Общая микробиология
 Скачать 0.8 Mb.
|
|
15.Лизины. Реакция бактериолиза и гемолиза. РСК и ее использование в диагностике инфекционных болезней. Свойство иммунной сыворотки - способность лизировать (растворять) чужие клетки. при взаимодействии специфических антител с антигенами клеток (эритроцитов, бактерий, лимфоцитов и др.), на их поверхности образуется комплекс, который активирует комплемент по классическому пути - наступает лизис клеток. В зависимости от характера корпускулярного антигена : бактериолизис, спирохетолизис, гемолизис (гемолиз), лимфоцитолизис. Активно идут во время инфекционного заболевания (в живых организмах, где активно работают все белки системы комплемента. В этом их огромный защитный эффект. Вне живого организма (in vitro) многие бактерии устойчивы к литическому действию комплемента, поэтому для диагностических целей редко. используется при типировании (выявлении) антигенов гистосовместимости (у человека ситема HLA) на лимфоцитах. К типируемым лимфоцитам + антисыворотки против HLA-антигенов, затем отмывают и добавляют комплемент. Если соответствующий антиген есть, то наступает лизис лимфоцитов и мертвые клетки, в отличие от живых, окрашиваются трипановым синим. В лабораторной практике - явление гемолиза - в качестве индикаторной системы в реакции связывания комплемента (РСК). РСК - как для обнаружения в исследуемой сыворотке антител, так и для выявления антигенов в исследуемом материале. В опытной системе образование комплексов антиген-антитело и фиксация к ним комплемента не сопровождается видимыми изменениями, если антиген не является клеткой. для обнаружения связывания используют индикаторную систему из эритроцитов барана, обработанных антителами-гемолизинами. Лизис эритроцитов – только в присутствии свободного комплемента (сыворотка морской свинки), а это возможно лишь в том случае, если в опытной системе комплекс антиген-антитело не формируется (РСК отрицательна, есть гемолиз). РСК - чувствительностью и специфичностью. используют для диагностики инфекционных заболеваний: сифилиса (р.Вассермана), риккетсиозов (сыпной тиф, лихорадка Ку), вирусных (грипп, корь, парагрипп и др.). Реакция радиального гемолиза в геле – вариант р. гемолиза и РСК в геле. ставят в лунках геля из агара, содержащего эритроциты барана и комплемент. После внесения в лунки гемолитической сыворотки вокруг них, в результате радиальной диффузии антител, образуется зона гемолиза=определить активность комплемента и гемолитической сыворотки. Если в гель добавить эритроциты, на которых адсорбированы антигены различных возбудителей (вирусов гриппа, краснухи и т.д.), а в лунки вносить сыворотки больных, то антитела сыворотки взаимодействуют с вирусными антигенами на эритроцитах, после чего к этому комплексу присоединяется комплемент и наступает гемолиз в агаре. Р. локального гемолиза в геле, предложена Н.Йерне (1963 г.) - для подсчета клеток-антителопродуцентов. Клетки, продуцирующие антитела (плазмоциты селезенки, после иммунизации животного эритроцитами барана), вносят вместе с эритроцитами барана в гель (агар). Затем в реакционную систему вносят комплемент (наслаивая его на агар) и наблюдают образование зон гемолиза вокруг каждой клетки, образующей антитела к эритроцитам барана. оценить образование антител на уровне отдельных тканей и клеточных популяций иммунной системы после различных воздействий. 16.Опсонины. Реакция опсонизации. Роль комплемента в хемотаксисе, опсонизации микробов. Опсонины (усиливающий) — белки, обволакивающие микробы и усиливающие их фагоцитоз. иммуноглобулины, белки острой фазы, липополисахарид-связывающий протеин; компоненты комплемента (СЗЬ, С4Ь), сурфактантные протеины легких SP-A, SP-D. Грам+ бактерии (стафилококки, стрептококки, пропионибактерии.) способны неспецифически адсорбировать гуморальные факторы в виде капсулоподобного покрова. За счет этого они более интенсивно фагоцитируются по сравнению с грам- бактериями. Так, стафилококки, обработанные сывороткой крови, неспецифически адсорбируют белки сыворотки (иммуноглобулины, комплемент, альбумин и др.) в виде капсулоподобного покрова, условно названного иммуноглобулиновым покровом. Обязательным условием адгезии фагоцита служит распознавание объекта фагоцитоза. Механизмы распознавания различаются в случаях фагоцитоза опсонизированного и неоп-сонизированного объектов. Опсонизация – это связывание с поверхностью чужеродного объекта особых молекул – опсонинов – которые являются лигандами для рецепторов фа-гоцитов, облегчают их адгезию и тем самым усиливают фагоцитоз. Основными опсонинами являются активированный C3b комплемента и IgG (иммуног-лобулин класса G). Соответственно, у профессиональных фагоцитов имеются рецепторы к C3b и к Fc-фрагменту IgG. Свойства опсонинов также присущи фибронектину и С-реактивному белку. Таким образом, при опсонизированном фагоцитозе клетки распо-знают не сами объекты фагоцитоза, а присоединившиеся к ним опсонины. Хемотаксис – направленное движение по градиенту хемоаттрактантов: продукты деградации бактерий, цитокины (ИЛ-8), продукты активации комплемента (С3а, С5а), фибринолизин. Компоненты системы комплемента, помимо литической функции, обладают также регуляторной = могут участвовать в процессе хемотаксиса —направленного движения клеток, поскольку рецепторы к компонентам комплемента присутствуют на многих клетках иммунной системы. С5а-компонент как хемоаттрактант активирует хемотаксис не только клеток врожденного (дендритных клеток, макрофагов), но также адаптивного иммунитета (Т-л). Компоненты C5a и С3a называются анафилатоксинами, поскольку высвобождают медиатор аллергии гистамин из тучных клеток и вызывают сокращение гладкой мускулатуры. Компонент комплемента C3b является опсонином, усиливая фагоцитоз макрофагов и нейтрофилов. 17.Реакция нейтрализации вирусов, реакция гемагглютинации, реакция торможения гемагглютинации; реакция гемадсорбции, реакция торможения гемадсорбции. Антитела иммунной сыворотки способны нейтрализовать повреждающее действие микробов или их токсинов на чувствительные клетки и ткани, что связано с блокадой микробных антигенов антителами, т. е. их нейтрализацией. является биологическим методом, путем введения смеси антиген—антитело животным или в чувствительные тест-объекты (культуру клеток, эмбрионы). При отсутствии у животных и тест-объектов повреждающего действия микроорганизмов/их антигенов, токсинов говорят о нейтрализующем действии иммунной сыворотки и о специфичности взаимодействия комплекса антиген—антитело. определить: а) наличие противодифтерийных антитоксических антител в сыворотке пациентов; б) наличие токсина в исследуемом материале при ботулинистическом пищевом отравлении. Реакция торможения гемагглютинации. Гемагглютинины некоторых вирусов (миксовирусы) склеивают эритроциты. используют для индикации вирусов. основана на подавлении антигенов (гемагглютининов) вирусов антителами иммунной сыворотки - вирусы теряют свойство агглютинировать эритроциты, соответственно не происходит склеивания при добавлении эритроцитов в виде фестончатого осадка. РТГА применяют для диагностики многих вирусных болезней, возбудители которых (вирусы гриппа, кори, краснухи, клещевого энцефалита и др.) могут агглютинировать эритроциты различных животных. Гемадсорбция – адсорбция эритроцитов на поверхности пораженных вирусом клеток. В пробирки с зараженным вирусом культурой ткани вносят 0,2 мл 0,4%-ной взвеси эритроцитов. Пробирки встряхивают и оставляют в наклонном положении. Учет под малым увеличением микроскопа после непродолжительного покачивания пробирки для отделения неадсорбированных эритроцитов от поверхности клеток. При вирусной гемадсорбции эритроциты прочно фиксированы на клетках и сохраняются на них послее 1-2 кратного отмывания. Реакция торможения гемадсорбции (РТГАд) - основана на торможении гемадсорбции, если зараженную вирусом культуру клеток предварительно обработать специфической сывороткой (содержащей антитела к этому вирусу). на 3—7-й день после заражения культур клеток из них удаляют питательную среду, промывают клетки раствором Хенкса и вносят в каждые 4 пробирки по 0,5 мл специфической к вирусу сыворотки в разведении 1:10; пробирки в наклонном положении оставляют при комнатной температуре на 30 мин (для контакта клеток с антителами); во все пробирки + 1 мл 0,5%-ной взвеси эритроцитов; Отсутствие гемадсорбции в пробирках со специфической сывороткой и проявление ее в пробирках с зараженной культурой клеток, но не обработанной специфической сывороткой, свидетельствует о наличии вируса в культуре клеток. 18.Гиперчувствительность немедленного типа. Анафилаксия. Атопические болезни. Механизмы возникновения, методы выявления и предупреждения. Развитие гиперчувствительности - имеет иммунную природу и характеризуются необычной реактивностью клеток на антиген. В 1975 г. Гелл и Кумбс - классификацию р гиперчувствительности из 4 типов. Первые три с помощью антител, четвертый опосредуется Т-лимфоцитами. выделяют иммунную фазу (взаимодействие иммунных клеток с антигеном), патохимическую фазу (продукция медиаторов аллергии, эффекторных клеток и цитокинов) и патофизическую фазу клинических проявлений (кожные высыпания, отек, зуд, удушье). Гиперчувствительность немедленного типа (ГНТ) обусловлена антителами (IgE, IgG, IgM) против аллергенов. Она развивается через несколько минут или часов после воздействия аллергена: расширяются сосуды, повышается их проницаемость, развиваются зуд, бронхоспазм, сыпь, отеки. Поздняя фаза ГНТ дополняется действием продуктов эозинофилов и нейтрофилов. К ГНТ относятся I, II и III типы гиперчувствительности (по Ф. Джеллу и Р. Кумбсу): I тип — анафилактический, обусловленный главным образом действием IgE, реже IgG4; II тип — цитотоксический, вызванный участием IgG, IgM в цитолитических реакциях; III тип — иммунокомплексный, развивающийся при образовании иммунного комплекса IgG, IgM с антигенами. Анафилаксия –реакция ГНТ, сопровождающееся состоянием шока и несущая угрозу жизни. после парентерального введения аллергена, при этом доза решающего значения не имеют от нескольких секунд до часа. Ведущий патогенетический механизм – сильная периферическая вазодилатация из-за резкого увеличения концентрации БАВ. Симптомы - резкое падение АД, отек гортани, ларинго- и бронхоспазм, затруднение дыхания, спутанность сознания, обморок. Около 10% случаев заканчиваются летальным исходом. Атопии –локальные реакции ГНТ I типа у генетически предрасположенных к ним лиц. В отличие от анафилаксии, атопия может развиваться в ответ на многие небелковые вещества, сенсибилизация при ней длительна. атопический дерматит, аллергический ринит и аллергическая астма. 19.Гиперчувствительность немедленного типа. Классификация. Сывороточная болезнь, условия ее возникновения, лечение. 1. ГНТ АНАФИЛАКТИЧЕСКИЙ - комплекс антиген-антитело (иммуноглобулин Е) связывается посредством Fc-рецепторов с мембраной тучных клеток или базофилов - к секреции и выбросу медиаторов: гистамина, ацетилхолина, хемотактических факторов, простагландинов, лейкотриенов (фармакологическая фаза) = увеличение дилятации капилляров и усиление их проницаемости. Плазма крови из сосудистого русла попадает в ткани, что приводит к отеку, спазм гладкой москулатуры бронхов, мочевого пузыря, матки. развивается быстро (около 30 минут. При легочной локализации - летальный исход (анафилаксия при введении гетерологичных сывороточных препаратов, пенициллина). Чаще локальные анафилактические реакции (атопии): аллергическая астма, крапивница, пищевая 2 тип ЦИТОТОКСИЧЕСКИЙ опосредуется IgM и IgG, направленными против антигенов собственных клеток. Цитолитический эффект - путем фиксации комплемента с иммуноглобулинами с образованием комплекса литической атаки, либо опсонизации клетки IgG и C3 для поглощения макрофагами / нейтрофилами, либо антитело-зависимой цитотоксичности К-клетками. при резус-несовместимости, аутоиммунной гемолитической анемии, агранулоцитозе, при переливании несовместимой крови. 3 тип ИММУНОКОМПЛЕКСНЫЙ опосредуется иммунными комплексами - комплексы IgG и IgG с антигенами - могут сохраняться в тканях / циркулировать в крови. В норме иммунные комплексы поглощаются макрофагами / лизируются комплементом. Активация комплемента приводит к повреждению тканей. Образовавшиеся в процессе активации комплемента его активные фракции (С3 и С5) могут участвовать в выбросе гистамина из базофилов, что приводит к расширению капилляров, поступлению плазмы в ткани, аггрегации тромбоцитов сосудов и последующему некрозу тканей. Сывороточная болезнь - при введении высоких доз антигена, например лечебной лошадиной противостолбнячной сыворотки. Через 6–7 дней в крови появляются антитела против лошадиного белка, которые, взаимодействуя с данным антигеном, образуют иммунные комплексы, откладывающиеся в стенках кровеносных сосудов и тканях. Развиваются системные васкулиты, артриты (отложение комплексов в суставах), нефрит (отложение комплексов в почках). Исследуют биоптаты тканей для выявления отложений иммуноглобулинов и комплемента с помощью РИФ. В иммунных комплексах, осажденных полиэтиленгликолем из крови, определяют IgG. После введения сывороточных препаратов возможны осложнения в виде анафилактического шока и сывороточной болезни. Поэтому перед введением препаратов ставят аллергическую пробу на чувствительность к ним пациента, а вводят их по методу Безредки дробно, небольшими порциями. 1) внутрикожно в предплечье 0,1 мл сыворотки, разведенной 1:100; 2) через 30 мин подкожно 0,1 мл неразведенной сыворотки; 3) через 60-90 мин вводят всю необходимую дозу (обычно внутримышечно). На каждом этапе следят за проявлениями аллергических реакций. Допустимо появление папулы до 1 см с небольшим покраснением. 20.Гиперчувствительность замедленного типа, механизмы ее возникновения. Инфекционная аллергия. Практическое использование кожных аллергических проб в диагностике инфекционных болезней. Клеточно-опосредованная реакция, лежащая в основе 4 типа, развивается через 24-48 часов после внедрения антигена и поэтому – ГЗТ=взаимодействии Т-л, которые были сенсибилизированы антигеном, с тем же антигеном=активация Т-л и секреция ими лимфокинов - локально увеличивают проницаемость сосудов и способствую инфильтрации тканей лейкоцитами в месте проникновения антигена. Моноциты, макрофаги и гранулоциты, активированные лимфокинами, освобождают в окружающие ткани ферменты, медиаторы, повреждая тем самым окружающие ткани. В этих же условиях могут активироваться Т-киллеры - связываются с антигенами на поверхности клеток-мишеней и, выделяя цитокин (белок перфорин), разрушаю их. инфекционная аллергия при туберкулезе, туляремии, бруцеллезе, контактная чувствительность (контактные дерматиты на косметические средства, лекарственные препараты , химические вещества. Инфекционная аллергия — повышенная чувствительность организма к возбудителям инфекционных и инвазионных процессов, а также к продуктам их жизнедеятельности. для всех инфекционных, включая вирусные, заболеваний, кроме некоторых острых токсикозов; для очаговых инфекций, вызываемых распространенными микробами; для паразитарных. Для определения гиперчувствительности (аллергии) к антигенам-аллергенам у людей проводят провокационные тесты - соответствующий аллерген вводят в организм, чаще внутрикожно / накожно. спустя 30 минут оценивают немедленные аллергические реакции, через 24-48 часов – замедленные. Геторологичные сывороточные белки при повторном введении могут стать причиной анафилактического шока, в основе которого аллергия немедленного типа, перед введением для выявления аллергии, а вместе с тем для временной десенсибилизации - кожная проба с соответствующим аллергеном. Реакции замедленной гиперчувствительности развиваются обычно на бактериальные антигены. Поскольку это является результатом инфицированности организма, такого рода кожные реакции можно использовать как один из методов диагностики инфекционных заболеваний (туберкулез, туляремия, бруцеллез и др.) и оценки эффективности вакцинации живой противотуберкулезной вакциной. Во всех этих случаях в качестве аллергена используется вытяжка из соответствующих микробов (туберкулин, тулярин, бруцеллин и т.д.). для выявления сенсибилизации к микобактериям туберкулеза - кожно-аллергическая проба Манту когда туберкулин PPD вводится внутрикожно. Для оценки иммунитета против дифтерии используют кожную иммунобиологическую пробу Шика, а для скарлатины – Дика. В этих пробах используют экзотоксины соответствующих микробов. Реакции основаны на нейтрализации токсина антитоксинами in vivo. При наличии у испытуемого антител, они нейтрализуют токсин в коже, поэтому гиперемии не будет (реакция отрицательна). Наоборот, при отсутствии антител, экзотоксин вызывает гиперемию (реакция положительна). 21.Вакцинопрофилактика и вакцинотерапия. Типы вакцин, их получение.Адъюванты. Анатоксины, их применение. Вакцины – препараты для иммунопрофилактики инфекционных заболеваний. В качестве действующего начала в вакцинах: живые, ослабленные микроорганизмы (бактерии, вирусы) инактивированные микробные клетки отдельные антигенные компоненты бактерий и вирусов вторичные, продуцируемые микробными клетками метаболиты, например, токсины и их обезвреженные– анатоксины полученные химическим синтезом молекулярные антигены микробов, вирусов полученные генно-инженерным спос антигены микроорганизмов, вирусов Аттенуированные живые: содержат аттенуированные штаммы бактерий, вирусов (с пониженной вирулентностью, но сохранившие антигенные свойства). получают путем воздействия неблагоприятных для микробов факторов: хим (ингибиторы роста), физ (температура, радиация), биол (пассажи через организмы животных, культуры клеток, куриные эмбрионы). туляремийная, сибиреязвенная, чумная, бруцеллезная, гриппозная, коревая, полиомиелитная, паротитная вакцины. Дивергентные живые: на основе природных штаммов микроорганизмов, имеющих общую антигенность с возбудителем для человека. оспенная вакцина (вирус коровьей оспы), BCG (вакцина содержит возбудителя туберкулеза крупного рогатого скота). Рекомбинантные: используют непатогенные микроорганизмы (кишечная палочка, вирус осповакцины, дрожжи), в геном которых встроены гены патогенных микробов, отвечающие за синтез протективных антигенов. дрожжевая вакцина против гепатита В. Убитые - содержат культуру бактерий или вирусов, убитых способом (нагревание, действие УФ-лучей, ионизирующей радиации, обработка формалином, спиртом, фенолом). В результате инактивации теряют жизнеспособность, но сохраняют антигенные и иммуногенные свойства. Корпускулярные: из инактивированных цельных клеток бактерий (цельноклеточные) / из вирионов (цельновирионные). коклюшная, холерная моновакцина, брюшнотифозная; цельновирионные – в. против гриппа, бешенства, клещевого энцефалита, герпеса. В последние 20 лет в России ведутся работы по созданию прниципиально новых вакцинирующих препаратов контролируемого содержания. В их основе - высокоочищенные антигены: синтетические / рекомбинантные аналоги протективных антигенов возбудителей. одновременно для целевых антигенов создаются полимерные молекулы-носители, позволяющие значительно повысить иммунный ответ у индивидуумов с генетически обусловленной слабовыраженной реактивностью. Анатоксины – препараты, получаемые из экзотоксинов микробов, путем их обезвреживания (дифтерийный, столбнячный, стафилококковый). бактерии культивируют на жидкой питательной среде и отделяют их от экзотоксинов методом фильтрования. К полученному фильтрату добавляют формальдегид 0,4%- для обезвреживания. Обезвреживание - при 37°С-40°С в течение 4 недель. При таком режиме полностью утрачивается токсичность, но сохраняются антигенные и иммуногенные свойства токсинов. подвергают очистке от балластных веществ. дозируют в антигенных или имуногенных единицах (ЕС – единицы связывания или Lf – единицы флокуляции). К очищенному анатоксину для усиления иммуногенных св + адъювант. Адъюванты – (помощник) –группа веществ, повышающих иммуногенные свойства вакцин и анатоксинов. различные по природе и физико-химическим свойствам вещества: гель гидрата окиси / фосфата алюминия, липиды, эмульгаторы, полимерные соединения, полисахариды бактерий или сами убитые бактерии (полный адъювант Фрейнда – взвесь убитых микобактерий в минеральном масле). Механизм действия адъювантов: создание "депо" антигена в месте введения препарата, в результате чего пролонгируется действие антигена на иммунную систему организма; усиление воспалительной реакции и активизация иммунокомпетентных клеток и угнетение функции Т-супрессоров; активация процесса захвата антигена и его переработки макрофагами. Они повышают иммуногенность вакцин, особенно молекулярных белковых антигенов (анатоксинов), которые без адъювантов быстро расщепляются ферментами организма. АД, АДС, АС-, стафилококковый анатоксин. Ассоциированные вакцины и поливакцин -содержат комплекс различных антигенов и применяются для одновременной иммунизации против нескольких инфекций. АКДС(сорбированные на гидроокиси алюминия столбнячный, ботулинический А, В, Е и гангренозные перфрингенс и нови-анатоксины); полиомиелитная – живая пероральная вакцина из 3-х аттенуированных штаммов вирусов I, II, III типов; живая вакцина против кори, краснухи, паротита. Различают первичную иммунизацию (вакцинацию) и повторную иммунизацию (ревакцинацию). При первичной иммунизации создается первичный активный искусственный иммунитет и повышенная способность реагировать на антиген (иммунологическая память), в результате чего при ревакцинации организм более активно и быстро отвечает на антиген. Вакцины, анатоксины обеспечивают выработку специфического активного искусственного иммунитета спустя 2-3 недели после первичной иммунизации и через 2-7 после ревакцинации (повторной иммунизации). В нашей стране, в соответствии с принятым федеральным законом №157, ФЗ "Об иммунопрофилактике инфекционных заболеваний", проводится обязательная вакцинация против туберкулеза, гепатита В, полиомиелита, коклюша, дифтерии, столбняка, кори, коревой краснухи, паротита. В "календаре" (с 2002г.) указаны схемы и сроки прививок с момента рождения и в определенные периоды жизни каждого человека. (до 12 часов жизни) Первая вакцинация против вирусного гепатита В (3-7 дней) Вакцинация против туберкулеза 1 месяц Вторая вакцинация против вирусного гепатита В 3 месяца против дифтерии, коклюша, столбняка, полиомиелита 4,5 месяца против дифтерии, коклюша, столбняка, полиомиелита 6 месяцев против дифтерии, коклюша, столбняка. + 3 против гепатита В. 12 месяцев против кори, краснухи, эпидемического паротита 18 месяцев ревакцинация (повторная) против дифтерии, коклюша, столбняка, полиомиелита 20 месяцев Вторая ревакцинация против полиомиелита 6 лет Ревакцинация против кори, краснухи, эпидемического паротита 7 лет Ревакцинация против туберкулеза, Вторая ревакцинация против дифтерии и столбняка 13 лет Вакцинация против краснухи (девочки), вакцинация против гепатита В (ранее не привитым) 14 лет Третья ревакцинация против дифтерии, столбняка, туберкулеза, полиомиелита Ревакцинация против дифтерии и столбняка каждые 10 лет после последней ревакцинации Вакцины лечебные назначают при затяжных формах инфекций (дизентерия, бруцеллез, орнитоз, сап, брюшной тиф), для активации иммунитета и десенсибилизации организма. Лучший лечебный эффект имеют аутовакцины, т.е. вакцины, приготовленные из собственных микроорганизмов, вызвавших заболевание (фурункулез). 22.Вакцинопрофилактика. Рекомбинантные вакцины, принципы их получения. Вакцина - сложный иммунобиологический препарат, в состав наряду со специфическим антигеном стабилизаторы, консерванты, адъюванты. В качестве стабилизаторов, предохраняющих антиген от разрушения, при производстве или при длительном хранении вакцины, используют гомологичные белки (альбумин человека), сахарозо-агар-желатину и др. В качестве консервантов, не допускающих размножения случайно попавшейв препарат микрофлоры, применяют мертиолят (1:10 000), формалин. Для повышения иммуногенности антигена - различные адъюванты. Рекомбинантные (генноинженерные) вакцины: • гены, кодирующие основные антигены, встраиваются в геном непатогенного для че-ловека вектора (носителя) – вируса, бактерии, дрожжевой клетки; • при культивировании вектора in vitro образуется большое количество высокоиммуно-генных антигенов, которые сорбируют на адъюванте; • не содержат ничего, кроме протективного антигена и адъюванта; • проявляют наилучшие свойства за исключением низкой ассоциируемости; • примеры: гепатит В, грипп. 23.Иммунные сыворотки. Классификация. Основные принципы их получения. Применение в медицинской практике. Для экстренной защиты (пассивная иммунизация) организма от заболевания (лиц, пребывающих в инкубационном периоде или уже заболевших). По механизму действия - антитоксические (противодифтерийная, противостолбнячная, противоботулиническая) и антимикробные (противоменингококковая), противовирусные. Из сывороток получают концентрированный препарат - гамма-глобулин. Гетерологичный гамма-глобулин - из сыворотки гипериммунизированных животных (против бешенства, сибирской язвы), содержат чужеродные для человека сыворточные белки. Гомологичный гамма-глобулин - из плацентарной и донорской крови людей, имеющих высокие титры антител против определенных антигенов (противогриппозный, противокорввый, противостолбнячный гамма глобулин). Гомологичные гаммаглобулины (и антисыворотки), в отличие от гетерологичных, при введении почти не вызывают аллергических осложнений). получают путем гипериммунизации = многократной интенсивной иммунизации, животных (лошадей, ослов, кроликов) специфическим антигеном с последующим, в период максимального антителообразования, кровопусканием и выделением из крови иммунной сыворотки. Активность иммунных сывороток - в антитоксических единицах, в титрах (вируснейтрализующей, гемагглютинирующей, преципитирующей, агглютинирующей активности), т.е. тем наименьшим количеством антител, которое вызывает видимую или регистрируемую реакцию с определенным количеством специфического антигена. выражают в антитоксических единицах (АЕ) / в международных антитоксических (МE), т.е. количеством антитоксина, связывающего 100 Dlm или 1000 Dlm для белой мыши столбнячного токсина. Титр агглютинирующих или преципитирующих сывороток - в максимальных разведениях сыворотки, вызывающих соответствующие реакции с антигеном; вируснейтрализующие антитела — в разведениях, нейтрализующих определенное количество вируса при биопробах на культуре клеток, куриных эмбрионах / животных. С лечебной целью - вводят как можно раньше внутримышечно (внутривенно) в больших дозах. Профилактические дозы - значительно меньше, а препараты вводят внутримышечно обычно лицам, имевшим контакт с больным / источником инфекции, для создания пассивного иммунитета. При введении сывороточных препаратов иммунитет наступает через несколько часов, сохраняясь 2–3 нед. после введения гетерологичных и в течение 4–5 нед. — гомологичных сывороточных препаратов. После введения сывороточных препаратов возможны осложнения в виде анафилактического шока и сывороточной болезни. Поэтому перед введением препаратов ставят аллергическую пробу на чувствительность к ним пациента, а вводят их по методу Безредки дробно, небольшими порциями. В некоторых случаях прибегают к пассивно-активной иммунизации - одновременному введению сывороточных препаратов и вакцин, в результате чего быстронаступающий, но кратковременный пассивный иммунитет, обусловленный вводимыми антителами, подменяется через 2–3 нед. активным иммунитетом, возникающим в ответ на введение вакцины. для профилактики столбняка у раненых, при профилактике бешенства и других инфекций. 24. Серотерапия и серопрофилактика инфекционных болезней,антитоксические и антимикробные сыворотки.Гамма-глобулины гомологичные и гетерологичные,их изготовление и использование. Серотерапия и серопрофилактика - использование препаратов сыворотки крови с целью лечения или профилактики заболеваний (создания искусственного пассивного иммунитета). Иммунные сыворотки и иммуноглобулины применяют при многих инфекциях как с целью экстренной иммунопрофилактики (при непосредственной угрозе заболевания), так и с целью иммунотерапии. По направленности все сывороточные препараты можно разделить на 3 группы: антитоксические, антибактериальные, антивирусные. Наиболее эффективные – антитоксические. Их применяют для лечения инфекций, в патогенезе которых ведущая роль принадлежит экзотоксинам. К числу таких заболеваний относятся дифтерия, столбняк, ботулизм, газовая анаэробная инфекция. Антитоксическими являются сыворотки против ядов змей, паука каракурта. Антитела антитоксины блокируют рецепторный участок токсина. Он теряет способность адсорбироваться на клетках и утрачивает токсическое действие. Антибактериальные сыворотки в настоящее время используются редко. В числе применяющихся препаратов – противосибиреязвенный иммуноглобулин. Антивирусные сыворотки содержат вируснейтрализующие антитела инактивируют инфекционные свойства вирусов, препятствуя адсорбции вирусов на клетке. По физико –химическому состоянию сывороточные препараты подразделяют на иммунные сыворотки и иммуноглобулины . Иммунные сыворотки получают от животных, иммунизированных тем или иным антигеном. Они неполностью освобождены от балластных белков, вводятся в сравнительно больших объемах Иммуноглобулины – это высокоочищенная, концентрированная гамма – глобулиновая фракция сыворотки крови человека или животного. Содержат более высокий титр антител и вводятся в небольших объемах. По видовой принадлежности источников получения иммунные сыворотки и иммуноглобулины могут быть гетерологичными и гомологичными. Гетерологичные могут вызвать развитие анафилактического шока, поэтому вводятся дробно, по методу Безредки. Гомологичные препараты вводятся одномоментно, не реактогенны, обеспечивают пассивный иммунитет на 4 – 5 недель. В настоящее время общепризнанной моделью для получения иммунных сывороток является лошадь. Способ получения называется гипериммунизацией. Гетерологичные иммуноглобулины получают из сыворотки крови гипериммунизированных животных, а гомологичные – из сыворотки крови иммунных людей или специально вакцинированных доноров. Из гетерологичных иммуноглобулинов в настоящее время используются: противосибиреязвенный, антирабический, иммуноглобулины против клещевого и японского энцефалитов. Из гомологичных иммуноглобулинов применяют следующие: иммуноглобулин человека нормальный и специфические иммуноглобулины. ИГ нормальный готовят из сыворотки крови от 1000 здоровых доноров. Из специфических ИГвыпускают: противостолбнячный, противогангренозный, антистафилококковый, противогриппозный, антитоксический коклюшный и др. 25. Понятие о моноклональных антителах.Гибридная технология для их получения.Применение в медицинской практике Моноклональные антитела — антитела, вырабатываемые иммунными клетками, принадлежащими к одному клеточному клону, то есть произошедшими из одной плазматической клетки-предшественницы. Моноклональные антитела являются однородными и высокоспецифичными. Их продуцирует гибридома-популяция гибридной клетки,полученной слиянием антителобразующей клетки определенной специфичности с «бессмертной» опухолевой клеткой миеломы, не образующая антител.Например, спленоциты мыши, иммунизированной антигеном, сливают ( в среде полиэтиленгликоля) с клетками мышиной миеломы, в результате чего образуется гидрома. Затем отобранные селекций и размноженные В-лимфоциты гибридомного клона культивируют или прививают в брюшную полость мыши с асцитной опухолью, где в экссудате брюшной полости появляются моноклональные антитела одной специфичности. Применение: в клинико-диагностической практике, при терапии рака и аутоиммунных заболеваний, например, ревматоидного артрита) 26. Реакция иммунофлюресценции (РИФ). Реакция Кунса.Практическое применение . Различают три основные разновидности метода: прямой, непрямой, с комплементом. Реакция Кунса является методом экспресс-диагностики для выявления антигенов микробов или определения антител в тканях. Прямой метод РИФ основан на том, что антигены тканей или микробы, обработанные иммунными сыворотками с антителами, меченными флюорохромами, способны светиться в УФ-лучах люминесцентного микроскопа. Бактерии в мазке, обработанные такой люминесцирующей сывороткой, светятся по периферии клетки в виде каймы зеленого цвета. Непрямой метод РИФ заключается в выявлении комплекса антиген—антитело с помощью антиглобулиновой (против антитела) сыворотки, меченной флюорохромом. Для этого мазки из взвеси микробов обрабатывают антителами антимикробной кроличьеи диагностической сыворотки. Затем антитела, не связавшиеся антигенами микробов, отмывают, а оставшиеся на микробах антитела выявляют, обрабатывая мазок антиглобулиновой (антикроличьей) сывороткой, меченной флюорохромами. В результате образуется комплекс микроб + антимикробные кроличьи антител+антикроличьи антитела, меченные флюорохромом. Этот комплекс наблюдают в люминесцентном микроскопе, как и при прямом методе. 27. Иммуноферментный анализ (ИФА) и радиоиммунный анализ (РИА).Иммуноблотинг.Практическое применение. Иммуноферментный метод, или анализ (ИФА) ИФА — выявление антигенов с помощью соответствующих им антител, конъюгированных с ферментом-меткой. После соединения антигена с меченной ферментом иммунной сывороткой в смесь добавляют субстрат/хромоген. Субстрат расщепляется ферментом, и изменяется цвет продукта реакции — интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител. Твердофазный ИФА — наиболее распространенный вариант иммунологического теста, когда один из компонентов иммунной реакции (антиген или антитела) сорбирован на твердом носителе, например в лунках планшеток из полистирола При определении антител в лунки планшеток с сорбированным антигеном последовательно добавляют сыворотку крови больного, антиглобулиновую сыворотку, меченную ферментом, и субстрат (хромоген) для фермента. Каждый раз после добавления очередного компонента из лунок удаляют несвязавшие- ся реагенты путем тщательного промывания. При положительном результате изменяется цвет раствора хромогена. Твердофазный носитель можно сенсибилизировать не только антигеном, но и антителами. Тогда в лунки с сорбированными антителами вносят искомый антиген, добавляют иммунную сыворотку против антигена, меченную ферментом, а затем субстрата для фермента. Конкурентный вариант ИФА: искомый антиген и меченный ферментом антиген конкурируют друг с другом за связывание ограниченного количества антител иммунной сыворотки. Другой тест — искомые антитела и меченые антитела конкурируют друг с другом за антигены. ИФА применяют для диагностики вирусных, бактериальных и паразитарных болезней в частности для диагностики ВИЧ-инфекций, гепатита В и др., а также определения гормонов, ферментов, лекарственных препаратов и других биологически активных веществ, содержащихся в исследуемом материале в минорных концентрациях — 10 |(|н-10 12 г/л. Радиоиммунологический метод, или анализ (РИА) Высокочувствительный метод, основанный на реакции антиген—антитело с применением антигенов или антител, меченных радионуклидом (125J, 14С, 3Н, 51Сг и др.). После их взаимодействия отделяют образовавшийся радиоактивный иммунный комплекс и определяют его радиоактивность в соответствующем счетчике (бета- или гамма-излучение): интенсивность излучения прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител. При твердофазном варианте РИА один из компонентов реакции (антиген или антитела) сорбирован на твердом носителе, например в лунках микропанелей из полистирола. Другой вариант метода — конкурентный РИА. искомый антиген и меченный радионуклидом антиген конкурируют друг с другом за связывание ограниченного количества антител иммунной сыворотки. Этот вариант используют для определения количества антигена в исследуемом материале. РИА применяют для выявления антигенов микробов, определения гормонов, ферментов, лекарственных веществ и иммуноглобулинов, а также иных веществ, содержащихся в исследуемом материале в минорных концентрациях — 10"'°-н10"12 г/л. Метод представляет определенную экологическую опасность. Иммуноблоттинг Иммуноблоттинг (ИБ) — высокочувствительный метод, основанный на сочетании электрофореза и ИФА или РИА. Антиген выделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, затем переносят его (блоттинг — от англ. blot, пятно) из геля на активированную бумагу или нитроцеллюлоз- ную мембрану и проявляют с помощью ИФА. Фирмы выпускают такие полоски с «блотами» антигенов. На эти полоски наносят сыворотку больного. Затем после инкубации отмывают от несвязавшихся антител больного и наносят сыворотку против иммуноглобулинов человека, меченную ферментом. Образовавшийся на полоске комплекс антиген + антитело больного + антитело против Ig человека выявляют добавлением субстрата/хромогена, изменяющего окраску под действием фермента. ИБ используют как диагностический метод при ВИЧ-инфекции и др. 28.Серодиагностика инфекционных заболеваний. Реакции, применяемые для серодиагностики. Иммунные реакции используют при диагностических и иммунологических исследованиях у больных и здоровых людей. В основе их лежат реакции специфического взаимодействия антигена с антителом. Поскольку антигены идентифицируют с применением антител иммунных сывороток, эти методы получили название серологических (от лат. «serum» - сыворотка). Обнаружение в сыворотке крови больного антител против антигенов возбудителя позволяет поставить диагноз болезни. Серологические исследования применяют также для идентификации антигенов микробов, различных биологически активных веществ, групп крови, тканевых и опухолевых антигенов, иммунных комплексов, рецепторов клеток и др. При выделении микроба от больного проводят идентификацию возбудителя путем изучения его антигенных свойств с помощью иммунных диагностических сывороток, т.е. сывороток крови гипериммунизированных животных, содержащих антимикробные антитела. Это так называемая серологическая идентификация микроорганизмов. Для определения антител или антигенов применяют следующие реакции антиген—антитело: реакция агглютинации; реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации; реакция коагглютинации; реакция Кумбса; реакция торможения гемагглютинации; реакция преципитации; реакция нейтрализации; реакция связывания комплемента; реакция радиального гемолиза; реакция иммунного прилипания; реакция иммунофлюоресценции; иммуноферментный анализ; радиоиммунный метод, или анализ; иммуноблотинг; иммунная электронная микроскопия В зависимости от диагностической чувствительности все эти реакции можно условно разделить на три уровня. К первому уровню (наименьшему) относятся реакции прямой агглютинации, преципитации, РСК. Ко второму – реакции непрямой агглютинации, нейтрализации токсина, иммунофлюоресценции. К третьему – ИФА, иммуноблотинг (разновидность ИФА) и РИА. В последние годы разработаны и постоянно совершенствуются еще более чувствительные методы, индикации специфического взаимодействия антиген-антитело с помощью лазерного луча и компъютерного анализа, основанные на изменении в этих условиях поляризационных свойств среды (метод биочипов). |