Молекулярное фенотипирование мочи на основе протеомных методов исследования. нир иновации ъ. Научно исследовательская работа Молекулярное фенотипирование мочи на основе протеомных методов исследования

• Название: Научно исследовательская работа Молекулярное фенотипирование мочи на основе протеомных методов исследования
• Анкор: Молекулярное фенотипирование мочи на основе протеомных методов исследования
• Дата: 17.01.2022
• Размер: 49.71 Kb.
• Имя файла: нир иновации ъ.docx
• Тип: Исследовательская работа; #334079

ФГБОУ ВО «Волгоградский государственный медицинский университет»

Министерства здравоохранения Российской Федерации

Кафедра внутренних болезней педиатрического

и стоматологического факультетов

Научно исследовательская работа

Молекулярное фенотипирование мочи на основе протеомных методов исследования

Выполнил: студент

Пименова Наталья Олеговна

педиатрического факультета

4 курс 9 группа

Проверил:

Доцент, К.м.н.

Фабрицкая Светлана Валерьевна

Волгоград, 2019 г.

Оглавление

Введение 3

Цель 3

Определения 4

Протеиновое фенотипирование 5

Иммуноферментный анализ 7

Этапы и анализ результатов протеомного анализа мочи 9

Трудности интерпретации белкового состава мочи человека протеомными методами 10

Трудности интерпретации результатов количественной протеомики мочи 11

Введение

Стандартные методы диагностики, такие как, определения уровня КФК и общий анализ мочи, не всегда могут дать полный объем информации о поражений почек, поэтому были придуманы новые методы, позволяющие более точно определить фактор, область и тяжесть поражения не только почек, но и других органов. И одним из таких методов является двухмерный электрофорез на полиакриловом геле, позволяющий определить протеиновый состав мочи человека, и разделить их на фенотипы.

Цель

изучить методы молекулярного фенотипирования мочи. Особенности протеинового состава мочи.

Определения

Двумерный электрофорез в поли­акриламидном геле – разделение сложных смесей белков, в котором сочетаются электрофорез белков в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия и изоэлектрическое фокусирование. Данный метод увеличивает разрешение одномерного гель-электрофореза, а также позволяет исследовать неканонические структуры, возникающие в сверхспирализованной молекуле кольцевой ДНК. Оценить размер молекул помогут маркеры молекулярных масс. [3].

Масс-спектрометрия - метод анализа вещества путем определения массы (чаще, отношения массы к заряду m/z) и относительного количества ионов, получаемых при ионизации исследуемого вещества или уже присутствующих в изучаемой смеси. Совокупность значений m/z и относительных величин токов этих ионов, представленная в виде графика или таблицы. [5]

Протеомный анализ - направлен на одновременное изучение многих индивидуальных белков, совокупность которых составляет определенную систему, что характеризует исследуемый объект в целом. [4]

Протеиновое фенотипирование

Одним из направлений совершенствования методов персонализированной медицины является клиническая протеомика, задачи которой - поиск биомаркеров различных заболеваний. Прежде всего - это протеомика жидкостей тела человека, крови и мочи. Белки, выявляемые в моче, имеют различное происхождение: одни из них фильтруются из плазмы крови, другие поступают из мочевого тракта.

Считается, что белки мочи неплазменного происхождения составляют примерно 50% от всех белков мочи. К ним относятся белки, поступающие из мочеточника, мочевого пузыря, мочеиспускательного канала, добавочных половых желез и почек. Сейчас протеомными методами в моче обнаруживают более 3 тыс. различных белков. Это открывает значительные возможности для поиска биомаркеров, откликающихся на заболевание почек или мочеполового тракта, таких, например, как почечная недостаточность в результате гипертонической и диабетической нефропатии, врожденной обструктивной нефропатии, волчаночном нефрите, уролитиазе и при недержании мочи.

Полученные результаты исследования белкового состава мочи подтвердили перспективность использования и диагностическое значение целого ряда мочевых молекулярных маркеров для оценки состояния почечной паренхимы, мочевыводящих путей, заболеваний сердечно-сосудистой системы и др.

В современных руководствах и клинических рекомендациях, как отечественных, так и зарубежных, до настоящего времени в диагностике заболеваний почек насчитывается только несколько маркеров повреждения паренхимы почек: повышение мочевины, креатинина, электролитные нарушения, снижение скорости клубочковой фильтрации, другие изменения в анализах мочи (альбуминурия, протеинурия и др.). Как показывают многочисленные исследования, высокий сывороточный креатинин не всегда специфичен для повреждения почек. Его уровень может изменяться в зависимости от многих не ренальных факторов (возраст, пол, мышечная масса, статус обезвоживания и др.). Показано, что до 50% ренальных функций может быть утрачено еще до повышения уровня креатинина. То есть уровень креатинина не отражает нарушение функции почек до того момента, пока не разовьется патологическое состояние. Поиск надежных, специфичных, доступных лабораторных маркеров, которые могут широко применяться в клинической практике, на ранних стадиях поражения почек представляет собой одно из актуальных направлений исследований. [2]

Молекулярное фенотипирование мочи пациентов с ХГН выполнено на основе протеомных методов исследования - двумерный электрофорез в поли­акриламидном геле (префракционирование), масс-спектрометрия. Биоинформационный анализ межмолекулярных взаимо­действий проводился на основе интегрированных баз данных Integra, Entrez, SWISS-PROT, OWL, NRDB, PROSITE, PRINTS, PDB. Обязательным условием включения белка-маркера в диагностический профиль являлся показатель “покрытия сиквенса” при анализе масс-спектрограмм, который составил более 15 %.

В ходе протеомного анализа нами было выделено более 500 белков. Часть из них удалось классифицировать на функцио­нальные группы, составившие молекулярные профили мочи пациентов с ХГН:

1. Белок, регулирующий процессы свобод­норадикального окисления в нефроците, участник систем детоксикации и элиминации (глицин-амидинотрансфераза);

2. Белки - участники метаболизма в нефроцитах (амидинотрансфераза, агматиназа, лактатдегидрогеназа А, пируват-киназа, мышечная форма);

3. Белки, регулирующие клеточный рост, реакции протеолиза в клетке, процессинг нейрогормональных факторов, процессы ангиогенеза и адгезии клеток (толлоидоподобный белок 2, эритропоэтин, глутатион-S-трансфераза);

4. Белки, регулирующие активность рецепторных структур нефроцитов, сосудов почек (рецептор к эпидермальному фактору роста);

5. Структурные белки почечной ткани (уромодуллин);

6. Транскрипционные факторы, регулирующие активность ядра клетки (метил-CpG-связывающий белок 2, изоформа В);

7. Иммунные белки почечной ткани и белки - участники иммунновоспалительных процессов (комплемент C4B, пероксиредоксин 1, β-дефензин-1);

8. Транспортные белки (трансферрин, РСБ). [1]

Каждая молекула белка в функциональной группе взаи­модействует с другими молекулами белков, реализуя межмолекулярные взаимодействия. Например, плотность рецепторов к эритропоэтину при ХГН значительно уменьшается, что приводит к развитию анемии. Эритропоэтин также взаимодействует с белками GATA1 и GATA2, которые совместно стимулируют синтез гемоглобина и дифференцировку эритроцитов. Уменьшение передачи сигнала от эритропоэтина к транскрипционным факторам GATA1 и GATA2 при ХГН также является важным патогенетическим обоснованием развития анемии. Анализ межмолекулярных взаимодействий иммунных белков почечной ткани и белков - участников иммунновоспалитель­ных процессов позволяет обнаруживать потенциальные маркеры, которые могут, как определять положительную динамику в развитии аутоиммунного процесса, так и характеризовать его прогрессирование.

Идентифицированы и более редкие протеомы, характерные для пациентов с МГН и МПГН. Так, найден Integrin alpha-7, который указывает на повышенный риск развития рака или повышенный риск рецидива рака, в частности, предстательной железы, глиобластомы мультиформной, леймиосаркомы или гепатоцеллюлярной карциномы.

Определен белок β-дефензин-1, относящийся к семейству дефензинов. Он обладает бактерицидной и цитотоксической активностью, вырабатывается нейтрофилами. Повышенная экспрессия β-дефензина-1 у части пациентов с ХГН свидетельствует о наличии положительного прогноза течения заболевания в связи с блокадой этим белком активации иммуновоспалительного процесса в ткани почек. Снижение экспрессии β-дефензина-1 у оставшейся части пациентов позволяет верифицировать ХГН как быстропрогрессирующий вариант течения заболевания. У пациентов с ХГН увеличение экспрессии β-дефензина-1 может сопровождаться повышенной экспрессией белка CCR6, который в свою очередь способствует формированию нодулярных воспалительных инфильтратов в почечной ткани. [2]

Иммуноферментный анализ

Широкое внедрение в клиническую практику методов иммуноферментного анализа в настоящее время привело к появлению целого ряда исследований, в которых повышенные концентрации в моче интерлейкинов IL-1 в, IL-6, IL-8, рецепторного антагонониста IL-1 (IL-1RA), фактора некроза опухолей (TNF-a), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), моноцитарного хемоаттрактантного белка-1 (МСР-1) и С-реактивного белка (CRP) в моче, определенные методом иммуноферментного анализа (ИФА), были успешно использованы в качестве показателей активности воспалительного процесса и фиброзной трансформации тубулоинтерстициальной ткани почек при пиелонефритах.

Показано, в частности, что количественный анализ IL-6, IL-8, МСР-1, IL-1RA и CRP в моче больных первичным пиелонефритом позволяет с высокой чувствительностью и специфичностью диагностировать ранние стадии развития воспаления, а VEGF -определить степень ишемии почечной паренхимы и прогнозировать развитие интерстициального фиброза. Также выявлено, что определение концентрации ряда цитокинов и CRP в моче может быть широко использовано в клинико-диагностических лабораториях для оценки выраженности воспалительных процессов в мочевыводящих путях и контроля эффективности нефропротективной терапии. Установлено, что для диагностики прогрессирования заболеваний почек может быть использовано определение в моче провоспалительных цитокинов и хемокинов, а для оценки ишемии почечной паренхимы -анализ фактора роста эндотелия сосудов и матриксных металлопротеиназ (ММР) с помощью коммерческих наборов реагентов для ИФА .

Вышеупомянутые белки мочи приобретают важное клиническое значение и рассматриваются в качестве маркеров тяжести, прогрессирования и исхода заболеваний, приводящих к формированию хронической болезни почек. В экспериментальных и клинических исследованиях определен еще ряд лабораторных маркеров, определяемых в сыворотке крови и моче, которые могут отражать степень повреждения почечной ткани и развитие процессов тубулоинтерстициального фиброза до наличия нарушения функции почек, определяемых рутинными методами, указанными в клинических рекомендациях по диагностике и лечению заболеваний почек. Так, белок, связывающий витамин D, ретинол-связывающий белок, 62-микроглобулин и альфа1-микроглобулин, считаются мочевыми маркерами канальцевой дисфункции и позволяют предположить патологическое отклонение от нормальной канальцевой реабсорбции. В последние годы предложен ряд биомаркеров, которые определяются и в крови и моче, и могут быть использованы для оценки повреждения почек на ранних стадиях. Большинство биомаркеров представляют собой соединения и белки, экскретируемые канальцевым аппаратом почки при его повреждении различными агентами (бактериальными и т.д.).

Цистатин С/Cystatin C в крови, рассматриваемый как потенциальный ранний биомаркер острого повреждения почек. Однако цистатин C в настоящее время не считается непосредственным маркером почечного тубулярного повреждения, а скорее альтернативным креатинину, более точным тестом для оценки скорости клубочковой фильтрации. Также нейтрофильный желатиназно-ассоциированный липокалин/Neutroрhil geletinase-associ-ated lipocalin (NGAL), определяемый в моче, имеет прямую корреляционную связь с уровнями креатинина, величиной СКФ, активностью ферментов мочи (ЛДГ, ЩФ). Молекула почечного повреждения -1 (Kidney injury molecule-1, KIM-1) также имеет высокую чувствительность для выявления формирующегося острого повреждения почек. Уровни К1М-1 в моче относятся к наиболее прогностически значимым маркерам неблагоприятного исхода заболевания. Противовоспалительный цитокин (интерлейкин 18,Urinary interleukin-18 (IL-18) считается маркером агрессивного нефротоксического воздействия проводимой терапии. [2]

Этапы и анализ результатов протеомного анализа мочи

- Преаналитический этап- сбор мочи, методы проведения пробоподготовки. Установлено, что аналитическая воспроизводимость исследования белкового состава мочи масс-спектрометрическими методами не зависит от продолжительности замораживания, образец остается стабильным в течение нескольких лет, даже при хранении при -20 °C. Воспроизводимость поддерживается и в образцах, сохраняемых до 5-6 часов при комнатной температуре, или до трех дней при 400С, за счет небольшого количества про-теаз в данном биологическом материале. Пробоподготовку для дальнейшего анализа протеомного состава мочи осуществляют согласно стандартному протоколу (протокол обработки мочи для скрининга, HUPO-2007, Сеул, Корея).

- Аналитический этап - при получении масс-спектров применяют различные хромато-масс-спек-трометрические системы. Например, система может состоять из хроматографа Agilent 1100 (Agilent Technologies Inc., США) и гибридного масс-спектрометра LTQ-FT Ultra (Thermo, Германия). В этом случае хроматографическое разделение смеси белков после трипсино-лиза проводят на базе нанопоточного высокоэффективного жидкостного хроматографа (нано-ВЭЖХ) Agilent 1100 (Agilent Technologies Inc., Санта-Клара, США). Для градиентной хроматографии применяют home-made колонку с использованием капилляра-эммитера (Pico-tip, New Objective Inc., США), описанную Y. Ishihama и др..

Как правило, из каждого образца мочи получают два образца триптической смеси, которую анализируют трижды на масс-спектрометре. Для последующего анализа отбираются лишь те белки, которые были обнаружены в двух или трех повторах. Целесообразность такой «строгости» оспаривается рядом специалистов, работающих с образцами мочи (частные дискуссии). Их аргументация сводится к доводу, что если в образце однажды (в одном из прогонов) был достоверно идентифицирован тот или иной белок, то это свидетельствует о том, что он есть в образце, и скорее надо критиковать те масс-спектрометрические прогоны, в которых он не выявлялся. В качественной протеомике мочи о динамике изменения протеома судят по частоте встречаемости белков в образцах, считая, что факт обнаружения белка в образце, при сохранении чувствительности LC/MS метода, связан с его концентрацией.

- Постаналитический этап - применение комплекса современных биоинформационных технологий, включающих в себя:

1. Поиск и идентификация белков по базе данных IPI-human при помощи программы Mascot;

2. Обработка с помощью уникальной программы, разработанной в лаборатории профессора Е.Н. Николаева, результатов Mascot-поиска;

3. Применение комплекса биоинформационных ресурсов для определения места образования, функции выявленных в моче белков, а также для анализа биологических процессов, в которых они участвуют;

4. Анализ ткане-специфичности экспрессии и тканевой локализации белков; определение молекулярных функций, биологических процессов и клеточной локализации; сверхпредставленности биологических процессов, молекулярных функций, связанных с выявленными белками; построение ассоциативных генных сетей между белками. [1]

Трудности интерпретации белкового состава мочи человека протеомными методами

Существуют объективные и до сих пор не преодоленные трудности в интерпретации результатов исследования протеома мочи, в определенной степени сдерживающие широкое использование технологий протеомики в клинической области. Их можно условно разделить на следующие категории.

1. Высокая индивидуальная («продольная») вариабельность протеома мочи. При сопоставлении белкового состава образцов мочи одного и того же человека (здорового или пациента в процессе диагностики, или мониторинга терапии) необходимо увидеть значимые изменения в составе и по ним сделать заключение того или иного характера. При этом нельзя не принимать во внимание, что белковый состав мочи, главным образом, зависит от:

• 
  Белкового состава крови (вариабельность которого, при изучении методами протеомики на основе масс-спектрометрии, составляет около 25%. (По данным О.М. Трифоновой индивидуальная вариабельность белкового состава крови здоровых добровольцев в контролируемых условиях, исследованная на протяжении 3 недель, составила 22±13%.)
  
• 
  Вариабельность белкового состава мочи зависит также от актуальной функции почки, как эффекторного органа поддержания водно- электролитного гомеостаза внутренней среды организма. Этот аспект практически не исследован, за исключением небольшого числа работ, выполненных с участием здоровых добровольцев или пациентов разных нозологических групп. [1]
  

Трудности интерпретации результатов количественной протеомики мочи

Затруднение использования количественных протеомных данных имеет и другой аспект. Почка является исполнительным органом физиологической системы, которая поддерживает важнейшие гомеостатические константы внеклеточной жидкости организма. Формирование мочи того или иного состава в каждый конкретный момент времени определяется насущными актуальными задачами, входящими в эту функцию почки. Достаточно часто, например, при изменении уровня поступления жидкости в организм (увеличение или уменьшение в силу разных причин объема выпиваемой жидкости), или во время длительного перерыва в питье (ночной сон), а также в других обычных условиях жизни - почка усиливает выведение воды, или задерживает воду, реабсорбируя ее назад, в организм. Эти реакции по разбавлению или концентрированию мочи, а также изменению ее электролитного состава (концентраций Na, K, Ca, Cl) не могут не влиять на содержание в моче различных белков. Эти предположения находят экспериментальное подтверждение.

Так, А.В. Кутиной в экспериментах со здоровыми добровольцами во время введения водной нагрузки показано, что скорость экскреции альбумина остается в пределах нормальных значений - до 20 мкг/мин, а суммарная экскреция белков растет. Это свидетельствует о выраженной селективности деятельности канальцев. Т.е. экскреция альбумина за 2 ч после приема воды возросла в меньшей степени, чем суммарная экскреция белков, что приводит к тому, что доля альбуминов в экскретируемом общем белке снижается с 4,4% до 1,5%. Следовательно, либо прирост выделения белков зависит от неодинакового увеличения фильтрации различных белков в клубочках, либо у человека достаточно велико значение максимальной реабсорбции альбуминов в проксимальном канальце по сравнению с другими белками, и поэтому альбумины в большей степени реабсорбируются, чтобы быть сохранными для нужд организма. По-видимому, при водной нагрузке и увеличении диуреза растет выделение белков почкой и меняется соотношение различных белков в моче по сравнению с исходным периодом. Сравнительное исследование экскреции белка почкой при разных типах диуреза у животных (Rattus norvegicus var. albino, Rana temporaria) и человека свидетельствует, что полиурия сопровождается увеличением выведения с мочой белков, которое, вероятно, зависит от участия V1-рецепторов, изменения продукции N0, но не ангиотензина II. [2]

Список литературы:

1. 
   «Библиотека врача», «Протеомный спектр мочи пациентов с хроническим гломерулонефритом» Гасанов М.З., Батюшкин М.М., Терентьев В. П., Садовничая Н.А. 5 стр, 2012 год. (статья)
   
2. 
   «Экспериментальная и клиническая урология», «Значение протеомного состава мочи при заболеваниях мочевыводящих путей», Захарова Н.Б., Пастушкова Л.Х., Ларина И.М., Каширина Д.Н., Лях Р.Н., Попков В.М. , 8 стр., 2017. (статья)
   
3. 
   http://thesaurus.rusnano.com/wiki/article1579
   
4. 
   http://humbio.ru/humbio/tarantul_sl/00000715.htm
   
5. 
   http://www.xumuk.ru/encyklopedia/2448.html