар, образующихся в процессе воспроизведения генома млекопитающих, насчитывающего 3-10 4 пар оснований (см. разд. 9.1.3), приходится приблизительно одна ошибка. Точность эта значительно превосходит ту, какую следует ожидать, учитывая, что во время репликации образуются не только обычные комплементарные пары оснований. В нормальной ДНК возникают на короткое время с частотой 10 -4 -10 -5 редкие таутомерные формы всех четырех ее оснований. Эти формы образуют неправильные пары. Так, редкая таутомерная форма С спаривается с А вместо G, в результате чего возникает мутация (рис. 5-40). Таким образом высокая точность Рис. 5-40 . Пример возникновения при репликации ДНК неправильной пары оснований: находясь в термодинамически невыгодной таутомерной форме, цитозин легко образует водородные связи с аденином. 290 Рис. 5-41. Схема, поясняющая, как протекает процесс коррекции (устранение ошибок) при синтезе ДНК, катализируемом ДНК-полимеразами у бактерий. Предполагается, что аналогичный механизм коррекции действует и в эукариотических клетках. репликации ДНК определяется наличием механизмов, осуществляющих коррекцию, т. е. устраняющих подобные ошибки. Один из важных механизмов коррекции зависит от особых свойств ДНК-полимеразы. В отличие от РНК-полимераз ДНК-полимеразы не могут начать синтез новой полинуклеотидной цепи, просто связав друг с другом 3'-ОН- конец какой-либо полинуклеотидной цепи, которая должна быть спарена с матричной цепью ДНК; ДНК-полимеразы способны только добавлять новые нуклеотиды к уже имеющемуся 3'-ОН-концу полинуклеотидной цепи (см. рис. 5- 34). Эту предобразованную цепь, к которой добавляются нуклеотиды, называют затравкой или праймером. Молекулы ДНК с затравкой, у которой 3'-ОН-конец не спарен, не могут служить матрицами. Бактериальные ДНК-полимеразы способны, однако, с ними работать. Вступив в контакт с такими молекулами ДНК, они используют присущую им (3' → 5')-экзонуклеазную активность и отщепляют (путем гидролиза) любые неспаренные нуклеотиды на затравочном конце. Отщепляется ровно столько нуклеотидов, сколько требуется для того, чтобы у затравки появился спаренный конец и образовалась активная матрица. Действуя таким образом, ДНК-полимераза выступает в роли «самокорректирующего» фермента: она устраняет свои собственные ошибки, возникающие в процессе полимеризации. Рис. 5-41 поясняет, как этот тип коррекции может использоваться для удаления неправильных пар С—А, образуемых редкой таутомерной формой цитозина. Потребность в правильно спаренном конце как раз и наделяет ДНК- полимеразу способностью исправлять свои собственные ошибки. Такой фермент, очевидно, мог бы начать синтез ДНК при полном отсутствии затравки, только утратив способность различать спаренный и неспаренный концы. В то же время РНК-полимеразы, участвующие в транскрипции генов (см. разд. 5.1.1), судя по всему не нуждаются в самокоррекции, потому что ошибки транскрипции не передаются следующему поколению и случайно возникшие дефектные молекулы особой роли не играют. РНК-полимеразы могут начинать синтез новых полинуклеотидных цепей в отсутствие затравки, причем ошибки встречаются с частотой 10 -4 как при синтезе РНК, так и при трансляции, т.е. при переводе нуклеотидных последовательностей мРНК в аминокислотные последовательности белков. 5-22 5.3.4. Репликация ДНК в направлении 5' → 3' обеспечивает эффективную коррекцию Весьма вероятно, что однонаправленность репликации ДНК (5' → 3') объясняется высокими требованиями к точности процесса. Если бы существовала ДНК-полимераза, присоединяющая дезоксирибонуклеозидтрифосфаты к синтезируемой полинуклеотидной цепи таким образом, что эта цепь росла в направлении 3' → 5', то активирующую трифосфатную группировку нес бы растущий 5'-конец цепи, а не поступающий мононуклеотид. В этом случае ошибки полимеризации не могли бы устраняться простым гидролизом, потому что появление свободного 5'-конца немедленно обрывало бы синтез ДНК. Ясно, что основание, только что неправильно спарившееся на 3'-конце, устранить гораздо легче, чем такое же основание, присоединившееся к 5'-концу 291 цепи ДНК. Поэтому, хотя механизм репликации ДНК, изображенный на рис. 5-39, кажется на первый взгляд значительно более сложным и громоздким, чем неверный гипотетический механизм, представленный на рис. 5-38, этот реально функционирующий механизм способен обеспечить гораздо большую точность именно в силу того, что синтез ДНК идет здесь только в направлении 5' → 3'. 5-25 5.3.5. Для синтеза коротких затравочных молекул на матрице отстающей цепи требуется особый фермент [28] С того момента, как возникла репликационная вилка, для ДНК-полимеразы, синтезирующей ведущую цепь, всегда есть спаренный 3'- конец, необходимый ей для того, чтобы начать синтез новой цепи. Иначе обстоит дело с ДНК-полимеразой, ответственной за синтез отстающей цепи. Ей требуется всего каких-нибудь 4 с для того, чтобы синтезировать один короткий фрагмент ДНК, после чего она должна переключиться на синтез совсем другого фермента на новом участке матричной цепи, расположенной на некотором расстоянии от первого (см. рис. 5-39). Для этого ей всякий раз нужна затравка со спаренным 3'-концом, а следовательно, нужен и механизм, способный производить такие затравки. В этот механизм входит фермент, называемый ДНК-праймазой. Она синтезирует из рибонуклеозидтрифосфатов короткие РНК-затравки (праймеры), состоящие у эукариот примерно из 10 нуклеотидов (рис. 5-42). Эти затравки синтезируются с определенными интервалами на матрице для отстающей цепи; здесь их наращивает ДНК-полимераза, начиная, таким образом, всякий раз новый фрагмент Оказаки. Молекула ДНК-полимеразы продолжает это наращивание до тех пор, пока она не достигнет РНК-затравки, присоединенной к 5'-концу предыдущего фрагмента ДНК. Чтобы обеспечить образование непрерывной цепи ДНК из многих таких фрагментов, в действие вступает особая система репарации ДНК, быстро удаляющая РНК-затравку и заменяющая ее на ДНК. Завершает процесс ДНК-лигаза, соединяющая 3'-конец нового фрагмента ДНК с 5'-концом предыдущего фрагмента (рис. 5-43). Почему предпочтение отдается удаляемой РНК-затравке, а не ДНК-затравке, которую не требовалось бы удалять? Выше мы отмечали, что самокорректирующая полимераза не способна начинать синтез полинуклеотидных цепей de novo; это предполагает и обратное утверждение: тот фермент, который начинает синтез цепей de novo, к эффективной самокоррекции не способен. Значит, любой фермент, катализирующий инициацию синтеза фрагментов Оказаки, неизбежно создал бы не слишком точную копию (не менее 1 ошибки на 10 5 ). Это означало бы колоссальное увеличение частоты мутаций даже при том, что количество Рис. 5-42. Схема реакции, катализируемой праймазой - ферментом, синтезирующим короткие РНК-затравки в отстающей цепи ДНК. В отличие от ДНК-полимеразы этот фермент способен начинать синтез новой полинуклеотидной цепи с соединения двух нуклеозидтрифосфатов. Образовав короткий полинуклеотид, праймаза прекращает работу. Теперь к свободному 3'-концу может добавлять нуклеотиды ДНК-полимераза. 292 таких копий, сохранившееся в конечном продукте, составляло бы не более 5% всего генома (например, 10 нуклеотидов во фрагменте, состоящем из 200 нуклеотидов). Естественно думать поэтому, что выдвижение РНК, а не ДНК на роль затравки обеспечивало важное преимущество, поскольку рибонуклеотиды автоматически метят такие последовательности, как «плохие копии», которые должны быть удалены. 5-26 5-33 5.3.6. Особые белки способствуют расплетанию двойной спирали ДНК перед репликационной вилкой [29] Двойная спираль ДНК должна расплетаться по ходу продвижения репликационной вилки, для того чтобы поступающие дезоксирибонуклеозидтрифосфаты могли спариваться с родительской матричной цепью, Однако в обычных условиях двойная спираль ДНК весьма стабильна; спаренные основания соединены столь прочно, что для разделения двух цепей ДНК в пробирке требуются температуры, приближающиеся к точке кипения воды (90°С). По этой причине большинство ДНК-полимераз может копировать лишь ту молекулу ДНК, у которой матричная цепь уже отделилась от другой цепи. Для того чтобы двойная спираль ДНК раскрылась и соответствующая матричная цепь стала доступной для ДНК-полимеразы, необходимы особые белки. Они бывают двух типов. ДНК-геликазы были впервые выделены как белки, которые, присоединяясь к одиночной цепи ДНК, катализируют гидролиз АТР. Как уже отмечалось в гл. 3, гидролиз АТР может циклическим образом изменять форму молекулы белка, вследствие чего белок будет производить механическую работу (см. разд. 3.4.11). Именно этот принцип лежит в основе быстрого перемещения ДНК-геликаз по одиночной цепи ДНК. Встречая на своем пути участок двойной спирали, эти ферменты продолжают двигаться вдоль своей цепи и тем самым расплетают двойную спираль (рис. 5-44). Расплетание ДНК-спирали в области репликационной вилки, вероятно, осуществляется двумя совместно действующими ДНК- геликазами, одна из которых перемещается по ведущей цепи, а другая - по отстающей. Ясно, что две эти геликазы должны двигаться вдоль одиночных цепей ДНК в противоположных направлениях, т. е. это должны быть разные ферменты. Действительно, оба указанных типа ДНК- геликаз удалось обнаружить. При этом исследования на бактериях показали, что главную роль играет ДНК-геликаза отстающей цепи. Причины этого мы обсудим ниже. Белки, дестабилизирующие спираль (их называют также белками, связывающими одноцепочечную ДНК или SSB-белками), связываются с одиночными цепями ДНК, не закрывая оснований, т. е. оставляя их доступными для спаривания. Сами они не способны расплетать длинные молекулы ДНК, но, присоединяясь к одиночным цепям ДНК, они тем самым способствуют любому процессу расплетания спирали; они, например, помогают ДНК-геликазе расплетать двойную спираль в репликационной вилке. На матрице отстающей цепи SSB-белки кооперативным образом связываются с одноцепочечными участками ДНК и предотвращают здесь образование «шпилек», небольших двухспиральных структур, которые могли бы помешать синтезу ДНК, осуществляемому ДНК-полимеразой (рис. 5-45). Рис. 5-43. Отдельные этапы синтеза каждого из фрагментов отстающей цепи ДНК. У эукариот РНК-затравки синтезируются в отстающей цепи с интервалами приблизительно в 200 нуклеотидов и каждая из них состоит из 10 нуклеотидов. 293 5.3.7. Белки в репликационной вилке действуют кооперативно, образуя «репликационную машину» [30] До сих пор мы говорили о репликации ДНК так, как если бы она осуществлялась смесью репликационных белков, действующих независимо друг от друга. Между тем в действительности большая часть этих белков объединена в крупный мультиферментный комплекс, быстро движущийся вдоль ДНК. Этот комплекс - нечто вроде крошечной «швейной машины»: «деталями» его служат отдельные белки, а источником энергии - реакция гидролиза нуклеозидтрифосфата. Комплекс изучен достаточно хорошо только у бактерий Е. coli и у некоторых вирусов, но есть все основания считать, что очень похожий механизм действует и у эукариот (см. разд. 9.3.3). Схема на рис. 5-46, где подробно изображена репликационная вилка, позволяет судить о том, как работают отдельные части такой «репликационной машины». В области вилки действуют две идентичные ДНК-полимеразы - на ведущей и на отстающей цепи. Спираль ДНК расплетается в результате совместного действия ДНК-полимеразы, работающей на ведущей цепи, и ДНК-геликазы, движущейся вдоль отстающей цепи; этому процессу способствуют кооперативно связывающиеся молекулы дестабилизирующегося белка. В то время как на ведущей цепи ДНК- полимераза работает непрерывно, на отстающей цепи фермент через определенные интервалы прерывает и вновь возобновляет свою работу, используя для полимеризации короткие РНК-затравки, синтезируемые ДНК-праймазой. Эффективность репликации сильно возрастает вследствие тесного объединения всех этих белковых компонентов. Молекула праймазы непосредственно сцеплена с ДНК-геликазой, образуя вместе с нею на отстающей цепи структуру, называемую праймосомой, которая движется с репликационной вилкой и по ходу своего движения синтезирует РНК-затравки. Молекула ДНК-полимеразы, работающая на отстающей цепи, также движется совместно с остальными белками, синтезируя ряд новых фрагментов Оказаки; ради этого, как полагают, цепь ДНК, которая служит для нее матрицей, складывается сама на себя, как это показано на рис. 5-47. Репликационные вилки оказываются, таким образом, объединены в одну крупную структуру (с общей массой > 10 6 дальтон), быстро перемещающуюся вдоль ДНК и обеспечивающую Рис. 5-44. Действие ДНК-геликаз. Небольшой фрагмент ДНК присоединен путем отжига к длинной одноцепочечной ДНК, так что образовался короткий участок двойной спирали. Эта спираль расплетается по мере того, как геликаза движется вдоль одиночной цепи ДНК, катализируя реакцию, для которой требуется наряду с ферментом и АТР. Источником энергии для движения геликазы служит гидролиз АТР (см. рис. 3-63). Рис. 5-45 . Влияние дестабилизирующих белков на структуру одно-цепочечной ДНК. Поскольку каждая белковая молекула предпочитает связываться с другой, уже связавшейся ранее молекулой (так называемое кооперативное связывание), эти белки образуют длинные кластеры, выпрямляющие матричные пени ДНК и облегчающие процесс полимеризации. Структуры в форме «шпильки», возникающие в свободной одноцепочечной ДНК, образуются путем случайного спаривания оснований в коротких участках, содержащих взаимно комплементарные последовательности нуклеотидов, они напоминают короткие спирали, возникающие во всех молекулах РНК. 294 Рис. 5-46. Главные типы белков, действующих в области репликационной вилки (схема показывает их локализацию на ДНК). Комплекс ДНК- праймазы и ДНК-геликазы на отстающей цепи ДНК известен под названием праймосомы. возможность координированного и эффективного синтеза ДНК на обет ветвях вилки. Позади «репликационной машины» по ходу ее движения остается на отстающей цепи ряд несшитых фрагментов Оказаки, все еще содержащих на своем 5'-конце РНК-затравки, необходимые для инициации на синтеза. Эти РНК-затравки должны быть удалены, а фрагменты сшиты при помощи репарирующих ферментов, работающих позади репликационной вилки (см. рис. 5-43). Рис. 5-47 . Схема, иллюстрирующая современные представления о расположении репликационных белков в движущейся репликационной вилке. Вместо двумерной структуры, изображенной на рис. 5-46, здесь показано, как ДНК на отстающей цепи складывается, в результате чего возникает комплекс из двух ДНК-полимераз - ведущей и отстающей цепи. Кроме того, благодаря складыванию 3'-конец каждого завершенного фрагмента Оказаки оказывается рядом со стартовым участком следующего такого фрагмента (ср. с рис. 5-46). Находясь в тесном контакте с остальными репликационными белками, молекула ДНК-полимеразы отстающей цепи может непрерывно работать на одной и той же репликационной вилке, отделяясь от готового фрагмента ДНК, она переходит к ближайшей новой РНК-затравке, чтобы начать синтез следующего фрагмента. Обратите внимание, что на этой схеме одна из дочерних спиралей ДНК направлена вправо и вниз, а вторая влево и вверх. 295 5.3.8. Ошибки при репликации ДНК в бактериальных клетках устраняются особой корректирующей системой, распознающей неправильное спаривание оснований У таких бактерий, как Е. coli, деление происходит каждые 30 мин, поэтому у них сравнительно легко выявить в большой популяции клеток редкие экземпляры с измененными признаками. Выделен, например, класс мутантов, характеризующихся резким повышением частоты спонтанных мутаций, что связано с присутствием в его клетках специфических генов-мутаторов. Известен ген-мутатор, кодирующий дефектную форму 3' → 5'-корректирующей экзонуклеазы, представляющей собой субъединицу ДНК-полимеразы (см. разд. 5.3.3). Если дефект затрагивает этот белок, то ДНК-полимераза утрачивает способность эффективно осуществлять коррекцию и в ДНК накапливается много ошибок, которые при нормальной репликации были бы устранены. Изучение тех мутантов Е. соlі, у которых имеются гены-мутаторы, выявило еще одну систему, в норме устраняющую ошибки репликации, не улавливаемые корректирующей экзонуклеазой. Эта система коррекции неправильного спаривания (mismatch proofreading sistem), называемая также системой исправления ошибок спаривания (mismatch repair system), отличается от ранее рассмотренных систем репарации ДНК тем, что она не зависит от присутствия в ДНК аномальных нуклеотидов, которые должны быть распознаны и удалены («вырезаны»). Она выявляет деформации на внешней стороне спирали, вызванные плохой пригонкой обычных, но некомплементарных оснований. Если бы эта корректирующая система просто распознавала ошибки спаривания в реплицировавшейся ДНК и удаляла без выбора один из двух неправильно спарившихся нуклеотидов, то в половине случаев она бы сама совершала ошибку, «исправляя» не новосинтезированную, а матричную цепь, так что в среднем частота ошибок оставалась бы прежней. Для эффективной коррекции система должна уметь различать неправильно спаривающиеся нуклеотиды и избирательно удалять такие нуклеотиды только из новой цепи (т.е. устранять именно ошибки репликации). В клетках Е. coli процесс распознавания связан с метилированием определенных остатков аденина в ДНК. Метальные группы присоеди- |