перевод статьи по гистологии. перевод гистология. Новый третий сетчатый слой миометрия соединяет продольные и циркулярные мышечные волокна потенциальный слой для координации сокращений матки
 Скачать 1.45 Mb.
|
|
Методы Приготовление реагентов Реагенты CUBIC были приготовлены, как описано [15].. Реагент CUBIC-1 был приготовлен в виде смеси 25% вес / вес (вес / вес) мочевины (Nacalai Tesque, 35904-45, Япония), 25% вес / объем (вес / объем) N, N, N ', N '-Тетракис (2-гидроксипропил) этилендиамин (Tokyo Chemical Industry, T0781, Япония) и 15% (мас. / Об.) Монопизооктилфениловый эфир полиэтиленгликоля (Triton X-100) (Nacalai Tesque, 25987-85, Япония). Реагент CUBIC-2 был приготовлен как смесь 50% (мас. / Об.) Сахарозы (Nacalai Tesque, 30403-55, Япония), 25% (мас. / Об.) Мочевины, 10% (мас. / Об.) 2, 20, 20 '-Нитрилотриэтанол (Wako, 145-05605, Япония) и 0,1% объем / объем (об. / Об.) Triton X-100. Оба реагента были приготовлены непосредственно перед использованием. Перед добавлением Triton X-100 все остальные химические вещества растворяли с помощью горячей мешалки при 60 ° C. На стадии смешивания добавляли дистиллированную воду, чтобы компенсировать испарение воды. После того, как все химические вещества, кроме Triton X-100, были растворены, Животные Мы использовали девять трансгенных мышей-самок, экспрессирующих EGFP под контролем промотора CAG (C57BL / 6-Tg) [22], и десять самок мышей дикого типа (CD-1 / ICR). Мышей CAG-EGFP умерщвляли в возрасте 6–12 месяцев, а мышей дикого типа - в возрасте 3–4 месяцев. Мышей дикого типа покупали в SLC (Хамамацу, Япония), и всех мышей выращивали в соответствии с обычным 12-часовым графиком свет / темнота. Все экспериментальные процедуры и условия содержания были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Экспериментального комитета университета Канадзавы, и за всеми животными гуманно ухаживали и обращались в соответствии с институциональными рекомендациями по экспериментам с животными. Протокол CUBIC для матки CUBIC выполняли, как описано ранее[15], с модификациями, о которых мы сообщали [17,18] (рис. 1a). После глубокой анестезии пентобарбиталом беременных мышей фиксировали транскардиальной перфузией с использованием 4% PFA / PBS и PI (Life Technologies, раствор 10 мг / мл), а затем выделяли матки. Изолированную матку дополнительно погружали в 4% PFA при 4 ° C на ночь. Затем фиксированные органы погружали в реагент CUBIC-1 при 37 ° C на 3 дня при осторожном встряхивании. После замены реагента CUBIC-1 орган погружали еще на 2 дня. Орган промывали 3 раза PBS при комнатной температуре при осторожном встряхивании, погружали в 20% сахарозу в PBS на один день и погружали в реагент CUBIC-2 на 2 дня. Для иммерсионного окрашивания ИП к реагенту CUBIC-1 добавляли 10 мг / мл ИП. Иммуноокрашивание Взрослых самок мышей глубоко анестезировали и транскардиально перфузировали 4% PFA в PBS, как описано ранее[29]. Для изготовления срезов матку частично рассекали, затем фиксировали путем погружения на ночь в тот же фиксатор, подвергали криозащите путем погружения в течение ночи в сахарозу, содержащую PBS, и заливали в соединение для оптимальной температуры резки (OCT) (Sakura Finetek, Япония) [17] . Срезы толщиной 14 мкм были сделаны с использованием криостата, проницаемого 0,5% Triton X-100 в PBS и инкубированы при 4 ° C в течение ночи с первым антителом [17 , 18] . После инкубирования при 37 ° C в течение 2 часов с вторичным антителом, конъюгированным с Alexa 488 или Cy3, и 1 мкг / мл Hoechst 33342, срезы промывали и закрепляли с помощью Mowiol (Sigma-Aldrich) [17, 18] . Для иммуноокрашивания использовали следующие антитела: кроличьи антитела против зеленого флуоресцентного белка (GFP) (Molecular Probe A-11122, 1: 500), крысиные антитела к CD31 (BD Pharmingen 550274, 1: 500), крысиные антитела против CD34. (Abcam ab8158, 1: 500), кроличьи антитела против альфа-актина гладких мышц (αSMA) (Abcam ab5694, 1: 200), кроличьи антитела против тубулина β-3 (TUBB3) (BioLegend PRB-435P, 1: 500) и мышиное антитело против тубулина β-3 (TUBB3), конъюгированное с Alexa488 (BioLegend A488-435L, 1: 500). Микроскопия и анализ изображений Анализ изображений выполнялся, как описано ранее[17,18]. Яркие изображения матки получали с помощью стереомикроскопа (MZ16F, Leica). Срезы тканей исследовали с помощью эпифлуоресцентного микроскопа (BZ-X710, Keyence). Трехмерные изображения прозрачных органов были получены с использованием светового микроскопа (Lightsheet Z.1, Carl Zeiss)[17,18] . Изображения матки были получены с использованием линзы объектива 5 × / 0,16 NA, а подробные изображения с разрешением одной клетки были получены с использованием линзы объектива 20 × / 1,0 NA для метода очистки. Трехмерные изображения анализировали с помощью программного обеспечения ZEN (Carl Zeiss) [17] Список литературы 1. Cha, J., Sun, X. & Dey, S. K. Mechanisms of implantation: strategies for successful pregnancy. Nat Med 18, 1754–1767, https://doi.org/10.1038/nm.3012 (2012). CAS Article PubMed PubMed Central Google Scholar 2. Agostinis, C. et al. Uterine Immunity and Microbiota: A Shifting Paradigm. Front Immunol 10, 2387, https://doi.org/10.3389/fimmu.2019.02387 (2019). Article PubMed PubMed Central Google Scholar 3. Ono, M. & Maruyama, T. Stem Cells in Myometrial Physiology. Semin Reprod Med 33, 350–356, https://doi.org/10.1055/s-0035-1563602 (2015). CAS Article PubMed Google Scholar 4. Gee, S. E. & Frey, H. A. Contractions: Traditional concepts and their role in modern obstetrics. Semin Perinatol, 151218, https://doi.org/10.1016/j.semperi.2019.151218 (2019). 5. Ravanos, K. et al. Factors implicated in the initiation of human parturition in term and preterm labor: a review. Gynecol Endocrinol 31, 679–683, https://doi.org/10.3109/09513590.2015.1076783 (2015). CAS Article PubMed Google Scholar 6. Bulletti, C. et al. The patterns of uterine contractility in normal menstruating women: from physiology to pathology. Ann N Y Acad Sci 1034, 64–83, https://doi.org/10.1196/annals.1335.007 (2004). ADS Article PubMed Google Scholar 7. Bulletti, C. et al. Characteristics of uterine contractility during menses in women with mild to moderate endometriosis. Fertil Steril 77, 1156–1161, https://doi.org/10.1016/s0015-0282(02)03087-x (2002). Article PubMed Google Scholar 8. Tamura, H. et al. Clinical outcomes of infertility treatment for women with adenomyosis in Japan. Reprod Med Biol 16, 276–282, https://doi.org/10.1002/rmb2.12036 (2017). 9. Kuijsters, N. P. M. et al. Uterine peristalsis and fertility: current knowledge and future perspectives: a review and meta-analysis. Reprod Biomed Online 35, 50–71, https://doi.org/10.1016/j.rbmo.2017.03.019 (2017). Article PubMed Google Scholar 10 Mayhew, T. M. A stereological perspective on placental morphology in normal and complicated pregnancies. J Anat 215, 77–90, https://doi.org/10.1111/j.1469-7580.2008.00994.x (2009). Article PubMed PubMed Central Google Scholar 11. Hama, H. et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci 14, 1481–1488, https://doi.org/10.1038/nn.2928 (2011). CAS Article PubMed Google Scholar 12. Ke, M. T., Fujimoto, S. & Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci 16, 1154–1161, https://doi.org/10.1038/nn.3447 (2013). CAS Article PubMed Google Scholar 13. , K. et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature 497, 332–337, https://doi.org/10.1038/nature12107 (2013). ADS CAS Article PubMed PubMed Central Google Scholar 14. Erturk, A. et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat Protoc 7, 1983–1995, https://doi.org/10.1038/nprot.2012.119 (2012). CAS Article PubMed Google Scholar 15. Susaki, E. A. et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell 157, 726–739, https://doi.org/10.1016/j.cell.2014.03.042 (2014). CAS Article PubMed Google Scholar 16. Dodt, H. U. et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat Methods 4, 331–336, https://doi.org/10.1038/nmeth1036 (2007). CAS Article PubMed Google Scholar 17. Kagami, K., Shinmyo, Y., Ono, M., Kawasaki, H. & Fujiwara, H. Three-dimensional visualization of intrauterine conceptus through the uterine wall by tissue clearing method. Sci Rep 7, 5964, https://doi.org/10.1038/s41598-017-06549-6 (2017). ADS CAS Article PubMed PubMed Central Google Scholar 18. Kagami, K., Shinmyo, Y., Ono, M., Kawasaki, H. & Fujiwara, H. Three-dimensional evaluation of murine ovarian follicles using a modified CUBIC tissue clearing method. Reprod Biol Endocrinol 16, 72, https://doi.org/10.1186/s12958-018-0381-7 (2018). CAS Article PubMed PubMed Central Google Scholar 19. Brody, J. R. & Cunha, G. R. Histologic, morphometric, and immunocytochemical analysis of myometrial development in rats and mice: I. Normal development. Am J Anat 186, 1–20, https://doi.org/10.1002/aja.1001860102 (1989). CAS Article PubMed Google Scholar 20. Roatesi, I., Radu, B. M., Cretoiu, D. & Cretoiu, S. M. Uterine Telocytes: A Review of Current Knowledge. Biol Reprod 93, 10, https://doi.org/10.1095/biolreprod.114.125906 (2015). CAS Article PubMed Google Scholar 21. Cretoiu, S. M., Cretoiu, D. & Popescu, L. M. Human myometrium - the ultrastructural 3D network of telocytes. J Cell Mol Med 16, 2844–2849, https://doi.org/10.1111/j.1582-4934.2012.01651.x (2012). Article PubMed PubMed Central Google Scholar 22. Okabe, M., Ikawa, M., Kominami, K., Nakanishi, T. & Nishimune, Y. ‘Green mice’ as a source of ubiquitous green cells. FEBS Lett 407, 313–319, https://doi.org/10.1016/s0014-5793(97)00313-x (1997). CAS Article PubMed Google Scholar 23. Qin, H. et al. Activation-induced cytidine deaminase expression in CD4+ T cells is associated with a unique IL-10-producing subset that increases with age. PLoS One 6, e29141, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0029141 (2011). ADS CAS Article PubMed PubMed Central Google Scholar 24. Noe, M., Kunz, G., Herbertz, M., Mall, G. & Leyendecker, G. The cyclic pattern of the immunocytochemical expression of oestrogen and progesterone receptors in human myometrial and endometrial layers: characterization of the endometrial-subendometrial unit. Hum Reprod 14, 190–197, https://doi.org/10.1093/humrep/14.1.190 (1999). CAS Article PubMed Google Scholar 25. Lutton, E. J., Lammers, W., James, S., van den Berg, H. A. & Blanks, A. M. Identification of uterine pacemaker regions at the myometrial-placental interface in the rat. J Physiol 596, 2841–2852, https://doi.org/10.1113/JP275688 (2018). CAS Article PubMed PubMed Central Google Scholar 26. Banciu, A. et al. Beta-Estradiol Regulates Voltage-Gated Calcium Channels and Estrogen Receptors in Telocytes from Human Myometrium. Int J Mol Sci 19, https://doi.org/10.3390/ijms19051413 (2018). 27. Janas, P., Kucybala, I., Radon-Pokracka, M. & Huras, H. Telocytes in the female reproductive system: An overview of up-to-date knowledge. Adv Clin Exp Med 27, 559–565, https://doi.org/10.17219/acem/68845 (2018). Article PubMed Google Scholar 28. Ullah, S. et al. Identification and characterization of telocytes in the uterus of the oviduct in the Chinese soft-shelled turtle, Pelodiscus sinensis: TEM evidence. J Cell Mol Med 18, 2385–2392, https://doi.org/10.1111/jcmm.12392 (2014). Article PubMed PubMed Central Google Scholar 29. Hoshiba, Y. et al. Sox11 Balances Dendritic Morphogenesis with Neuronal Migration in the Developing Cerebral Cortex. J Neurosci 36, 5775–5784, https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.3250-15.2016 (2016). CAS Article PubMed PubMed Central Google Scholar A novel third mesh-like myometrial layer connects the longitudinal and circular muscle fibers -A potential stratum to coordinate uterine contractions- Source: journal Scientific Reports 10 Article number: 8274 Place of publication: Nature Research Received: March 09, 2020 Accepted: April 30, 2020 Published: May 19, 2020 Authors: Kyosuke Kagami, Masanori Ono, Takashi Iizuka, Takeo Matsumoto, Takashi Hosono, Naomi Sekizuka-Kagami, Yohei Shinmyo, Hiroshi Kawasaki & Hiroshi Fujiwara Abstract Periodic myometrial contraction is one of the important uterine functions to achieve embryo implantation and parturition. Although it is well-known that the mammalian myometrium is composed of longitudinal (outer) and circular (inner) layers, the precise mechanisms that coordinate both muscular contractions to produce peristaltic movements remain unclear. Recently, by treatment with our modified Clear Unobstructed Brain Imaging Cocktails and Computational analysis (CUBIC) tissue-clearing method, we obtained well-contrasted three-dimensional images of the transparent murine ovary using enhanced green fluorescent protein (EGFP) transgenic mice and light-sheet microscopy. Consequently, to investigate accurate anatomical connections between outer and inner myometrial fibers, we observed whole structures of the myometrium using a transparent murine uterus. By this method, we identified a novel muscle layer, a middle layer of the myometrium, which anatomically connects the conventional outer longitudinal and inner circular muscles. This new layer was visualized as a mesh-like structure and this structure was observed throughout the whole uterus from proximal to distal sites. In this area, CD31-positive vessels were abundantly localized around the mesh-like muscle fibers. In addition, CD34-positive uterine telocytes and tubulin β-3-positive nerve fibers were closely located in this middle layer. These findings indicate the presence of a novel mesh-like stratum that connects longitudinal and circular muscle layers, and suggest its coordinating role in myometrial contractions. Introduction The uterus is a crucial reproductive organ for pregnancy and has several characteristics[1]. First, it houses the developing fetus, a semi-allograft of the mother, protecting the fetus from maternal immune attack[2]. Second, it enlarges during pregnancy to allow intrauterine fetal growth[3]. Third, it undergoes peristaltic contraction to achieve fetal delivery[4]. In general, the mammalian myometrium is composed of longitudinal (outer) and circular (inner) muscle layers. To flexibly adapt to fetal growth and adequately coordinate labor contraction, anatomical and functional communications between both muscle layers are important. Currently, inadequate uterine adaptation to fetal growth is known to lead to premature labor[5], while abnormal peristaltic myometrial contraction is considered to cause dysmenorrhea[6], endometriosis[7,8], and infertility[9]. However, the precise mechanisms coordinating the functions of both muscle layers remain unknown. To analyze the stereoscopic anatomy of reproductive organs, classical preparation of tissue sections and histological staining techniques have been performed. Although partial reconstruction of three-dimensional (3D) images based on these techniques is possible[10], it is difficult to obtain whole 3D images of the uterus by a classical technique using sequential tissue sections alone. Recently, several groups developed excellent tissue-clearing methods such as ScaleA2, See Deep Brain (SeeDB), CLARITY, 3D Imaging of Solvent-Cleared Organs (3DISCO), and CUBIC, and succeeded in producing various transparent tissues[11,12,13,14,15]. Combined with light-sheet laser scanning microscopy, these methods can provide clear 3D images of whole organs without preparing tissue sections[16]. Using a modified CUBIC tissue-clearing method, we also succeeded in making the pregnant murine uterus transparent and analyzing the specific distribution of the embryo-derived trophoblast that had invaded toward maternal uterine muscle layer[17]. Furthermore, we observed that EGFP transgenic mice had various ranges of cell-lineage-specific fluorescent activities, which enables us to create well-contrasted images[18]. Accordingly, we could obtain well-contrasted and 3D images of the whole ovary under light-sheet microscopy using a tissue-clearing technique and EGFP transgenic mice[18]. Based on this advantage, we applied our modified CUBIC tissue-clearing method to the murine uterus to analyze the 3D structure of myometrium and elucidate the physiological mechanism of uterine contraction. Consequently, we identified a novel mesh-like muscle structure, a middle layer of myometrium, which anatomically connects the conventional outer longitudinal and inner circular muscle layers. Since this structure is one of the candidates to explain the mechanisms coordinating uterine peristaltic contractions, we further analyzed the mesh-like muscle region by immunohistochemical study together with 3D imaging under light-sheet microscopy. |