Общая микробиология
 Скачать 0.8 Mb.
|
|
Хемокины — низкомолекулярные цитокины, ответственные за хемотаксис (привлекают в очаг воспаления лимфоциты и лейкоциты). Регулируют подвижность лейкоцитов. 11.Противовирусный иммунитет и его особенности. Интерферон, интерфероногены. Получение интерферона и применение в медицинской практике. Первым барьером, с которым сталкиваются вирусы - кожные покровы и слизистые. В случае нарушения их целостности активируются механизмы врожденного иммунитета. Если вирусы проникли в клетки - выработка инфицированными клетками ИФН 1 типа = Гибель инфицированных клеток с выделением цитокинов, медиаторов восп, хемокинов и антигенов, - миграцию в очаг клеток врожденного иммунитета. Первыми в зону разруш -нейтрофилы, далее макрофаги, дендритные, NK-клетки. Интерфероны усиливают противовирусную резистентность, индуцируя в клетках синтез ферментов, подавляющих образование нуклеиновых кислот и белков вирусов. оказывают иммуномодулирующее действие,усиливают в клетках экспрессию антигенов MHC (HLA). Интерфероны первого типа действуют неизбират, блокируя синтез не только вирусных, но и клеточных РНК и белков - гибели зараженной клетки. Интерферон второго типа - к факторам адаптивного иммунитета. Активирует NK-клетки, макрофаги и ЦТЛ, способствуя более эффективному уничтожению вирусинфицированных клеток и запуская микробоцидные мех макрофагов - гибель внутриклеточных патогенов. Слизистые защищены от вирусов секреторными IgA- и IgM-антителами, которые, окружая вирионы, препятствуют их адсосорб на эпителиоцитах. Действие антител (IgG, IgM), помимо нейтрализации вирусов и их опсонизации, способствуют разруш инфицированных вирусами клеток, активируя систему комплемента. В результате активации комплемента происходят сборка его МАК и лизис зараженных клеток. в феномене антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности в результате связывания NK-клеток с Fc-фрагментом антител, покрыв инфицированную клетку, что приводит к ее разрушению с помощью перфорин-гранзимного механизма. Цитотоксическое действие CD8+ Т-лимфоцитов (ЦТЛ), распознающих вирусные пептиды в комплексе с MHC I класса на поверхности инфицированных вирусом клеток. появляются через 3–4 дня после инфицирования, а пик к 7–10-му дню. ЦТЛ скапливаются в очагах размнож вирусов и разрушают инфицированные клетки. продуцируют перфорины и гранзимы. Перфорины на поверхности клетки-мишени, полимеризуясь, формируют трансмембранные поры, через которые в клетку - вода, в результате чего клетка гипергидратируется и гибнет. также поступают гранзимы, которые вызывают фрагментацию ДНК клетки и деградацию вирусной ДНК. (ИФН) — гликопротеины, вырабатываемые клетками в ответ на вирусную инфекцию и другие стимулы; оказывают противовирусное, противобактериальное, противоопухолевое и иммуномодулирующее действие. блокируют репродукцию вируса в других клетках и участвуют во взаимодействии между клетками иммунной системы. Противовирусное действие -олигоаденилатсинтетаза - к активированию клеточной РНКазы - расщепляющей вирусные РНК в аппарате трансляции; протеинкиназа - фосфорилируя и инактивир фактор eIF-2, подавляет трансляцию белков клетки и вируса; белок Mx+с РНК-полимеразой вируса, блокирует ее актив. Выработка интерферона резко возрастает при инфицировании вирусами, а также при воздействии индукторов интерферона, например РНК, ДНК, сложных полимеров. Такие индукторы интерферона получили название интерфероногенов. Получают: а) путем инфицирования лейкоцитов крови человека безопасным вирусом - инфицированные клетки – интерферон - выделяют и конструируют из него препараты интерферона; б) генно-инженерным— путем выращивания в производственных условиях рекомбинантных штаммов бактерий, способных продуцировать интерферон. псевдомонад, кишечной палочки со встроенными в их ДНК генами интерферона. «Реаферон». 12.Антитоксины. Принципы получения. Применение антитоксических сывороток в медицине. Побочные действия серотерапии и их профилактика. Антитоксины — специфические антитела, образующиеся в организме под действием токсинов (анатоксинов) микробов, ядов растений и животных, обладающие способностью нейтрализовать. Выполняют главную защитную роль при токсинемических инфекциях (столбняке, дифтерии, ботулизме, газовой гангрене, некоторых стрептококковых и стафилококковых заболеваниях). Могут синтезироваться в результате естественного контакта организма с токсинами, при искусственном введении их в организм животных в сублетальных дозах и при иммунизации анатоксинами человека или животных. Широкое применение в медицине - антитоксические сыворотки против токсинов, выделяемых патогенными микроорганизмами (палочками дифтерии, столбняка, газовой гангрены и ботулизма) для профилактики и лечения. получают путем гипериммунизации лошадей возрастающими дозами токсинов. Антитоксины против ботулизма и газовой гангрены поливалентны, то есть содержат антитела к нескольким токсинам. Анатоксины – препараты, получаемые из экзотоксинов микробов, путем их обезвреживания (дифтерийный, столбнячный, стафилококковый). Чтобы получить анатоксин, бактерии культивируют на жидкой питательной среде и отделяют их от экзотоксинов методом фильтрования. К полученному фильтрату добавляют формальдегид 0,4%-ной концентрации для обезвреживания токсина. Обезвреживание происходит при температуре 37°С-40°С в течение 4 недель. При таком режиме полностью утрачивается токсичность, но сохраняются антигенные и иммуногенные свойства токсинов. Анатоксин подвергают очистке от балластных веществ. Анатоксины дозируют в антигенных или имуногенных единицах (ЕС – единицы связывания или Lf –единицы флокуляции). К очищенному анатоксину для усиления его иммуногенных свойств добавляют адъювант. Адъюванты – (adjuvant – помощник) – это группа веществ, повышающих иммуногенные свойства вакцин и анатоксинов. В качестве адъювантов используют различные по природе и физико-химическим свойствам вещества: гель гидрата окиси или фосфата алюминия, липиды, эмульгаторы, полимерные соединения, полисахариды бактерий или сами убитые бактерии (полный адъювант Фрейнда – взвесь убитых микобактерий в минеральном масле), сапонины и др. Механизм действия адъювантов: создание "депо" антигена в месте введения препарата, в результате чего пролонгируется действие антигена на иммунную систему организма; усиление воспалительной реакции и активизация иммунокомпетентных клеток и угнетение функции Т-супрессоров; активация процесса захвата антигена и его переработки макрофагами. Адъюванты повышают иммуногенность вакцин в десятки и более раз, особенно молекулярных белковых антигенов (анатоксинов), которые без адъювантов быстро расщепляются ферментами организма. Примеры: АД, АДС, АС-анатоксины, стафилококковый анатоксин. Антитела иммунной сыворотки способны нейтрализовать повреждающее действие микробов/их токсинов на клетки и ткани - связано с блокадой микробных антигенов антителами, т. е. их нейтрализацией. проводят путем введения смеси антиген—антитело животным или в чувствительные тест-объекты (культуру клеток, эмбрионы). При отсутствии у животных и тест-объектов повреждающего действия микроорганизмов или их антигенов, токсинов говорят о нейтрализующем действии иммунной сыворотки. Постановка реакции преципитации в геле, поставленной с целью определения токсигенности дифтерийных культур (р. Илека). На чашку Петри с питательной средой - полоску фильтрованной бумаги, пропитанную антитоксической противодифтерийной сывороткой. На расстоянии 0,6-0,8 см от края полоски - методом бляшек исследуемые культуры дифтерийной палочки. инкубируют при 37°С в течение суток. Контроль - заведомо токсиген культура При наличии токсигенной культуры в месте взаимодействия токсина с антитоксином образуется линия преципитации в виде дуги. 4 варианта осложнений серотерапии: АШ, сывороточная болезнь, двойная анафилактическая реакция, феномен Артюса. Анафилактический шок - сразу же после введения. Сывороточная болезнь - через 6—12 дней (инкубационный период) после введения - проявляется лихорадкой, отеком слизистых, лимфаденитом, пятнисто-папулезной сыпью. в связи с использованием высоко-очищенной сыворотки - редко. Двойная анафилактическая реакция - возникновением у 1 пациента вначале АШ, а затем сывороточной болезни. Феномен Артюса - при длительном введении сыворотки после 6-го дня с момента первого введения. на месте повторной инъекции возможно развитие тяжелого некротического процесса. Для предупреждения анафилактического шока до введения - проводят оценку индивидуальной реакции больного на вводимый препарат, вначале разведенный 1:100 (внутрикожно, 0,1 мл), затем подкожно (нативный препарат, 0,1 мл) и затем всю дозу (в/мышечно или в/венно, по показаниям) метод Безредки = После подкожного введения сенсибилизированным субпороговых (в 50 раз меньших смертельной) доз специфического антигена - резистентными к повторному введению смертельных доз этого антигена - в постепенном насыщении антигеном антител, фиксированных на тканях. возможность действия сывороточных антигенов в качестве веществ, уменьшающих содержание гистамина в организме. 13.Агглютинины. Реакция агглютинации, ее разновидности. РНГА, РОНГА. Реакция Кумбса (антиглобулиновый тест). Их применение. Реакция агглютинации — склеивание корпускул (бакт, эритро) антителами в присутствии электролитов. Проявляется в виде хлопьев или осадка, состоящих из корпускул, «склеенных» антителами. Антиген (корпускулярный!) - бактериальные клетки, клетки крови, индифферентные нерастворимые частицы или клетки с адсорбированными на них антигенами. ПРИМЕНЕНИЕ: определение возбудителя, выделенного от больного; определение антител в сыворотке крови больного; групп крови. Агглютинины - АТ, которые вызывает реакцию агглютинации клеток крови, бактерий и ряда других антигенных частиц, находятся в плазме крови. 1. Определение возбудителя - Ориентировочная р агглютинации на стекле. К капле диагностической агглют сыворотки (1:20) + взвесь бактерий от больного = хлопьевидный осадок. родственные бактерии могут агглютинироваться одной диагностической агглют сывороткой - затрудняет идентификацию. Поэтому из агглют сывороток удаляют групповые антитела адсорбцией их родственными бактериями (р.Кастеллани) - сохраняются антитела, специфичные только для 1 вида микроорганизмов - монорецепторные адсорбированные диагностические сыворотоки. 2. Определение антител в сыворотке больного Развернутая р агглютинации с сывороткой больного. К разведениям сыворотки + диагностикум. —с О-диагностикумом (бактерии, убитые нагреванием, сохранившие 0-антиген) = в виде мелкозернистой агглютинации. —с Н-диагностикумом (бактерии, убитые формалином, сохранившие жгутиковый Н-антиген) = крупнохлопчатая и протекает быстрее. ставится с разными разведениями сыворотки для определения титра антител. Нарастание титра специфических антител в сыворотке больного говорит об инф заболевании - реакции титрования иммунной сыворотки, р. Видаля для диагностики брюшного тифа, р. Райта для диагностики бруцеллеза. 3. Р агглютинации для определения групп крови. для установления системы АВО с помощью агглютинации эритроцитов антителами иммунной сыворотки против антигенов групп крови А (II), В (III). Контроль: сыворотка, не содержащая антител - сыворотка АВ (IV) группы; антигены, содержащиеся в эритроцитах групп А (II), В (III). Отрицательный контроль не содержит антигенов - эритроциты группы О (I). Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинацииназываются непрямыми (пассивными) т.к. при их проведении используют антигены (или антитела), искусственно адсорбированные на поверхности различных корпускулярных частиц. - выявляют антитела сыворотки крови больного с помощью антигенного эритроцитарного диагностикума - эритроциты с адсорбированными на них антигенами + соответствующие антителами сыворотки крови = склеивание и выпадение эритроцитов на дно пробирки в виде фестончатого осадка. При отрицательной = оседают в виде «пуговки». ставят в пластиковых планшетках / пробирках с разведениями сыворотки больного, к которым добавляют эритроцитарный диагностикум. р обратной непрямой гемагглютинации — РОНГА - антительный эритроцитарный диагностикум — эритроциты, на которых адсорбированы антитела. можно обнаружить ботулинический токсин, добавляя к нему эритроцитарный антительный ботулинический диагностикум. Реакцию коагглютинации- Клетки возбудителя определяют с помощью стафилококков, предварительно обработанных иммунной диагностической сывороткой. Стафилококки, содержащие белок А, имеющий сродство к Fc-фрагменту иммуноглобулинов, неспецифически адсорбируют антимикробные антитела, которые затем взаимодействуют активными центрами с соответствующими микробами, выделенными от больных. В результате коагглютинации образуются хлопья из стафилококков, антител диагностической сыворотки и определяемого микроба. РНГА обычно ставят на планшетках с лунками. Исследуемую сыворотку предварительно инактивируют при 56˚С в течение 30 минут для разрушения комплемента и разводят от 1:10 до 1:12 000 и более, разливают в лунки до 0,5 мл и добавляют по 0,1 мл эритроцитарного диагностикума. (выявление специфических антител в сыворотке больного при брюшном тифе, туляремии, гриппе, риккетсиозах, хламидиозах), а также для определения гонадотропного гормона в моче при установлении беременности, определения поствакцинального иммунитета при дифтерии. Реакция Кумбса - для определения антирезусных антител (непрямая). У некоторых больных обнаруживают антирезусные антитела - неполные, одновалентные. Они специфически взаимодействуют с резус-положительными эритроцитами (Rh+), но не вызывают их агглютинации. Наличие таких неполных антител определяют в непрямой реакции Кумбса. к резус-положительным эритроцитам с сорбированными на них неполными антителами + антиглобулиновую сыворотку (антитела против иммуноглобулинов человека получены путем иммунизации кролика человеческим гамма-глобулином) = + феномен склеивания эритроцитов. разновидностью непрямой реакцией гемагглютинации. ПРИМЕНЕНИЕ: диагностируют патологические состояния, связанные с внутрисосудистым лизисом эритроцитов - гемолитическую болезнь новорожденных: Эритроциты резус-положительного плода соединяются с циркулирующими в крови неполными антителами к резус-фактору, которые перешли через плаценту от резус-отрицательной матери. Можно также выявлять неполные антитела против антигенных микробов (например, при бруцеллезе).  14.Преципитины. Реакция преципитации, ее разновидности: кольцепреципитация, преципитация в геле, реакция флокуляции, реакция микропреципитации. Применение в медицине. РП - осаждение высокодисперсных антигенов (в коллоидном состоянии) - специфическими антителами (преципитинами) в присутствии электролита в эквивалентных количествах. Антиген должен быть прозрачным. ставят в пробирках (реакция кольцепреципитации), в гелях, питательных средах. в полужидком геле агара: двойная иммунодиффузия по Оухтерлони, радиальная иммунодиффузия, иммуноэлектрофорез. ПРИМЕНЕНИЕ: выявление антигена по известной преципитирующей сыворотке, содержащей антитела: диагн СЯ, чумы, туляремии, определяют видовую специфичность белка, выявляют фальсификацию пищевых продуктов, в клинической иммунологии - уровень имунноглобулинов в сыворотке. Для приготовления коллоидных антигенов - методы экстракции из исследуемого материала: физические, химические и биологические. Бактериальный АГ - путем экстрагирования из чистых культур бактерий, из патологического материала / из объектов внешней среды, обсемененных микробами (диагностика сибирской язвы, чумы, туляремии). При постановке РП разводят не сыворотку, а антиген. титр преципитирущей сыворотки - наибольшее разведение антигена, которое при взаимодействии со стандартной иммунной сывороткой вызывает образование преципитата. Р. кольцепреципитации - на слой антисыворотки наслаивают жидкость, содержащую растворимый антиген = несколько секунд образование кольца преципитата. термопреципитации (р.Асколи) на АГ возбудителя сибирской язвы, использующая антигены, экстрагированные кипячением из различного сельскохозяйственного сырья. Р. микропреципитации - для выявления низких титров антител. в исследуемую сыворотку + антиген в убывающей концентрации; при отсутствии антител антиген уменьшает ее оптическую плотность. Однако в присутствии минимальных количеств антител образуются микропреципитаты, повышающие оптическую плотность среды. Р. флокуляции –в системах токсин-антитоксин или анатоксин-антитоксин. Проявляется появлением хлопьевидного осадка. для определения активности антитоксических сывороток или анатоксина. РП в геле (иммунодиффузия) в различных модификациях: простая иммунодиффузия (по Уанье), встречная (по Оухтерлони), радиальная (по Манчини). Методы простой диффузии основаны на способности Аг, внесенного сверху в лунки и ли пробирки с агаром, диффундировать в гель. При постановке реакций двойной (встречной) диффузии Аг и Ат вносят в отдельные лунки- для выявления белковых Аг в различных жидкостях и тканевых экстрактах. Вариантом простой одномерной иммунодиффузии - тест Илека для выявления токсинообразования у возбудителя дифтерии. Иммуноэлектрофорез - объединяет РП в геле с элетрофорезом. слой агара наносят на предметное стекло; на его разных краях вырезают две лунки, а в центре – разделяющую их канавку. В лунки вносят смесь Аг и проводят электрофорез в течение 1-2 часов. Различные Аг с разной скоростью перемещаются между катодом («старт») и анодом («финиш»). Затем в канавку вносят преципитирующую сыворотку и, в случае положительного результата, в геле образуются зоны преципитации. |