Молекулярная биология клетки. Том 1. Молекулярная биология клетки 2Molecular Bruce Alberts, Dennis Bray,Biology
 Скачать 25.6 Mb.
|
|
Заключение Для того чтобы мог начаться синтез какого-нибудь определенного белка, должна сначала образоваться соответствующая мРНК (путем транскрипции ДНК). К этой мРНК, к ее старт-кодону, присоединяется малая рибосомная субъединица; узнает старт-кодон особая инициаторная тРНК. Присоединение большой субъединицы завершает сборку рибосомы, Далее следует фаза элонгации белкового синтеза. Во время этой фазы разные аминоацил-тРНК, нагруженные каждая своей аминокислотой, поочередно связываются с соответствующим кодоном на мРНК путем спаривания его оснований с основаниями антикодона тРНК. Каждая очередная аминокислота присоединяется к карбоксильному концу растущего полипептида в результате циклического процесса, состоящего из трех последовательных этапов: связывания аминоацил-тРНК, образования пептидной связи и транслокации рибосомы. Рибосома перемещается вдоль молекулы мРНК в направлении 5' → 3' от одного кодона к другому до тех пор, пока не будет достигнут какой-либо из трех стоп-кодонов. К этому стоп-кодону присоединяется затем фактор освобождения, вызывающий отделение завершенного полипептида от рибосомы. Рибосомам прокариот и эукариот свойственна высокая степень гомологии, несмотря на довольно существенные различия в числе и в размерах обоих видов компонентов - рРНК и белков. Преобладающая роль рРНК в структуре и функции рибосом, возможно, отражает происхождение белкового синтеза, на ранних этапах эволюционировавшего в среде, где катализ осуществляется с помощью РНК. 5.2. Механизмы репарации ДНК [16] В то время как шансы на долговременное существование вида могут возрастать вследствие изменений в его генетической конституции, выживание в каждый конкретный момент требует безусловного сохранения генетической информации. Для поддержания такого постоянства генетического материала требуется не только чрезвычайно точный механизм копирования нуклеотидных последовательностей ДНК в каждом новом клеточном поколении, но и механизм исправления 277 повреждений, спонтанно возникающих в ДНК. Большая часть таких повреждений носит временный характер, поскольку они действительно устраняются с помощью особого механизма, который носит название репарации ДНК. Если этот обеспечивающий клеточное постоянство механизм не срабатывает, изменение закрепляется. Подобное изменение называют мутацией. Он может оказаться гибельным для организма, если затронет какую-нибудь жизненно важную последовательность ДНК. Прежде чем говорить о механизмах репарации ДНК, коснемся вкратце вопроса о том, как воспроизводятся нуклеотидные последовательности ДНК из поколения в поколение. 5.2.1. Высокая надежность сохранения нуклеотидных последовательностей ДНК [17] Частоту изменений в нуклеотидных последовательностях ДНК (частота возникновения мутаций или скорость мутирования) удается определять только косвенным путем. Один из способов состоит в сравнении аминокислотных последовательностей одного и того же белка у нескольких биологических видов. Долю аминокислот, которые окажутся при этом различными, сопоставляют затем с числом лет, прошедших с того момента, как два данных вида дивергировали в процессе эволюции от общего предка (этот срок оценивают на основе данных палеонтологической летописи). Исходя из этого можно вычислить среднее число лет, необходимое для того, чтобы какое-либо стойкое изменение затронуло одну из аминокислот данного белка. Поскольку каждое такое изменение отражает, как правило, одиночное изменение в нуклеотидной последовательности гена, кодирующего этот белок, мы тем самым узнаем и среднее число лет, требующееся для возникновения в данном гене одной стабильной мутации. Такого рода определения дают нам всегда сильно заниженные оценки скорости мутирования, так как большая часть мутаций нарушает функцию данного белка и исчезает из популяции под давлением отбора. Есть, однако, среди изученных белков одно семейство, для которого это возражение почти не имеет силы. Это так называемые фибринопептиды - фрагменты из 20 аминокислотных остатков, отщепляемые от белка фибриногена, когда он при свертывании крови, активируясь, превращается в фибрин. Фибринопептиды не выполняют никакой прямой функции, а потому они толерантны почти ко всем возможным аминокислотным заменам. Анализ фибринопептидов показывает, что белок среднего размера, состоящий из 400 аминокислот, изменяется случайным образом в результате одной аминокислотной замены приблизительно каждые 200000 лет. Позже с разработкой методов определения нуклеотидных последовательностей ДНК (см. разд. 4,6.6), появилась возможность выявить степень сходства нуклеотидных последовательностей ДНК в гомологичных некодирующих участках генома у разных видов млекопитающих. Полученные таким путем оценки частоты мутаций прекрасно согласуются с теми, какие дает анализ фибронопептидов. 5.2.2. Скорость мутирования в растущих клетках совпадает с оценками, полученными на основе эволюционных исследований [18] Скорость мутирования можно оценить прямым способом, подсчитывая количество генетических изменений, спонтанно возникающих в большой популяции клеток за относительно короткий промежуток времени. Для этого определяют частоту возникновения новых мутантов в очень 278 больших популяциях животных (например, у плодовой мушки или в колониях мышей), либо проводят скрининг с целью выявить изменения в активности определенных ферментов у клеток, растущих в культуре. Хотя такие оценки носят лишь приближенный характер, они в обоих случаях согласуются с представлением о том, что при репликации на 10 9 пар оснований (в среднем) происходит одна ошибка, т. е. одна замена пары оснований. Следовательно, для того чтобы в гене, кодирующем средний по размерам белок и насчитывающем примерно 10 3 кодирующих пар оснований, могла возникнуть мутация, требуется около 10 6 клеточных поколений. Эта величина достаточно удовлетворительно согласуется с оценкой, полученной на основе эволюционных исследований, согласно которой мутация в среднем гене зародышевой линии возникает один раз каждые 200000 лет. 5-16 5.2.3. Большинство мутаций, изменяющих белки, вредны и элиминируются естественным отбором [17] Если число различий в аминокислотном составе одного и того же белка у двух разных биологических видов представить как функцию времени, прошедшего с момента дивергенции этих видов, то мы получим прямую линию. Иными словами, чем длиннее период, прошедший с момента дивергенции, тем больше число таких различий. Для удобства наклон прямой может быть охарактеризован через единицу эволюционного времени для данного белка (среднее время, необходимое для того, чтобы в последовательности из 100 аминокислот появилась одна аминокислотная замена). Сделав это для разных белков, мы убедимся в том, что каждый из них характеризуется своей особой скоростью эволюции (рис. 5-30). Поскольку все пары оснований в ДНК подвержены случайным изменениям в равной мере, эти разные скорости отражают различия в вероятности для тех или иных организмов со случайной Рис. 5-30 . Сравнение частот аминокислотных замен в гемоглобине и цитохроме с с соответствующей величиной для фибринопептидов. Гемоглобин и цитохром с изменяются в процессе эволюции гораздо медленнее, чем фибринопептиды. Определяя частоты замен (табл. 5-2) в расчете на год, важно помнить, что два организма, дивергировавшие от общего предка 100 млн. лет назад, отделены друг от друга 200 млн. лет эволюционного времени. 279 мутацией в данном белке выжить и сохранить способность к размножению. Ясно, что изменения в аминокислотной последовательности нарушают функцию у одних белков гораздо сильнее, чем у других. Данные, приведенные в табл. 5-2, позволяют считать, что в гемоглобине вредными оказываются примерно 6 из каждых 7 случайных аминокислотных замен, в цитохроме с - 29 из каждых 30, тогда как в гистоне Н4 почти все аминокислотные замены вредны. Можно думать, что носители таких вредных мутаций элиминируются из популяции под действием естественного отбора. 5.2.4. Наблюдаемые низкие частоты мутаций необходимы для сохранения вида в целом и каждого индивидуума [19] Поскольку мутации по большей части вредны, ни один биологический вид не может позволить себе быстро накапливать их в своих половых клетках. Позже мы обсудим (см. разд. 9.1.3), почему при наблюдаемой частоте мутаций, хотя она и невысока, число необходимых белков, которые могут быть закодированы в клетках зародышевого пути любого организма, не должно превышать 60000. Если бы частота мутаций была в 10 раз выше, в силу той же причины организм должен был бы довольствоваться 6000 белков. В этом случае эволюция, очевидно, не пошла бы дальше организмов, стоящих по степени сложности примерно на уровне плодовой мушки. Итак, сохранение вида требует, чтобы половые клетки организмов были защищены от быстрых генетических изменений, но сохранение каждого конкретного индивидуума требует такой же защиты и для всех прочих клеток многоклеточного организма (соматических клеток). Нуклеотидные замены в соматических клетках могут способствовать естественному отбору в пользу тех или иных лучше приспособленных клеток и привести к их неконтролируемому размножению, т. е. развитию рака, на долю которого в Западном полушарии приходится около 20% всех преждевременных смертей. Убедительные данные подтверждают, что гибель людей в данном случае вызвана главным образом накоплением изменений в нуклеотидных последовательностях ДНК соматических клеток. Десятикратное повышение частоты мутаций привело бы, вероятно, к катастрофическому росту раковых заболеваний вследствие того, что чаще возникали бы различные вариантные формы соматических клеток. Таким образом и сохранение того или иного вида с его 60000 белков (стабильность половых клеток), и предотвращение рака, возникающего как следствие мутаций в соматических клетках (стабильность соматических клеток), зависят у эукариот от чрезвычайно высокой надежности сохранения нуклеотидных последовательностей ДНК. 5.2.5. Низкие частоты мутаций означают, что родственные организмы построены практически из одних и тех же белков [17] Человек как род, отличный от крупных человекообразных обезьян, возник всего несколько миллионов лет назад. В каждом гене, следовательно, могло произойти за это время лишь сравнительно немного нуклеотидных замен, причем большинство из них естественный отбор должен был элиминировать. Сравнение человека и обезьян показывает, например, что их цитохромы с различаются лишь по 1% аминокислотных остатков, а их гемоглобины - приблизительно по 4%. Значительная часть нашего генетического наследия сформировалась, несомненно, задолго до появления Homo sapiens, в процессе эволюции млекопитающих (начавшейся приблизительно 3 • 10 8 лет назад) и даже ранее. Таблица 5-2. Наблюдаемые скорости изменения аминокислотных последовательностей в различных белках на протяжении эволюционного времени Белок Единица эволюционного времени 1) , млн. лет Фибринопептид 0,7 Гемоглобин 5 Цитохром с 21 Гистон Н4 500 1) Единица эволюционного времени - среднее время, необходимое для того, чтобы в данном белке на каждые 100 содержащихся в нем аминокислот могла появиться одна приемлемая аминокислотная замена. 280 Неудивительно поэтому, что у таких филогенетически далеких млекопитающих, как кит и человек, белки очень сходны. Эволюционный процесс, породивший резкие морфологические различия между млекопитающими, «добился» этих различий при поразительно малых изменениях в том материале, из которого мы все построены. Предполагается, что эти морфологические различия в значительной мере определяются неодинаковым временным и пространственным характером экспрессии генов во время эмбрионального развития. В гл. 10 мы обсудим, как подобные изменения в экспрессии генов могли возникнуть (см. разд. 10.5.8). 5-13 5-17 5.2.6. Без коррекции спонтанные повреждения в ДНК быстро ] изменили бы ее нуклеотидные последовательности [20] Физик Эрвин Шрёдингер в 1945 г. высказал мнение, что ген независимо от его химической природы (а она в то время еще не была известна) должен быть крайне мал - не более нескольких атомов. В противном случае, полагал Шрёдингер, огромное число генов, необходимое, как считалось, каждому организму, не могло бы уместиться в клеточном ядре. Было ясно, однако, что при столь малых размерах ген должен быть подвержен значительным изменениям вследствие спонтанных реакций, обусловленных беспорядочными тепловыми соударениями с окружающими молекулами. Возникала, таким образом, серьезная дилемма, поскольку генетические данные свидетельствуют о том, что вещество генов весьма стабильно и спонтанные изменения (мутации) происходят в нем чрезвычайно редко. Эта шрёдингеровская дилемма вполне реальна. ДНК действительно претерпевает значительные изменения, связанные с тепловыми флуктуациями. Мы знаем, например, что ДНК каждой клетки человеческого организма теряет за сутки около 5000 пуриновых оснований (остатков аденина и гуанина) вследствие термального разрыва М-гликозидных связей между пурином и дезоксирибозой (процесс апуринизации). Аналогичный пример составляют спонтанно происходящие в ДНК реакции Рис. 5-31. Дезаминирование и апуринизация две часто встречающиеся спонтанные химические реакции, вызывающие в клетках серьезное повреждение ДНК. Здесь приведено лишь по одному примеру реакций этих двух типов. 281 дезаминирования цитозина в урацил, частота которых, согласно оценкам, достигает 100 на один геном в сутки (рис. 5-31). Содержащиеся в ДНК основания изменяются также под влиянием реакционноснособных метаболитов, нарушающих их нормальное спаривание, а также под действием ультрафиолетовой радиации Солнца, которая может вызвать образование ковалентной связи между двумя соседними остатками пиримидиновых оснований в ДНК (образование димеров тимина; рис. 5-32). Все перечисленное выше - это лишь небольшая часть тех многочисленных изменений, которые происходят спонтанно в нашей ДНК. Большинство из них должно было бы привести либо к выпадению одной или нескольких пар оснований в дочерней цепи ДНК после цикла репликации, либо к замене пары оснований (например, каждое дезаминирование С → U должно было бы вызвать в конце концов замену пары C-G на пару Т-А, поскольку U ведет себя сходно с Т и образует комплементарную пару с А). Как мы уже знаем, такие изменения, если бы они происходили достаточно часто, имели бы роковые последствия для живых организмов. 5-14 5.2.7. Стабильность генов обеспечивается репарацией ДНК [21] Хотя в ДНК любой клетки человека под влиянием тепловой энергии происходят ежедневно тысячи случайных изменений, за год в каждой клетке накапливается (если только вообще накапливается) лишь очень небольшое число стабильных изменений нуклеотидной последовательности ДНК. Мы знаем теперь, что среди множества случайных замен оснований в ДНК лишь одна на тысячу приводит к возникновению мутации, все же остальные повреждения очень эффективно ликвидируются в процессе репарации ДНК. Все репарационные механизмы основаны на том, что в клетке имеются две копии генетической информации - по одной в каждой из двух цепей молекулы ДНК. Если нуклеотидная последовательность одной из цепей случайно оказывается измененной, информация не утрачивается, поскольку вторая ее копия хранится в нуклеотидной последовательности другой цепи ДНК. Из схемы на рис. 5-33 видно, что основной путь репарации ДНК включает три этапа. 1. Измененный участок поврежденной цепи ДНК распознается и удаляется при помощи специфических ферментов, носящих название ДНК-репарирующих нуклеаз; они осуществляют гидролиз фосфодиэфирных связей между поврежденными нуклеотидами и остальной частью молекулы ДНК, в результате чего в спирали ДНК в этом месте возникает брешь. 2. Другой фермент, ДНК-полимераза, связывается с 3'-концом поврежденной цепи ДНК и заполняет эту брешь путем присоединения одного нуклеотида за другим, копируя информацию, содержащуюся в «хорошей» (матричной) цепи. 3. В заключение фермент, называемый ДНК-лигазой, «сшивает» ДНК и тем самым завершает восстановление интактной молекулы. Рис. 5-32 . Образование тиминового димера распространенный тип повреждения ДНК под действием ультрафиолетовых лучей (в частности, пол действием солнечного света). Подобный димер способны образовать два любых соседних пиримидиновых основания (С или Т). Рис. 5-33. Три этапа репарации ДНК. На первом этапе вырезается поврежденный участок, на втором и третьем этапах происходит восстановление исходной нуклеотидной последовательности ДНК. ДНК-полимераза заполняет брешь, возникшую вследствие удаления поврежденной части цепи (2-й этап), а ДНК-лигаза сшивает разрыв, оставшийся в «исправленной» цепи (3-й этап). Сшивание осуществляется путем восстановления разорванной фосфодиэфирной связи (см. рис. 5-35). 282 Рис. 5-34. Фермент ДНК-полимераза. А. Реакция, катализируемая ДНК-полимеразой. Этот фермент катализирует поэтапное присоединение дезоксирибонуклеотидов к 3'-концу полинуклеотидной (затравочной) цепи, спаренной с другой (матричной) полинуклеотидной цепью. Таким образом, новая цепь ДНК растет в направлении 5' → 3'. Поскольку каждый прибывающий дезоксирибонуклеозидтрифосфат должен спариться с матричной цепью, для того чтобы его могла узнать ДНК-полимераза, именно матричная цепь определяет, какой из четырех возможных дезоксирибонуклеотидов (А, С, G или Т) присоединится к 3'-концу синтезируемой цепи. Как и в случае РНК-полимеразы, движущей силой реакции служит значительное выгодное изменение свободной энергии (см. рис. 5-2). Б. Структура ДНК-полимеразы Е. coli, определенная методом рентгеноструктурного анализа. ДНК-полимераза изображена здесь в момент участия в синтезе ДНК. (С любезного разрешения Тот Steitz.) |