Антибиотики. Методичка по антибиотикам. Нечаева О. В., Швиденко И. Г., Шуб Г. М
 Скачать 0.53 Mb.
|
|
Enterococcus spp. к гликопептидам VanA, VanB и VanC, различающимся по уровню устойчивости к двум основным препаратам: ванкомицину и тейкопланину. Для фенотипа VanA характерен высокий уровень устойчивости к ванкомицину и тейкопланину, для VanB - вариабельная резистентность к ванкомицину и чувствительность к тейкопланину. Фенотип VanC характерен для E.gallinarum, E.casseliflavus и E.flavescens, проявляющих природно низкий уровень устойчивости к ванкомицину. Происхождение генов, обеспечивающих устойчивость к гликопептидам, не ясно, скорее они приобретены энтерококками в результате обмена генетическим материалом с природно устойчивыми видами. К таковым относятся Pediococcus, Lactibacillus и Leuconostoc, устойчивость этих микроорганизмов к гликопептидам связана с особенностями структуры предшественника пептидогликана, обладающего низкой аффинностью к антибиотикам. Устойчивость энтерококков к гликопептидам является серьезной проблемой в отделениях реанимации и интенсивной терапии в США и Западной Европе. Чаще всего устойчивость отмечают у штаммов E.faecium, ее частота может достигать 15-20%. Достоверных данных о выделении ванкомицинрезистентных энтерококков в России нет. 56 Проблемой устойчивости к гликопептидам является резистентность стафилококков. Крайняя потенциальная опасность появления и распространения резистентности у этих микроорганизмов связана с тем, что гликопептиды являются основными средствами терапии тяжелых инфекций, вызванных метициллинрезистентными штаммами. Устойчивость к гликопептидам на сегодняшний день документирована у Staphylococcus haemoliticus и Staphylococcus epidermidis, в большей степени она проявлялась в отношении тейкопланина, чем ванкомицина. Имеется также сообщение о выделении клинического штамма S.aureus со сниженной чувствительностью к тейкопланину. Механизм устойчивости стафилококков к гликопептидным антибиотикам пока не ясен, однако он явно отличается от такового у энтерококков. В качестве эффективных средств терапии инфекций, вызванных метициллинрезистентными стафилококками, устойчивыми к гликопептидам, можно рассматривать комбинированный стрептограминовый антибиотик синерцид и некоторые другие соединения, находящиеся на разных стадиях изучения. Механизмы устойчивости бактерий к амфениколам Основным механизмом устойчивости к хлорамфениколу является инактивация АБП, которая реализуется за счет ацетилирования с помощью ферментов хлорамфениколацетилтрасфераз. Гены, кодирующие эти ферменты локализуются на плазмидах и входят в состав транспозонов в ассоциации с генами устойчивости к другим АМП. Механизмы устойчивости бактерий к тетрациклинам Наиболее распространенным механизмом устойчивости к тетрациклинам среди грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов является Активное выведение АБП из микробной клетки (эффлюкс). Детерминанты резистентности обычно локализованы на плазмидах, что обеспечивает их быстрое внутри- и межвидовое распространение. Часть генов и соответствующие 57 белки (TetA - TetE) распространены среди грамотрицательных бактерий, другие (TetK, TetL) среди грамположительных. Для тетрациклинов характерен такой механизм устойчивости, как защита мишени. Известно семейство защитных белков, которые позволяют бактерии синтезировать белок, несмотря на связывание с рибосомой молекулы тетрациклина. Механизм подобной защиты неизвестен. Описано, по меньшей мере, 5 генов, кодирующих защитные белки, они распространены среди грамотрицательных и грамположительных бактерий и детерминируют устойчивость ко всем тетрациклинам. Частота устойчивости к тетрациклинам среди клинически наиболее значимых микроорганизмов достаточно высока, что не позволяет рассматривать их как средства выбора для лечения большинства инфекций. Механизмы резистентности к противогрибковым препаратам Повышение роли грибов в этиологии госпитальных и некоторых внебольничных инфекций привело к внедрению в клиническую практику значительного числа новых препаратов и их широкому применению, это, в свою очередь, неизбежно привело к формированию устойчивости к используемым препаратам. Поскольку грибы, в отличие от бактерий, являются эукариотическими организмами, то для лечения вызываемых ими инфекций необходимо использовать препараты с принципиально другими мишенями и механизмами действия. Фактором, существенно затрудняющим изучение устойчивости грибов, является недостаточная стандартизация методов оценки их чувствительности к противогрибковым препаратам и трудности в обосновании критериев чувствительности. Полиены Поскольку мишенью действия полиенов являются структурные элементы клетки грибов, а не ферменты, то формирование устойчивости может быть результатом сложных генетических процессов, приводящих к изменению 58 биосинтеза компонентов мембраны. Вероятность таких событий относительно невелика, с чем и связана низкая частота устойчивости к полиенам. Биохимия и генетика устойчивости к полиенам изучена недостаточно, но имеющиеся данные в целом поддерживают гипотезу о снижении содержания эргостерола в цитоплазматической мембране и о повышении содержания его аналогов в устойчивых штаммах. Основные причины увеличения антибиотикорезистентности и методы ее преодоления Наиболее важными причинами, влияющими на рост устойчивости микроорганизмов к антимикробным лекарственным средствам, являются: 1. назначение химиотерапевтических препаратов при отсутствии показаний, например, лечение вирусных инфекций антибиотиками; 2. неоправденное применение современных дорогостоящих препаратов широкого спектра действия вместо более дешевых лекарственных средств направленного действия; 3. неправильное установление дозировки и длительности лечения; 4. самолечение; 5. применение в лечебных учреждениях антисептиков и дезинфектантов, которые оказывают выраженное селективное действие на микробную популяцию и способствуют отбору резистентных штаммов возбудителей; 6. использование антибиотиков в сельском хозяйстве для лечения и в качестве стимуляторов роста птицы и крупного рогатого скота; применение такой продукции способствует повышению уровня резистентности представителей нормальной микрофлоры человека. В последнее время принят ряд документов, регламентирующих проведение в лечебных учреждения различных стран мира разумной антибактериальной политики, направленной на снижение роста резистентности возбудителей к антимикробным препаратам. Наиболее важными документами являются 59 «Копенгагенские рекомендации», принятые странами Европейского союза в 1998 г., международная «Декларация по борьбе с антимикробной резистентностью» (Торонто, 2000 г.) и разработанная ВОЗ «Глобальная стратегия по сдерживанию роста устойчивости микроорганизмов к антиимкробным препаратам» (Женева, 2001). Основные положения этих документов сводятся к следующему: 1. Рациональное назначение антимикробных препаратов, т.е. строго по показаниям и в соответствии с чувствительностью возбудителей к лекарственным средствам. 2. Разработка и внедрение в практику образовательных программ по антибиотикам для медиков и фармацевтов, а также руководств по рациональной химиотерапии для врачей различных специальностей. 3. Создание во всех лечебных учреждениях комитетов по контролю за назначением антимикробных препаратов. 4. Проведение постоянного микробиологического мониторинга за уровнем резистентности микроорганизмов в каждом лечебном учреждении и доведение результатов исследования до лечащих врачей. 5. Проведение просветительской работы среди населения о вреде самолечения, запрещение рекламы антибиотиков в средствах массовой информации и продажи их в аптеках без рецепта врача. 6. Прекращение применения антибиотиков в качестве стимуляторов роста в сельском хозяйстве. 7. Разработка и внедрение в лечебную практику новых антимикробных препаратов. Методы определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам Определение чувствительности микроорганизмов – возбудителей инфекционных заболеваний к антибактериальным препаратам приобретает все более важное значение в связи с появлением и широким распространением 60 антибиотикорезистентности у бактерий. Исследование чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам осуществляется для решения следующих задач: 1. обоснование целенаправленной индивидуальной антибактериальной терапии для лечения конкретной инфекционной болезни; 2. обоснование эмпирической терапии отдельных нозологических форм инфекционных болезней в пределах лечебных учреждений или географических регионов; 3. осуществление наблюдения за распространением антибиотикорезистентности в отдельных учреждениях или географических регионах; 4. исследование новых химических соединений на наличие антибактериальной активности. В ходе повседневной деятельности в бактериологических лабораториях из различных биологических материалов и объектов внешней среды выделяют множество бактерий, относящихся к различным таксономическим группам. Обязательному исследованию на чувствительность к антибактериальным препаратам подлежат все микроорганизмы, выделенные из первично стерильных жидкостей, органов и тканей человека и животных до начала лечения. Практически важной задачей является выявление приобретенной резистентности к антибактериальным препаратам природно-чувствительных к ним микроорганизмов. Исследованию по оценке антибиотикочувствительности подлежат чистые культуры микроорганизмов или материал изолированных колоний с плотных питательных сред после первичного посева образца клинического материала, в последнем случае параллельно необходимо провести идентификацию культуры. Современные стандартизованные методы определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам подразделяют на две группы: 1. Диффузные методы: 61 - диско-диффузный метод; - Е-тест. 2. Методы серийных разведений антибиотика в питательной среде: - разведение препарата в жидкой питательной среде; - разведение препарата в плотной питательной среде. По величине МПК все микроорганизмы можно разделить на три категории: чувствительные, умеренно устойчивые и устойчивые. Диффузные методы Несомненным достоинством диффузионных методов является простота тестирования и доступность выполнения в любой бактериологической лаборатории. Однако с учетом высокой стоимости Е-тестов для рутинной работы обычно используют диско-диффузионный метод. Диско-диффузный метод Диффузные методы определения чувствительности основаны на диффузии антибактериальных препаратов из носителя в плотную питательную среду. Стандартизованную суспензию исследуемого микроорганизма, соответствующую стандарту мутности 0,5 по MсFarland, засевают «газоном» на питательную среду. На поверхность посева укладывают стандартные бумажные диски, пропитанные антибиотиками, концентрации которых соответствуют требованиям ВОЗ. Диффузия антибиотика в агар приводит к формированию зоны подавления роста микроорганизмов вокруг дисков. После инкубирования посева в термостате оценивают чувствительность микроорганизма (рис. 5). Если исследуемый микроорганизм чувствителен к одному из препаратов, вокруг соответствующего диска образуется зона задержки роста, где концентрация антибиотика превосходит минимальную подавляющую концентрацию (МПК). Устойчивые к препарату культуры не образуют стерильных зон. Однако диффузный метод позволяет лишь косвенно судить о величине МПК, а результатом исследования является отнесение микроорганизма к одной из 62 категорий чувствительности (устойчивый, малоустойчивый, чувствительный, высокочувствительный штамм). Рис. 4. Определение чувствительности микроорганизмов диско-диффузионным методом. Е-тест Е-тест (от англ. ellips – эллипс, так как при наличии чувствительности образуется зона задержки роста эллиптической формы). Это модификация диско- диффузного метода, однако, пользуясь этим методом, можно определить МПК. Для реализации этого метода используют полоску Е-теста, содержащую градиент концентраций антибиотика от максимальной к минимальной (рис. 5). Полоски помещают на поверхность засеянной питательной среды. Если бактерии чувствительны к действию препарата, вокруг участков полоски, содержащих его ингибирующие концентрации, образуется эллипсовидная зона задержки роста, в месте пересечения которой с полоской Е-теста получают значение МПК. 63 Рис. 5. Определение чувствительности микроорганизмов с помощью Е-теста Метод серийных разведений в жидкой питательной среде Методы серийных разведений основаны на прямом определении основного количественного показателя, характеризующего микробиологическую активность антибактериальных препаратов – величины его МПК. МПК – минимальная концентрация, подавляющая видимый рост исследуемого микроорганизма в бульонной культуре или на плотной питательной среде. Принцип определения МПК основан на использовании двойных последовательных разведений концентраций антибиотика от максимальной к минимальной (например от 128 мкг/мл, 64 мкг/мл, и т.д. до 0,5 мкг/мл, 0,25 мкг/мл и 0,125 мкг/мл). При этом антибиотик в различных концентрациях вносят в жидкую питательную среду (бульон). Затем бактериальную суспензию определенной плотности, соответствующую стандарту мутности 0,5 по MсFarland, помещают в бульон с антибиотиком. После инкубации при температуре 37 о С проводят учет полученных результатов. Наличие роста микроорганизма в бульоне (помутнение бульона) свидетельствует о том, что данная концентрация антибиотика недостаточна, чтобы подавить его жизнеспособность. По мере увеличения концентрации антибиотика рост микроорганизма ухудшается. Первую наименьшую концентрацию антибиотика (из серии последовательных разведений), где визуально не определяется 64 бактериальный рост принято считать МПК. Измеряется МПК в мг/л или мкг/мл (рис. 6). МПК - наименьшая концентрация антибиотика (мг/л или мкг/мл), которая in vitro полностью подавляет видимый рост бактерий. Рис. 6. Определение значения МПК методом разведения в жидкой питательной среде. Несмотря на то, что метод серийных разведений является наиболее точным и информативным, его постановка в практических лабораториях сопряжена со значительными методическими трудностями. Прежде всего, речь идет о необходимости использования антибиотиков с известным уровнем активности, строгого соблюдения режимов хранения, тщательного выполнения контроля качества питательных сред, трудоемкости приготовления рабочих растворов антибиотиков. Метод серийных разведений в плотной питательной среде Этот метод аналогичен методу серийных разведений в жидкой питательной среде, однако определение МПК требует более сложных манипуляций. Готовят двойные серийные разведения препарата от 1:10000 до 1:320000, затем вносят по 1 мл каждого разведения в пробирки, содержащие расплавленный и остуженный до 45 0 С агар. Затем содержимое пробирок быстро выливают в стерильные чашки Петри и после застывания питательной среды засевают 65 исследуемый микроорганизм. После инкубации определяют МПК по отсутствию роста на чашках, содержащих наименьшие концентрации препарата. Существуют два подхода к интерпретации результатов определения чувствительности: микробиологический и клинический. Микробиологическая интерпретация основана на анализе распределения значений концентраций антибиотика, подавляющих жизнеспособность бактерий. Клиническая интерпретация основана на оценке эффективности антибактериальной терапии. Оценка чувствительности к противогрибковым препаратам В связи с появлением случаев неэффективности противогрибковой терапии возникла реальная практическая потребность в определении чувствительности грибов к соответствующим препаратам. К сожалению, возможности для решения этой задачи весьма ограничены. В качестве стандартного рассматривают метод серийных разведений на среде RPMI 1640, воспроизводимые результаты обеспечивают ряд других методов и некоторые коммерческие тест-системы. Следует отметить, что использование нестандартизованных ("домашних" или коммерческих) методов оценки чувствительности грибов может привести к получению заведомо ложных результатов и серьезным ошибкам при выборе препаратов для лечения. |