Перевод статьи
«Новый третий сетчатый слой миометрия соединяет продольные и циркулярные мышечные волокна -- потенциальный слой для координации сокращений матки»
Источник: journal Scientific Reports 10 Номер статьи: 8274
Место публикации: Nature Research Поступило в редакцию: 09 марта 2020 г.
Принято: 30 апреля 2020 г. Опубликовано: 19 мая 2020 г.
Авторы: Кёсукэ Кагами ,Масанори Оно ,Такаши Иидзука ,Такео Мацумото ,Такаши Хосоно ,Наоми Секизука-Кагами , Йохэй Синме, , Хироши Кавасаки, Хироши Фудзивара
Выполнила:
студентка 2 курса лечебного факультета
Руководитель:
Подпись_____________
Отметка_____________
2020
Новый третий сетчатый слой миометрия соединяет продольные и циркулярные мышечные волокна -- потенциальный слой для координации сокращений матки
Источник: journal Scientific Reports 10 Номер статьи: 8274 Место публикации: Nature Research Поступило в редакцию: 09 марта 2020 г.
Принято: 30 апреля 2020 г. Опубликовано: 19 мая 2020 г.
Авторы: Кёсукэ Кагами ,Масанори Оно ,Такаши Иидзука ,Такео Мацумото ,Такаши Хосоно ,Наоми Секизука-Кагами , Йохэй Синме, , Хироши Кавасаки, Хироши Фудзивара
Аннотация
Периодическое сокращение миометрия – это одна из важных функций матки для для имплантации эмбриона и его родов. Хотя хорошо известно, что миометрий млекопитающих состоит из продольного (наружного) и циркулярного (внутреннего) слоев, точные механизмы, которые координируют оба мышечных сокращения для производства перистальтических движений, остаются неясными. Недавно, с помощью наших модифицированных коктейлей визуализации мозга и метода компьютерного анализа (CUBIC) мы получили хорошо контрастирующие трехмерные изображения прозрачного яичника мыши с использованием усиленного зеленого флуоресцентного белка (EGFP) трансгенных мышей и световой микроскопии. Следовательно, чтобы исследовать точные анатомические связи между наружными и внутренними волокнами миометрия, мы наблюдали целые структуры миометрия, используя прозрачную матку мыши. . С помощью этого метода мы определили новый мышечный слой, средний слой миометрия, который анатомически соединяет обычные наружные продольные и внутренние циркулярные мышцы. Этот новый слой визуализировался в виде сетчатой структуры, и эта структура наблюдалась по всей матке от проксимальных до дистальных участков. В этой области CD31-положительные сосуды были в изобилии локализованы вокруг сетчатых мышечных волокон. Кроме того, CD34-положительные телоциты матки и тубулин β-3-положительные нервные волокна были тесно расположены в этом среднем слое. Эти данные указывают на наличие нового сетчатого слоя, который соединяет продольные и циркулярные мышечные слои, и предполагают его координирующую роль в сокращениях миометрия.
Введение
Матка является важнейшим репродуктивным органом во время беременности и имеет несколько характеристик[1]. Во-первых, в ней находится развивающийся плод, полуаллотрансплантат матери, защищающий плод от материнской иммунной атаки[2]. Во-вторых, она увеличивается во время беременности, чтобы обеспечить внутриутробный рост плода[3]. В-третьих, она подвергается перистальтическому сокращению, чтобы родить плод[4]. В целом миометрий млекопитающих состоит из продольного (наружного) и циркулярного(внутреннего) мышечных слоев. Для гибкой адаптации к росту плода и адекватной координации родовых схваток, важны анатомические и функциональные связи между обоими мышечными слоями. В настоящее время известно, что неадекватная адаптация матки к росту плода приводит к преждевременным родам[5], в то время как аномальное перистальтическое сокращение миометрия считается причиной дисменореи[6], эндометриоза[7,8]и бесплодия[9]. Однако точные механизмы, координирующие функции обоих мышечных слоев, остаются неизвестными.
Для анализа стереоскопической анатомии репродуктивных органов были использованы классические методы препарирования срезов тканей и гистологического окрашивания. Хотя частичная реконструкция трехмерных (3D) изображений на основе этих методик возможна[10], трудно получить цельные 3D-изображения матки классическим методом с использованием только последовательных срезов тканей. Недавно несколько групп разработали отличные методы очистки тканей, такие как ScaleA2, See Deep Brain (SeeDB), CLARITY, 3D Imaging of Solvent-Cleared Organs (3DISCO) и CUBIC, и преуспели в производстве различных прозрачных тканей[11,12,13,14,15]. В сочетании со световой лазерной сканирующей микроскопией эти методы могут обеспечить четкие трехмерные изображения целых органов без подготовки срезов тканей[16]. Используя модифицированный метод очистки тканей CUBIC, нам также удалось сделать просвечивающую матку беременных мышей и проанализировать специфическое распределение трофобластов, происходящих из эмбриона, которые вторглись в слой материнских мышц матки[17]. Кроме того, мы наблюдали, что трансгенные EGFP мыши обладают различными диапазонами флуоресцентной активности, специфичной для клеточных клонов, что позволяет нам создавать хорошо контрастирующие изображения[18]. Соответственно, мы могли бы получить хорошо контрастирующие и 3D-изображения всего яичника под световой микроскопией с использованием метода очистки тканей и EGFP трансгенных мышей[18].
Основываясь на этом преимуществе, мы применили наш модифицированный метод очистки тканей CUBIC к матке мыши для анализа трехмерной структуры миометрия и выяснения физиологического механизма сокращения матки. Таким образом, мы выявили новую сетчатую мышечную структуру-средний слой миометрия, который анатомически соединяет обычные наружные продольные и внутренние циркулярные мышечные слои. Поскольку эта структура является одним из кандидатов для объяснения механизмов координации маточных перистальтических сокращений, мы дополнительно проанализировали сетчатую мышечную область с помощью иммуногистохимического исследования вместе с трехмерной визуализацией под световой микроскопией.
Результаты
Среди нескольких протоколов для очистки тканей мы выбрали CUBIC, который имеет заметное преимущество эффективного обесцвечивания эндогенных хромофоров в тканях[15] . Ранее мы сообщали, что беременная матка была эффективно очищена с помощью нашего модифицированного метода CUBIC. Небеременных самок мышей фиксировали с помощью транскардиальной перфузии 4% параформальдегида (PFA) и изолировали матку. В соответствии с протоколом CUBIC изолированную матку сначала погружали в реагент CUBIC-1 на 5 дней, в 20% сахарозу на 1 день, а затем в реагент CUBIC-2 на 2 дня (рис. 1а ). Затем с помощью стереомикроскопа были сделаны снимки яркого поля.
Рисунок 1
Очистка тканей матки с помощью CUBIC. ( а ) Протокол CUBIC для небеременной матки. ( b , c ) Яркие изображения матки взрослых мышей дикого типа до ( b ) и после ( c ) очистки ткани. ( d ) Сильно увеличенное изображение в белом квадрате (b ). ( e ) сильно увеличенное изображение в белом квадрате ( c ). Масштабные линейки 4 мм ( b, c ) и 2 мм ( d, e ).
Как мы ранее наблюдали на беременной матке, мы обнаружили, что небеременная матка стала прозрачной с помощью CUBIC (сравните Рис. 1b, c ). Важно отметить, что размер матки не был затронут CUBIC (сравните рис.. 1d, e ), хотя часто сообщалось, что размер органов становился больше после очищения тканей 12 . Эти результаты предполагают, что CUBIC является подходящим методом для того, чтобы сделать небеременную матку прозрачной, даже если она содержит толстый миометрий.
Обнаружение нового сетчатого мышечного слоя в миометрии с использованием модифицированного метода CUBIC и трансгенных мышей EGFP
Для визуализации тонких структур в матке мы сначала объединили CUBIC с окрашиванием ядер пропидием йодидом (PI) (модифицированный метод CUBIC) и наблюдали изображения PI с помощью световой микроскопии. Мы успешно получили не только последовательные изображения в плоскости XY, но также безугловые изображения поперечного сечения матки с одноклеточным разрешением без создания срезов ткани и не обнаружили флуоресцентные сигналы PI глубоко в матке (дополнительный рисунок S1 и дополнительный видео S1 ).
Несмотря на то, что PI-ядерная окраска четко показывала характер распределения клеток, одного PI-окрашивания было недостаточно для распознавания формы тела клеток и/или гистологических структур матки, содержащих много миоцитов, которые имеют удлиненные клеточные тела. Соответственно, мы использовали трансгенных мышей, экспрессирующих EGFP под контролем промотора CAG, который содержит промотор куриного бета-актина и энхансер цитомегаловируса. Матку трансгенных мышей CAG-EGFP с окрашиванием PI подвергали CUBIC, и трехмерные изображения реконструировали с помощью световой микроскопии (рис. 2а ). Мы ясно наблюдали сильную флуоресценцию EGFP в слое миометрия на 2D-изображениях поперечных сечений XY (рис. 2b, c). Интересно, что хотя белок EGFP был четко обнаружен как в слоях эндометрия, так и в слоях миометрия (дополнительный рисунок S2b и c ), флуоресцентные сигналы EGFP были относительно слабыми в клетках компонента эндометрия (рисунок 2c и дополнительный рисунок S2a ). Это различие в сигналах EGFP облегчило распознавание границы между эндометрием и миометрием (рис. 2b, c ). Восстановленные изображения продемонстрировали тонкие структуры EGFP-положительных слоев миометрия (дополнительное видео S2 ).
Рисунок 2
Трехмерные и поперечные изображения матки EGFP-положительной мыши. Самок трансгенных мышей CAG-EGFP транскардиально перфузировали 4% PFA, содержащим PI. После того, как изолированную матку подвергали CUBIC, были получены трехмерные изображения и изображения поперечного сечения с помощью световой микроскопии. ( а ) Трехмерное изображение сигналов EGFP и PI матки. ( б ) Изображение в разрезе в белом квадрате ( а ). ( c ) Увеличенное изображение ( b ). ( d - f ) Восстановленное последовательное корональное изображение миометрия показало внешний слой ( d ), средний слой ( e ) и внутренний слой ( f). Обратите внимание, что флуоресценция мышечных волокон EGFP была высокой в миометрии, но очень низкой в эндометрии. В среднем мышечном слое (стрелка) наблюдалась сетчатая структура мышечных волокон, соединяющих продольный и окружной миометрий. lm - продольный мышечный слой; см - окружной мышечный слой; конец, эндометрий; str, стромальные клетки; эпи, эпителиальные клетки. Масштабные линейки 1 мм ( a , b ), 200 мкм ( c ) и 500 мкм ( d – f ).
Сообщалось, что у грызунов миометрий состоит из двух мышечных компонентов, внешнего продольного и внутреннего кольцевого мышечных слоев, и эти два слоя были разделены соединительной тканью и сосудистой сетью 19 . Иммуногистохимическое окрашивание показало, что EGFP-позитивные по флуоресценции клетки экспрессировали αSMA, показывая, что эти EGFP-позитивные слои миометрия состоят из миоцитов. Следовательно, с помощью нашего метода мы четко наблюдали новый связующий мышечный слой, средний слой миометрия, который анатомически соединял продольные (рис. 2d , lm) и круговые мышечные волокна (рис. 2f , см). Мы также обнаружили, что эти соединительные мышцы имеют сетчатую структуру (рис. 2e).). Полное изображение этого нового мышечного слоя можно наблюдать с помощью 3D-видео, и этот слой был продемонстрирован по всему маточному тракту (дополнительное видео S2 ). Кроме того, стереоскопическое изображение, которое было создано из наборов данных трехмерных изображений, предоставило сложную картину этих сетчатых структур (рис. 3 ).
Рисунок 3
Стереоскопическое изображение сетчатой мышечной структуры в матке трансгенных мышей EGFP. Самок трансгенных мышей CAG-EGFP транскардиально перфузировали 4% PFA, содержащим PI. После того, как изолированную матку подвергали CUBIC, были сделаны трехмерные изображения с помощью световой микроскопии, а затем были восстановлены стереоскопические изображения. При создании комбинированного стереоскопического изображения из правых и левых двумерных фигур мы можем четко распознать сложную целостную картину этих сетчатых структур. Шкала шкалы 1 мм.
Иммуногистохимическое исследование сетчатого мышечного слоя
Хотя трехмерное реконструированное изображение матки показывало целые структуры мостовидных мышц, оно не могло дать нам детального представления о мелких сосудистых структурах. Поэтому мы дополнительно провели иммуногистохимический анализ. В этой области в изобилии наблюдаются CD31-позитивные кровеносные сосуды (рис. 4а). Мышечные волокна проходят через богатую сосудами область в сетчатом слое (рис. 4Б).
Рисунок 4
Иммуногистохимическое исследование сетчатого мышечного слоя. Взрослых самок мышей дикого типа фиксировали с помощью транскардиальной перфузии 4% PFA. Срезы окрашивали антителами против CD31 ( a, b ), против TUBB3 ( c , e , f ) и против CD34 ( d – f ) для исследования популяций клеток в сетчатом среднем мышечном слое. ( а ) CD31-положительные эндотелиальные клетки (стрелки) в большом количестве в среднем мышечном слое. ( б ) Увеличенное изображение белого квадрата на ( а ). Мышечные волокна (стрелки) проходят через богатую сосудами область сеткообразного слоя (внутри пунктирных линий). ( c) Тубулин-β-3 (TUBB3) -положительные нервные аксоны были преимущественно распределены в сетчатом мышечном слое. ( d ) CD34-положительные телоциты миометрия, которые обладают удлиненными тонкими телоподами, преобладали во внешнем продольном слое (радиально распределены, стрелки) и среднем сетчатом слое (распределены по кругу, стрелки). ( e ) TUBB3-положительные аксональные волокна (стрелки) наблюдались параллельно вдоль CD34-положительных телоцитов в сетчатой мышечной области. ( f ) Эти TUBB3-положительные окончания аксонов (стрелка) были прикреплены к CD34-положительным телоцитам. lm - продольный мышечный слой; см - окружной мышечный слой; αSMA, альфа-актин гладких мышц; TUBB3, тубулин β-3. Масштабные линейки, 100 мкм ( а ), 50 мкм ( б -д ) и 25 мкм ( е ).
Кроме того, в сетчатом мышечном слое преобладало распределение тубулин-β-3 (TUBB3)-позитивных нервных аксонов (рис. 4С). Важно отметить, что CD34-позитивные телоциты миометрия, обладающие удлиненными и тонкими телоподами, преимущественно наблюдались в наружном продольном слое (радиально распределенные, стрелки на рис. 4d) и средний сетчатый слой (циркулярно распределенные наконечники стрел на рис. 4d), в то время как его распределение внутри внутренних окружных мышц невелико (рис. 4d). Телоциты миометрия были функционально описаны как стимулирующие клетки клетки, которые создают гомо- и гетероклеточные соединения с кровяными капиллярами, нервными пучками и мышечными волокнами [20 , 21]. Было обнаружено, что TUBB3-положительные аксональные волокна проходят вдоль CD34-положительных телоцитов в сетчатой мышечной области (рис. 4e ). Также было показано, что эти TUBB3-положительные окончания аксонов присоединяли CD34-положительные телоциты (рис. 4f ).
Обсуждение
Наш модифицированный метод CUBIC в сочетании со световой микроскопией позволил получить четкие трехмерные изображения матки мыши. Миоглобин - один из эндогенных хромофоров, нарушающих прозрачность органов, а матка содержит большое количество миоглобина в слое миометрия. Поскольку аминоспирт, который является одним из основных компонентов реагента CUBIC 1, эффективен для элюирования миоглобина, ранее мы использовали метод CUBIC и смогли получить прозрачные изображения матки беременной мыши[17] . Соответственно, в этом исследовании мы применили метод CUBIC к небеременной матке и подтвердили, что этот метод также полезен для того, чтобы сделать небеременную матку прозрачной.
Интересно, что хотя в предыдущем исследовании сообщалось, что EGFP экспрессируется почти во всех типах клеток у трансгенных мышей CAG-EGFP [22] , наши результаты показали, что флуоресценция GFP в эндометрии была относительно слабее, чем флуоресценция миометрия у трансгенных мышей CAG-EGFP. Чтобы исследовать причину снижения активности флуоресценции EGFP, мы исследовали иммуногистохимическую экспрессию EGFP в матке трансгенных мышей CAG-EGFP. В отличие от флуоресценции EGFP, иммунореактивность EGFP сильно наблюдалась в стромальных клетках эндометрия и слабо в эпителиальных клетках эндометрия (дополнительный рисунок S2 ), что позволяет предположить, что существуют некоторые различия в эффективности экспрессии гена GFP под контролем промотора CAG в репродуктивной системе. органы.
Хотя миометрий мыши считается двухслойной структурой[19,23], здесь мы идентифицировали новый третий мышечный слой с использованием трансгенных мышей EGFP, которые анатомически соединяли внешние продольные и внутренние круговые мышцы. У этого метода есть дополнительное преимущество, заключающееся в получении полных изображений длинных непрерывных структур. Соответственно, хотя матка мыши имеет цилиндрическую форму, комбинация компьютерных компьютерных наблюдений под свободным углом и видеонаблюдения с использованием наборов данных трехмерных изображений позволила нам проанализировать внутренние анатомические структуры по всей матке. Следовательно, мы могли подтвердить, что сетчатые структуры присутствовали во всей матке от проксимальных до дистальных участков. Поскольку средний мышечный слой соединяет продольные и окружные волокна миометрия, этот слой может играть важную роль в координации сокращений матки.
У человека наличие среднего слоя, богатого сосудами, где мышечные волокна относительно редки, было описано ранее[24]. Хотя никаких предположений о его роли не было, сообщалось также, что эта область содержит сетчатую структуру мышечных волокон. Поскольку единое человеческое тело матки эмбриологически развивается в результате слияния двусторонних мюллеровых протоков, логично, что связь мышечных волокон между правым и левым мюллеровыми протоками проявляется в виде сетчатых структур. Однако, учитывая, что мюллеровы протоки крысы / мыши не слиты и остаются двусторонними телами матки, средний слой человека может соответствовать области слияния третьего мышечного слоя в мюллеровых протоках, что и было реализовано в этом исследовании. Следовательно, дальнейшее исследование третьего мышечного слоя мышей может способствовать выяснению физиологической роли этого среднего слоя в матке человека.
В этой области CD31-положительные сосуды располагались вокруг сетчатых мышечных волокон. Недавно, используя систему записи с многоэлектродной матрицей, Lutton et al . продемонстрировали, что электрические потенциалы в матке беременной крысы инициируются в отдельных пучках миометрия, которые соединяют продольные и кольцевые мышечные слои, которые расположены в плацентарном ложе отдельных участков имплантации. Они также сообщили, что эти мышечные пучки ранее не были идентифицированы, и они соединяли кровеносные сосуды, расположенные между продольным и окружным слоями мышц[25]. В этом исследовании мы наблюдали мышечные волокна, проходящие через богатую сосудами область сетчатого слоя. Общие анатомические характеристики предполагают, что мышечные волокна в сетчатом слое матки мыши соответствуют возбуждающим электрический потенциал мышечным пучкам матки беременной крысы. Примечательно, что совместная локализация CD34-положительных телоцитов матки, которые были предложены в качестве стимулирующих клеток[20], и TUBB3-положительные нервные волокна были преимущественно идентифицированы в этом среднем слое, особенно вблизи границы внешнего слоя. Кроме того, иммуногистохимия с двойным окрашиванием подтвердила тесный контакт между телоцитами и нервными волокнами, предполагая, что эти области являются потенциально регулирующими центрами, которые первоначально получают сигналы от автоматической нервной системы и отправляют их клеткам миометрия через телоциты.
Важно отметить, что, поскольку телоциты экспрессируют рецепторы эстрогена и прогестерона и могут отвечать на стимуляцию стероидными гормонами[26] , они были предложены в качестве датчиков уровней половых гормонов[27] . Основываясь на этих выводах, мы предполагаем, что новый сетчатый третий мышечный слой участвует в контроле вегетативного сокращения матки в присутствии половых гормонов. Поскольку телоциты также контактируют с капиллярами[27,28], эта область может регулировать кровоток в миометрии. Чтобы подтвердить это, следует провести дальнейшие анализы, включающие электрофизиологическое исследование и визуализацию кальция.
|
Скачать 1.45 Mb.