Общая микробиология
 Скачать 0.8 Mb.
|
Реакция агглютинацииРеакция агглютинации (от лат. agglutinatio — склеивание) — склеивание корпускул (бактерий, эритроцитов и др.) антителами в присутствии электролитов. Реакция агглютинации проявляется в виде хлопьев или осадка, состоящих из корпускул, «склеенных» антителами. В качестве антигена (корпускулярного!) в этой реакции выступают: бактериальные клетки, клетки крови, индифферентные нерастворимые частицы или клетки с адсорбированными на них антигенами. Реакцию агглютинации используют для: определения возбудителя, выделенного от больного; определения антител в сыворотке крови больного; определения групп крови. Определение возбудителя, выделенного от больного. Ориентировочная реакция агглютинации на стекле. К капле диагностической агглютинирующей сыворотки (разведение 1:20) добавляют взвесь бактерий, выделенных от больного. Образуется хлопьевидный осадок. Поскольку родственные бактерии могут агглютинироваться одной и той же диагностической агглютинирующей сывороткой, это затрудняет их идентификацию. Поэтому из агглютинирующих сывороток удаляют групповые антитела путем адсорбции их родственными бактериями (р.Кастеллани). В таких сыворотках сохраняются антитела, специфичные только для одного вида микроорганизмов. Полученные таким способом сыворотки называют монорецепторными адсорбированными диагностическими сыворотоками. Определение антител в сыворотке крови больного Развернутая реакция агглютинации с сывороткой крови больного. К разведениям сыворотки больного добавляют диагностикум. Агглютинация с О-диагностикумом (бактерии, убитые нагреванием, сохранившие 0-антиген) происходит в виде мелкозернистой агглютинации. Агглютинация с Н-диагностикумом (бактерии, убитые формалином, сохранившие жгутиковый Н- антиген) — крупнохлопчатая и протекает быстрее. Реакция ставится с разными разведениями исследуемой сыворотки для определения титра антител. Нарастание титра специфических антител в сыворотке больного говорит об инфекционном заболевании. Это реакции титрования иммунной сыворотки, р. Видаля для диагностики брюшного тифа, р. Райта для диагностики бруцеллеза и др. Реакция агглютинации для определения групп крови. Реакцию агглютинации для определения групп крови применяют для установления системы АВО (табл. б) с помощью агглютинации эритроцитов антителами иммунной сыворотки против антигенов групп крови А (II), В (III). Контролем служат: сыворотка, не содержащая антител, т.е. сыворотка АВ (IV) группы крови; антигены, содержащиеся в эритроцитах групп А (II), В (III). Отрицательный контроль не содержит антигенов, т. е. используют эритроциты группы О (I). Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации. В РНГА выявляют антитела сыворотки крови больного с помощью антигенного эритроцитарного диагностикума, который представляет собой эритроциты с адсорбированными на них антигенами. Эритроциты (или частицы латекса) с адсорбированными на них антигенами взаимодействуют с соответствующими антителами сыворотки крови , что вызывает склеивание и выпадение эритроцитов на дно пробирки или ячейки в виде фестончатого осадка. При отрицательной реакции эритроциты оседают в виде «пуговки». РПГА ставят в пластиковых планшетках или в пробирках с разведениями сыворотки крови больного, к которым добавляют эритроцитарный диагностикум. Иногда применяют антительный эритроцитарный диагностикум — эритроциты, на которых адсорбированы антитела. Например, можно обнаружить ботулинический токсин, добавляя к нему эритроцитарный антительный ботулинический диагностикум (такую реакцию называют реакцией обратной непрямой гемагглютинации — РОНГА) Реакцию коагглютинации применяют для определения антигенов с помощью антительного диагностикума — антител, адсорбированных на белке А клеток стафилококка Белок А имеет сродство к Fc-фрагменту иммуноглобулинов, поэтому такие бактерии, обработанные иммунной диагностической сывороткой, неспецифически адсорбируют антитела сыворотки. Антитела диагностикума взаимодействуют активными центрами с соответствующими микробами, выделенными от больных. В результате коагглютинации образуются хлопья, состоящие из стафилококков, антител диагностической сыворотки и определяемого микроба. Реакция торможения гемагглютинации. Гемагглютинины некоторых вирусов (миксовирусы) склеивают эритроциты. Это свойство используют в реакции гемагглютинации для индикации и титрования вирусов, что необходимо для последующей постановки реакции торможения гемагглютинации (РТГА). Она основана на блокаде, подавлении антигенов (гемагглютининов) вирусов антителами иммунной сыворотки, в результате чего вирусы теряют свойство агглютинировать эритроциты. РТГА применяют для диагностики многих вирусных болезней, возбудители которых (вирусы гриппа, кори, краснухи, клещевого энцефалита и др.) могут агглютинировать эритроциты различных животных. Реакция коагглютинации. В реакции использовано свойство стафилококков, содержащих протеин А, неспецифически адсорбировать антимикробные антитела. При добавлении к таким диагностическим препаратам неизвестного микроорганизма может произойти коагглютинация, если адсорбированные антитела специфичны для данного микроорганизма. Непрямые (пассивные) реакции агглютинации.Эти реакции называются непрямыми (пассивными) т.к. при их проведении используют антигены (или антитела), искусственно адсорбированные на поверхности различных корпускулярных частиц. Реакция непрямой (пассивной) агглютинации основана на способности клеток (эритроцитов) или некоторых химических частиц (латекс) адсорбировать на своей поверхности антигены и гаптены бактерий, антигены вирусов, риккетсий. При этом носитель приобретает новую антигенную специфичность и вступает во взаимодействие с имунными сыворотками, специфичными для адсорбированного антигена. Можно адсорбировать на сенсибилизированных эритроцитах не только антигены, но и специфические антитела. Такие препараты называют антительными эритроцитарными диагностикумами. Постановка реакции агглютинации с таким диагностикумом называется обратной РНГА (или РОНГА). Антигенные и антительные эритроцитарные диагностикумы широко используются для постановки непрямой реакции гемагглютинации. РНГА обычно ставят на плексигласовых планшетках с лунками. Исследуемую сыворотку предварительно инактивируют при 56˚С в течение 30 минут для разрушения комплемента и разводят от 1:10 до 1:12 000 и более, разливают в лунки до 0,5 мл и добавляют по 0,1 мл эритроцитарного диагностикума. Реакцию выдерживают в течение двух часов в термостате и считают положительной, если осадок эритроцитов имеет форму "зонтика" с зубчатыми краями и покрывает почти все дно лунки. При отрицательном результате эритроциты оседают в центре дна лунки в виде компактного диска с ровными краями (см. демонстрацию). Непрямые варианты реакции агглютинации делают ее более чувствительным методом и расширяют возможности ее применения. Реакции этого типа широко применяются для диагностики инфекционных заболеваний (выявление специфических антител в сыворотке больного при брюшном тифе, туляремии, гриппе, риккетсиозах, хламидиозах), а также для определения гонадотропного гормона в моче при установлении беременности, для выявления лекарственной аллергии, определения поствакцинального иммунитета при дифтерии и т.д. Реакция Кумбса - реакция агглютинации для определения антирезусных антител (непрямая реакция Кумбса). У некоторых больных обнаруживают антирезусные антитела, которые являются неполными, одновалентными. Они специфически взаимодействуют с резус-положительными эритроцитами (Rh+), но не вы- зывают их агглютинации. Наличие таких неполных антител определяют в непрямой реакции Кумбса. Для этого к резус-положительным эритроцитам с сорбированными на них неполными антителами добавляют антиглобулиновую сыворотку (антитела против иммуноглобулинов человека получены путем иммунизации кролика человеческим гамма-глобулином). В случае положительного результата наблюдается феномен склеивания эритроцитов. Следовательно, р. Кумбса является разновидностью непрямой реакцией гемагглютинации. С помощью реакции Кумбса диагностируют патологические состояния, связанные с внутрисосудистым лизисом эритроцитов, например, гемолитическую болезнь новорожденных: Эритроциты резус-положительного плода соединяются с циркулирующими в крови неполными антителами к резус-фактору, которые перешли через плаценту от резус-отрицательной матери. Можно также выявлять неполные антитела против антигенных микробов (например, при бруцеллезе) Реакция преципитации (РП) - осаждение высокодисперсных антигенов (в коллоидном состоянии) - специфическими антителами (преципитинами) в присутствии электролита. Выпадение нерастворимого комплекса антиген-антитело в виде осадка наблюдается, если эти ингредиенты находятся в эквивалентных количествах. Антиген в р. преципитации должен быть прозрачным. Реакцию преципитации ставят в пробирках (реакция кольцепреципитации), в гелях, питательных средах и др. Широкое распространение получили разновидности реакции преципитации в полужидком геле агара или агарозы: двойная иммунодиффузия по Оухтерлони, радиальная иммунодиффузия, иммуноэлектрофорез и др. Р. преципитации ставят с целью выявления антигена по известной преципитирующей сыворотке, содержащей антитела. Для приготовления коллоидных антигенов, участвующих в реакции преципитации, используют различные методы их экстракции из исследуемого материала: физические, химические и биологические. Бактериальный антиген может быть получен путем его экстрагирования из чистых культур бактерий, из патологического материала или из объектов внешней среды, обсемененных микробами (диагностика сибирской язвы, чумы, туляремии). В судебно-медицинской практике с помощью р. преципитации определяют видовую специфичность белка (крови, спермы), в санитарной практике - выявляют фальсификацию пищевых продуктов, в клинической иммунологии - уровень имунноглобулинов в сыворотке крови. Таким образом, знание этой реакции необходимо для врачей многих специальностей. При постановке РП разводят не сыворотку, а антиген. За титр преципитирущей сыворотки принимают то наибольшее разведение антигена, которое при взаимодействии со стандартной иммунной сывороткой вызывает образование видимого преципитата. Р. кольцепреципитации - на слой антисыворотки наслаивают жидкость, содержащую растворимый антиген и через несколько секунд наблюдают образование кольца преципитата. Широкое распространение получила реакция термопреципитации (р.Асколи) на антиген возбудителя сибирской язвы, использующая антигены, экстрагированные кипячением из различного сельскохозяйственного сырья. Р. микропреципитации применяют для выявления низких титров антител. При ее постановке в исследуемую сыворотку крови вносят антиген в убывающей концентрации; при отсутствии антител разведение сыворотки крови антиген уменьшает ее оптическую плотность. Однако в присутствии минимальных количеств антител образуются микропреципитаты, повышающие оптическую плотность среды (учет результатов осуществляется нефелометрическим методом). Р. флокуляции – это РП в системах токсин-антитоксин или анатоксин-антитоксин. Проявляется появлением хлопьевидного осадка. Реакцию обычно применяют для определения активности антитоксических сывороток или анатоксина. РП в геле (иммунодиффузия)в различных модификациях: простая иммунодиффузия (по Уанье), встречная иммунодиффузия (по Оухтерлони), радиальная иммунодиффузия (по Манчини). Методы простой диффузии основаны на способности Аг, внесенного сверху в лунки и ли пробирки с агаром, диффундировать в гель. При постановке реакций двойной (встречной) диффузии Аг и Ат вносят в отдельные лунки. Обычно методы используют для выявления белковых Аг в различных жидкостях и тканевых экстрактах. Вариантом простой одномерной иммунодиффузии является тест Илека для выявления токсинообразования у возбудителя дифтерии. Иммуноэлектрофорез. Метод объединяет РП в геле с элетрофорезом. Для этого слой агара наносят на предметное стекло; на его разных краях вырезают две лунки, а в центре – разделяющую их канавку. В лунки вносят смесь Аг и проводят электрофорез в течение 1-2 часов. Различные Аг с разной скоростью перемещаются между катодом («старт») и анодом («финиш»). Затем в канавку вносят преципитирующую сыворотку и, в случае положительного результата, в геле образуются зоны преципитации. Иммунофлюоресцентный метод основан на соединении антигенов со специфическими антителами, меченными флюорохромными красителями, благодаря чему с помощью люминесцентного микроскопа эти антигены (связанные с антителами) выявляются в виде светящихся изображений на несветящемся фоне препарата.Основная сложность метода заключается в изготовлении люминесцирующих (флюорохромных) сывороток. Для этого из исходной иммунной сыворотки выделяют и концентрируют глобулиновую фракцию (антитела), которая соединяется с флюорохромом (например, изотиоцианатом или другим хроматографически чистым красителелем). При проведении исследований применяют прямой и непрямой методы иммунофлюоресценции: При прямом методе готовят препарат, содержащий исследуемые антигены (мазок из патологического материала, крови, отпечаток или срез различных органов и тканей, и др. материалы, содержащие микроорганизмы), фиксируют его жидким фиксатором и обрабатывают специфическим люминесцирующим иммуноглобулином. После инкубации отмытый от избытка иммуноглобулина и высушенный препарат рассматривают в люминесцентный микроскоп, возбуждая свечение ультрафиолетовым светом. Светящиеся изображения антигенов будут наблюдаться только при соответствии их взятому меченому иммунноглобулину. Прямой метод технически прост и высокоспецифичен, но требует большого набора различных люминесцирующих иммуноглобулинов (на каждый антиген - отдельная специфическая сыворотка). При непрямом методе препарат, приготовленный таким же образом, обрабатывают обычной (несветящейся) специфической сывороткой (полученной путем иммунизации кролика), промывают буферным раствором и затем заливают люминесцирующую антиглобулиновую сыворотку (содержащую антитела против глобулинов кролика) и снова промывают. При микроскопии видны светящиеся изображения антигена, если он соответствует взятой иммунной сыворотке, так как в этом случае к образовавшемуся комплексу антиген + антитело присоединяется люминесцирующая антиглобулиновая сыворотка. Следовательно, при непрямом методе иммунная сыворотка (в нашем случае кроличья) служит антителом для исследуемого антигена и, в свою очередь, является антигеном для соответствующей антиглобулиновой люминесцирующей сыворотки (содержащую антитела против иммуноглобулинов кролика, меченные флюорохромом). С помощью непрямого метода можно определять также наличие антител в сыворотках. В практической микробиологии и вирусологии ИФ-метод является методом экспресс-диагностики многих инфекционных заболеваний бактериальной и вирусной природы. Метод нейтрализации токсина антитоксином.Антитела иммунной сыворотки способны нейтрализовать повреждающее действие микробов или их токсинов на чувствительные клетки и ткани, что связано с блокадой микробных антигенов антителами, т. е. их нейтрализацией. Реакция нейтрализации является биологическим методом, так как проводят путем введения смеси антиген—антитело животным или в чувствительные тест-объекты (культуру клеток, эмбрионы). При отсутствии у животных и тест-объектов повреждающего действия микроорганизмов или их антигенов, токсинов говорят о нейтрализующем действии иммунной сыворотки и, следовательно, о специфичности взаимодействия комплекса антиген—антитело. Таким методом можно определит: а) наличие противодифтерийных антитоксических антител в сыворотке пациентов; б) наличие токсина в исследуемом материале при ботулинистическом пищевом отравлении |