Общая микробиология
 Скачать 0.8 Mb.
|
|
Условно можно выделить четыре механизма проникновения питательных веществ в бактериальную клетку: это простая диффузия, облегченная диффузия, активный транспорт, транслокация групп. Простоя диффузия, при которой перемещение веществ происходит вследствие разницы их концентрации по обе стороны цитоплазматической мембраны. Вещества проходят через липидную часть цитоплазматической мембраны (органические молекулы, лекарственные препараты) и реже по заполненным водой каналам в цитоплазматической мембране. Пассивная диффузия осуществляется без затраты энергии. Облегченная диффузия происходит также в результате разницы концентрации веществ по обе стороны цитоплазматической мембраны. Однако этот процесс осуществляется с помощью молекул-переносчиков. Каждый переносчик транспортирует через мембрану соответствующее вещество или передает другому переносчику Активный транспорт происходит с помощью пермеаз и направлен на перенос веществ от меньшей концентрации в сторону большей, т.е. как бы против течения, поэтому данный про цесс сопровождается затратой метаболической энергии (АТФ), образующейся в результате окислительно-восстановительных реакций в клетке. Перенос (транслокация) групп сходен с активным транспортом, отличаясь тем, что переносимая молекула видоизменяется в процессе переноса, например фосфорилируется. Выход веществ из клетки осуществляется за счет диффузии и при участии транспортных систем. Биовар — внутривидовая систематическая категория, разновидность штамма прокариот, которая имеет биохимические и/или физиологические признаки, отличающие её от других штаммов внутри определённого вида. Хемовар - внутриподвидовая категория для обозначения штамма или группы штаммов бактерий, выделяемых на основе биохимических или физиологических свойств Серовар (серовариант, серологический вариант), также сероти́п — группа микроорганизмов одного вида, объединяемых общей антигенной структурой, определяемой серологическими методами диагностики. В микробиологии культурой бактерий называют популяцию микроорганизмов, растущую на питательной среде, которая используется в научных и медицинских целях. Штамм — (нем. Stamm) биол. в микробиологии: чистая культура микроорганизмов данного вида, выделенная из определенного источника. штамм (нем. stamm) в микробиологии чистая культура микроорганизмов или вирусов Клон — (от греч. klon ветвь, отпрыск), совокупность клеток или особей, происшедших от общего предка путем бесполого размножения от одной исходной особи, которая возникла в свое время половым путем. 6. Структура и химический состав бактериальной клетки. Основные отличия прокариотов от эукариотов. Субклеточные формы бактерий: протопласты, сферопласты, L-формы. По классификации Берджи бактерии относятся к прокариотам. Клетки прокариот имеют более простое строение, чем у эукариот. Они имеют: клеточную стенку, цитоплазматическую мембрану, цитоплазму, рибосомы, мезосомы и ядерную субстанцию (нуклеоид), состоящую из ДНК. Бактериальная клетка по своим размерам (1-10 мкм) меньше эукариотов, величина последних колеблется от 10 до 100 мкм. У прокариотов в отличие от эукариотов отсутствует ядерная мембрана, гистоны, аппарат Гольджи, митохондрии и хлоропласты, в клеточной стенке отсутствуют стероиды и отсутствует тканевая дифференцировка. У бактерий всего одна хромосома, а эукариоты имеют диплоидный набор хромосом. У бактерий бинарный способ размножения, а эукариот – митотический. У бактерий часто встречается анаэробный тип дыхания, у эукариотов он обычно отсутствует. Бактериальная клетка также может иметь необязательные (дополнительные) компоненты, такие как капсула, споры, жгутики, включения (например, зерна волютина). Они выявляются с помощью сложных методов окраски или специальных методов исследования (например, микроскопия препаратов, приготовленных из живых бактерий) Клеточная стенка. В клеточной стенке грамположительных бактерий содержится небольшое количество полисахаридов, липидов, белков. Основным компонентом толстой клеточной стенки этих бактерий является многослойный (до 40 слоев) пептидогликан (муреин, мукопептид), составляющий 40-90 % массы клеточной стенки. С пептидогликаном клеточной стенки грамположительных бактерий ковалентно связаны тейхоевые кислоты (от греч. teichos — стенка). В состав клеточной стенки грамотрицательных бактерий входит наружная мембрана, связанная посредством липопротеина с подлежащим слоем пептидогликана (не более 2-х слоев). На ультратонких срезах бактерий наружная мембрана имеет вид волнообразной трехслойной структуры, сходной с внутренней мембраной, которую называют цитоплазматической (рис.2). Основным компонентом этих мембран является бимолекулярный (двойной) слой липидов. Внутренний слой наружной мембраны представлен фосфолипидами, а в наружном слое расположен липополисахарид. Липополисахарид наружной мембраны состоит из 3 фрагментов: липида А — структуры, практически одинаковой у всех грамотрицательных бактерий; ядра, или стержневой, части и высоковариабельной О-специфической цепи полисахарида (0-антиген). Белки матрикса наружной мембраны пронизывают ее таким образом, что молекулы белка, называемые поринами, окаймляют гидрофильные поры, через которые проходят вода и мелкие гидрофильные молекулы. Между наружной и цитоплазматической мембранами находится периплазматическое пространство, или периплазма, содержащая ферменты (протеазы, липазы, фосфатазы, нуклеазы, бета - лактамазы) и компоненты транспортных систем. При резком нарушении синтеза клеточной стенки бактерии чаще всего погибают. Например, это может происходить под воздействием антибиотиков-ингибиторов синтеза пептидогликанов (пенициллин и др.) В ряде случаев под влияние лизоцима, пенициллина, защитных факторов организма могут образоваться клетки с измененной (часто шаровидной) формой: протопласты — бактерии, полностью лишенные клеточной стенки; сферопласты — бактерии с частично сохранившейся клеточной стенкой. Бактерии сферо- или протопластного типа, утратившие способность к синтезу пептидогликана под влиянием антибиотиков или других факторов и способные размножаться, называются L-формами. Они способны поддерживать развитие хронического инфекционного процесса. Некоторые L-формы (нестабильные) при удалении фактора, приведшего к изменениям бактерий, могут реверсировать, «возвращаясь» в исходную бактериальную клетку. Жгутики бактерий определяют подвижность бактериальной клетки. Жгутики представляют собой тонкие нити, берущие начало от цитоплазматической мембраны, имеют большую длину, чем сама клетка. Толщина жгутиков 12-20 нм, длина 3-15 мкм. Они состоят из 3 частей: спиралевидной нити, крюка и базального тельца, содержащего стержень со специальными дисками (1 пара дисков — у грамположительных и 2 пары дисков — у грамотрицательных бактерий). Дисками жгутики прикреплены к цитоплазматической мембране и клеточной стенке. При этом создается эффект электромотора со стержнем-мотором, вращающим жгутик. Жгутики состоят из белка — флагеллина (от flagellum — жгутик), являющегося Н-антигеном. Субъединицы флагеллина закручены в виде спирали. Число жгутиков у бактерий различных видов варьирует от одного (монотрих) у холерного вибриона до десятка и сотен жгутиков, отходящих по периметру бактерии (перитрих) у кишечной палочки, протея и др. Лофотрихи имеют пучок жгутиков на одном из концов клетки. Амфитрихи имеют по одному жгутику или пучку жгутиков на противоположных концах клетки. Пили (фимбрии, ворсинки) — нитевидные образования, более тонкие и короткие (3-10 нм х 0,3 мкм), чем жгутики. Пили отходят от поверхности клетки и состоят из белка пилина, обладающего антигенной активностью. Различают пили, ответственные за адгезию, т. е. за прикрепление бактерий к поражаемой клетке, а также пили, ответственные за питание, водно-солевой обмен и половые (F-пили), или конъюгационные, пили. Пили многочисленны — несколько сотен на клетку. Однако половых пилей обычно бывает 1-3 на клетку: они образуются так называемыми «мужскими» клетками-донорами, содержащими трансмиссивные плазмиды (F-, R-, CoL-плазмиды). Отличительной особенностью половых пилей является взаимодействие с особыми «мужскими» сферическими бактериофагами, которые интенсивно адсорбируются на половых пилях. Протопласты – формы прокариот, полностью лишенные клеточной стенки, образуются обычно у грам «+» бактерий. Сферопласты– бактерии с частично разрушенной клеточной стенкой. Наблюдаются чаще у грам «-» бактерий, реже у грам «+». Образуются в результате разрушения пептидогликанового слоя литическими ферментами: например, лизоцимом или блокирование биосинтеза пептидогликана антибиотиками, например, пенициллином в среде с соответствующим осмотическим давлением. Протопласты и сферопласты имеют сферическую форму или полусферическую, и в 3-10 раз крупнее исходных клеток. В обычных условиях наступает осмотический лизис и они погибают. L-формы бактерий – это фенотипические модификации, или мутанты бактерий, частично или полностью утратившие способность синтезировать пептидогликан клеточной стенки. Свое название они получили в связи с тем, что были выделены и описаны в институте Листера в Англии в1935 г. образуются под воздействиемL-трансформирующих агентов – антибиотиков (пенициллина, стрептомицина, полимиксина и др.), аминокислот (глицина, лейцина и др.), фермента лизоцима, ультрафиолетовых и рентгеновых лучей. В отличие от протопластов и сферопластовL-формы обладают относительно высокой жизнеспособностью и выраженной способностью к репродукции.L-формы бактерий полиморфны: встречаются элементарные тельца 0,2-1 мкм, шары- 1-5, большие тела- 5-50, нити. Способностью кL-трансформации обладают практически все виды бактерий.L-формы бактерий в отсутствии фактора, вызвавшего их образование, реверсируют в исходные клетки (для частично утративших синтезировать пептидогликан). L-формам придается большое значение в развитии хронических рецидивирующих инфекций, носительстве возбудителей, длительной персистенции их в организме. 7. Основные методы исследования морфологии бактерий. Микроскопия. Методы окраски микробов (метод Грама, Циля – Нильсена) и их отдельных структур. Окраска по методу Грама является самым универсальным из сложных методов окраски. Окраска положена в основу дифференциации бактерий и отражает способность клеток воспринимать и удерживать внутри клетки красящий комплекс генцианового фиолетового и иода, либо терять его после обработки спиртом. В характеристике микроба каждого вида обязательно указывают на отношение к окраске по Граму. Все бактерии по отношению к этому методу окраски делятся на две группы: грамположительные и грамотрицательные: (Bacillus, Clostridium, Staphylococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Sarcina, etc.) и грамотрицательные (Escherichia, Pseudomonas, Erwinia, Neisseria, Rickettsia, etc.) формы. Отношение бактерий к окраске по Граму определяется их способностью удерживать образовавшийся в процессе окраски комплекс генцианвиолета и йода. У грамположительных бактерий основным веществом клеточной стенки (до 90%) являются мукопептиды - муреин (пептидогликан) в соединении с тейхоевой кислотой и рибонуклеатом магния. У грамотрицательных бактерий однослойный муреин располоагается в глубине клетки, значительно больше содержится белков и липидов, которые вместе с полисахаридами образуют поверхностные слои в виде мозаики, их цитоплазма содержит РНК и ДНК в соотношении 8:1 и 1:1 соответственно. Кроме того, проницаемость клеточной стенки у грамположительных бактерий меньше, чем у грамотрицательных. Это объясняется также меньшим диаметром пор у грамположительных бактерий, что способствует удержанию образовавшегося комплекса при обработке бактерий этиловым спиртом. Техника окраски по Граму (модификация Синева) 1. На препарат кладут полоску фильтровальной бумаги, окрашенной карболовым генцианвиолетом. и смачивают несколькими каплями воды. 2. Через полторы-две минуты бумажку снимают и на препарат наносят раствор Люголя на 1 минуту. 3. Сливают раствор Люголя и, не промывая водой, действуют спиртом несколько секунд до прекращения отхождения красителя от мазка. 4. Тщательно промывают препарат водой. 5. Докрашивают разведенным фуксином 1-2 минуты. 6.Промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой и рассматривают препарат с иммерсионной системой. Грамположительные микробы - фиолетового цвета, грамотрицательные - красного. Метод назван именами немецких медиков — микробиолога Франца Циля (1857—1926) и патологоанатома Фридриха Нельсена (1854—1898), которые разработали его в 1882—1883 гг. Метод окраски микроорганизмов для выявления кислотоустойчивых микобактерий (возбудителей туберкулёза, микобактериозов, лепры), актиномицетов и других кислотоустойчивых микроорганизмов. Кислотоустойчивость микроорганизмов обусловлена наличием в их клетках липидов, воска и оксикислот. Фиксированный на пламени горелки мазок окрашивают в течение 3 – 5 мин. раствором карболового фуксина Циля или окрашенной фуксином бумажкой с подогреванием до появления паров, но не доводя краситель до кипения. Дают препарату остыть, бумажку снимают, сливают избыток красителя, препарат промывают водой. Окрашенный препарат обесцвечивают 5%-ным раствором серной кислоты в течение 3 – 5 с или 96° этиловым спиртом, содержащим 3% по объему хлористоводородной кислоты, несколько раз погружая стекло с мазком в стаканчик с солянокислым спиртом. После обесцвечивания остаток кислоты сливают и тщательно промывают препарат водой. Докрашивают дополнительно метиленовым синим Леффлера 3 – 5 мин. Окрашенный препарат промывают водой, подсушивают и микроскопируют. При окраске препаратов кислоустойчивые бактерии окрашиваются фуксином в рубиново-красный цвет и не обесцвечиваются кислотой. Для изучения морфологии бактерий применяют такие методы, как микроскопия и окрашивание. 8. Морфология, ультраструктура спирохет. Классификация. Патогенные виды. Методы выявления. Систематическое положение спирохет. Царство. Prokaryotae Отдел. Gracilicutes Порядок. Spirochaetales Семейство 1. Spirochaetaceae Роды.1.Treponema 2.Borrelia Семейство 2.Leptospiraceae Род. 3.Leptospira
Методы выявления спирохет. - Спирохеты плохо воспринимают красители. Обычно их окрашивают по методу Романовского-Гимзе или серебрением по Морозову, а также применяют негативное окрашивание по методу Бурри; в живом виде их исследуют с помощью фазово-котрастной и темнопольной микроскопии. Метод Романовского-Гимзе. Краситель состоит из эозина, метиленового синего и азура растворенных в смеси метанола с глицерином. Базофильная зернистость окрашивается в синий цвет, эозинофильная - в красный, а нейтрофильная - в сиреневый цвет. Техника окраски. 1. Приготовить микроскопический препарат и обработать его в жидком фиксаторе. 2. Поместить фиксированный препарат на два стеклянных валика в чашку Петри вниз ко дну и подливают разведенный в 10-20 раз свежеприготовленный краситель. Окрашивание длится от 30-60 минут до нескольких часов. 3. Мазки промывают водой и высушивают на воздухе. 9. Внутриклеточные паразиты: бактерии семейств Ricketsiaceae и Chlamidiaceae. Морфология и ультраструктура. Патогенные виды. Риккетсии – мелкие грамотрицательные палочковидные бактерии, относящиеся к отделу Gracilicutes (грациликуты). Структура риккетсий не отличается от таковой грамотрицательных бактерий, имеющих тонкую клеточную стенку. Патогенный вид Риккетсии имеют широкий диапазон патогенности и могут быть разделены по этому признаку на три группы: классические патогены, новые патогены и симбионты эукариотических клеток, преимущественно насекомых. К классическим патогенам относятся представители группы СТ (R. prowazekii, R. typhi), а также три наиболее значимых представителя группы КПЛ с широким географическим распространением: R. rickettsii - возбудитель пятнистой лихорадки Скалистых гор, R. conorii - возбудитель марсельской или средиземноморской лихорадки, R. sibirica - возбудитель клещевого сыпного тифа (клещевого риккетсиоза Северной Азии). Кроме того, некоторые патогены группы КПЛ имеют локальные ареалы (R. australis, R. japonica) или их распространение слабо изучено (R. akari). Вторая группа (новые патогены) включает R. slovaca, R. helvetica, R. honei, R. africa, R. mongolotimonae, R. felis, R. aeschlimannii, R. canadensis, R. hulinii, R. heilongjiangensis; заболеваемость инфекциями, вызванными ими, связана с увеличением контактов населения с природными очагами, часто на фоне снижения иммунной резистентности. Хламидии - мелкие, чувствительные к антибиотикам бактерии диаметром около 0,2-1,5 мкм, которые развиваются только внутри живых клеток («облигатные внутриклеточные паразиты») н вызывают широкий спектр патологических процессов у человека н животных. Естественный цикл развития хламидий проходит в цитоплазматических включениях живых клеток (элементарное тельце - ретикулярное тельце — ретикулярные тельца - промежуточные тельца -элементарные тельца) и продолжается от двух до трех суток. Завершив цикл размножения, хламидии разрушают цитоплазматические включения, выходят из клетки-хозяина во внешнюю среду и заражают новые клетки. По современной классификации хламидии относят к роду Chlamidia семейства Chlamidiaceae порядка Chlamidiales. Вид С. trachomatis - возбудитель антропонозных хламидийных инфекций, первично поражающих слизистые оболочки (трахома, урогенитальный хламидиоз, венерическая лимфогранулема); это - один из самых распространенных и наиболее актуальных возбудителей заболеваний, передаваемых половым путем (). В 9-м издании «Определителя бактерий Берджи» (1989), у С. trachomatis выделены 3 биовара: 1) трахомы, 2) венерической лимфогранулемы, 3) мышиной пневмонии. А. А Шаткий (1982) в составе С. trachomatis предложил выделить 3 группы возбудителей с разделением их на иммунотипы: 1) эндемической трахомы (иммунотипы А, В, Ва, С); 2) урогенитального хламидиоза (D, E, F, О, Н, I, К); 3) венерической лимфогранулемы (L2, L2, L3). На поверхности хламидий имеется несколько антигенов, определяющих специфическую активность возбудителей в различных серологических реакциях: 1) группоспецифический антиген - термостабильный полисахарид, общий для хламидий всех типов; этот антиген выявляется на всех стадиях жизненного цикла микроорганизмов, 2) видоспецифические антигены - термолабильные белки, также присутствующие на всех этапах развития хламидий; по этим антигенам можно дифференцировать С. trachomatis от С. psittaci; 3) типоспецифические антигены -термолабильные протеины, позволяющие идентифицировать различные серовары возбудителей трахомы от венерической лимфогранулемы. Возбудитель венерической лимфогранулемы имеет биологическое отличие от возбудителей других урогенитальных хламидиозов. Он имеет выраженный тропизм к лимфоидной ткани и встречается в Юго-Восточной Азия. C. trachomatisиC. pneumoniaeотнесены к безусловно патогенным для человека микроорганизмам и являются возбудителями антропогенных хламидиозов. В зависимости от вида возбудителя и входных ворот (дыхательные пути, мочеполовая система) выделяют респираторные и урогенитальные хламидиозы 10.Морфология, ультраструктура микоплазм. Патогенные виды для человека. Методы выявления. Антропонозные бактериальные инфекции человека, поражающие органы дыхания или мочеполовой тракт. Микоплазмы относятся к классу Mollicutes, который включает 3 порядка: Acholeplasmatales, Mycoplasmatales, Anaeroplasmatales. Морфология: Отсутствие ригидной клеточной стенки, полиморфизм клеток, пластичность, осмотическую чувствительность, резистентность к различным агентам, подавляющим синтез клеточной стенки, в том числе к пенициллину и его производным. Грам «-», лучше окрашиваются по Романовскому—Гимзе; различают подвижные и неподвижные виды. Клеточная мембрана находится в жидкокристаллическом состоянии; включает белки, погруженные в два липидных слоя, основной компонент которых — холестерин. Микробиологическая диагностика: мазки из носоглотки, мокрота, бронхиальные смывы. При урогенитальных инфекциях исследуют мочу, соскобы с уретры, влагалища. Для лабораторной диагностики микоплазменных инфекций используют культуральный, серологический и молекулярно-генетический методы. При серодиагностике материалом для исследования служат мазки-отпечатки тканей, соскобы из уретры, влагалиша, в которых можно обнаружить АГ микоплазм в прямой и непрямой РИФ. Микоплазмы и уреаплазмы выявляются в виде зеленых гранул. АГ микоплазм могут быть обнаружены также в сыворотке крови больных. Для этого используют ИФА. Для серодиагностики респираторного микоплазмоза определяют специфические AT в парных сыворотках больного. При урогенитальных микоплазмозах в ряде случаев проводят серодиагностику, AT определяют чаше всего в РПГА и ИФА. 11.Морфология и структура вирусов. Классификация вирусов. Типы взаимодействия вирусов с клеткой. Особенности репродукции РНК- и ДНК-содержащих вирусов. Вирусы – микроорганизмы, составляющие царство Vira. Отличительные признаки: 1) содержат лишь один тип нуклеиновой кислоты (РНК или ДНК); 2) не имеют собственных белоксинтезирующих и энергетических систем; 3) не имеют клеточной организации; 4) обладают дизъюнктивным (разобщенным) способом репродукции (синтез белков и нуклеиновых кислот происходит в разных местах и в разное время); 5) облигатный паразитизм вирусов реализуется на генетическом уровне; 6) вирусы проходят через бактериальные фильтры. Вирусы могут существовать в двух формах: внеклеточной (вириона) и внутриклеточной (вируса). По форме вирионы могут быть: 1) округлыми; 2) палочковидными; 3) в виде правильных многоугольников; 4) нитевидными и др. Размеры их колеблются от 15–18 до 300–400 нм. В центре вириона – вирусная нуклеиновая кислота, покрытая белковой оболочкой – капсидом, который имеет строго упорядоченную структуру. Капсидная оболочка построена из капсомеров. Нуклеиновая кислота и капсидная оболочка составляют нуклеокапсид. Нуклеокапсид сложноорганизованных вирионов покрыт внешней оболочкой – суперкапсидом, которая может включать в себя множество функционально различных липидных, белковых, углеводных структур. Строение ДНК– и РНК-вирусов принципиально не отличается от НК других микроорганизмов. У некоторых вирусов в ДНК встречается урацил. ДНК может быть: 1) двухцепочечной; 2) одноцепочечной; 3) кольцевой; 4) двухцепочечной, но с одной более короткой цепью; 5) двухцепочечной, но с одной непрерывной, а с другой фрагментированной цепями. РНК может быть: 1) однонитевой; 2) линейной двухнитевой; 3) линейной фрагментированной; 4) кольцевой; 5) содержащей две одинаковые однонитевые РНК. Вирусные белки подразделяют на: 1) геномные – нуклеопротеиды. Обеспечивают репликацию вирусных нуклеиновых кислот и процессы репродукции вируса. Это ферменты, за счет которых происходит увеличение количества копий материнской молекулы, или белки, с помощью которых на матрице нуклеиновой кислоты синтезируются молекулы, обеспечивающие реализацию генетической информации; 2) белки капсидной оболочки – простые белки, обладающие способностью к самосборке. Они складываются в геометрически правильные структуры, в которых различают несколько типов симметрии: спиральный, кубический (образуют правильные многоугольники, число граней строго постоянно) или смешанный; 3) белки суперкапсидной оболочки – это сложные белки, разнообразные по функции. За счет них происходит взаимодействие вирусов с чувствительной клеткой. Выполняют защитную и рецепторную функции. Среди белков суперкапсидной оболочки выделяют: а) якорные белки (одним концом они располагаются на поверхности, а другим уходят в глубину; обеспечивают контакт вириона с клеткой); б) ферменты (могут разрушать мембраны); в) гемагглютинины (вызывают гемагглютинацию); г) элементы клетки хозяина. Различают три типа взаимодействия вируса с клеткой: продуктивный, абортивный и интегративный. Продуктивный тип— завершается образованием нового поколения вирионов и гибелью (лизисом) зараженных клеток (цитолитическая форма). Некоторые вирусы выходят из клеток, не разрушая их (нецитолитическая форма). Абортивный тип— не завершается образованием новых вирионов, поскольку инфекционный процесс в клетке прерывается на одном из этапов. Интегративный тип, или вирогения— характеризуется встраиванием (интеграцией) вирусной ДНК в виде провируса в хромосому клетки и их совместным сосуществованием (совместная репликация). Репродукция вирусов осуществляется в несколько стадий, последовательно сменяющих друг друга: адсорбция вируса на клетке; проникновение вируса в клетку; «раздевание» вируса; биосинтез вирусных компонентов в клетке; формирование вирусов; выход вирусов из клетки. Адсорбция.Взаимодействие вируса с клеткой начинается с процесса адсорбции, т. е. прикрепления вирусов к поверхности клетки. Это высокоспецифический процесс. Вирус адсорбируется на определенных участках клеточной мембраны — так называемых рецепторах. Клеточные рецепторы могут иметь разную химическую природу, представляя собой белки, углеводные компоненты белков и липидов, липиды. Число специфических рецепторов на поверхности одной клетки колеблется от 104 до 105. Следовательно, на клетке могут адсорбироваться десятки и даже сотни вирусных частиц. Вирусы не способны к самостоятельному размножению. Необходимы условия для появления дочерних клеток- их обеспечивают биосинтетические процессы клетки- хозяина. Дизъюнктивный (разобщенный) тип репродукции. Виды взаимодействия: 1)продуктивное- заканчивается гибелью клетки, после полной сборки дочерней популяций. 2)интегративное- нуклеиновая кислота вируса встраивается в клетку и функционирует как его составная часть. 3)абортивное- дочерни популяции не появляются, вирус взаимодействует с покоящейся клеткой. 4)интерференция вирусов- клетку инфицируют 2 вируса. Стадии: 1)адсорбция на клетке 2)проникновение 3)раздевание- модификация нуклеопротеида.4)теневая фаза- синтез компонентов дочерних клеток.5)сборка дочерних популяций. 6) высвобождение дочерних вирионов (первый тип — взрывной или цитолиз— характеризуется выходом большого количества вирусов.. При этом клетка быстро погибает. Второй тип — почкование. Клетка остаётся не нарушенной идёт отпочкование от мембраны не нарушая мембрану клетки). Репродукция -РНК-вирусов- У него РНК фрагментарная. Поступает в кл. слиянием мембран. Выход РНК- , кот. ничего не умеет делать. Образуется РНК+ , кот. идет в рибосомы, образуются структурные и не структурные белки это 1-е направление. 2-е направление: с помощью клеточной полимеразы где учавствует клеточная РНК-полимераза из + будут строится “-“ нити. Сборка. Отпочкование. Возможны мутации: где образуются с “-“ на + и идет из хромосом образуются ДНК полимеразы. Репродукция +РНК-вирусов- выполняет функцию информационной, матричной, транспортной. Сначало адсорбция, виролексис (то же самое что ДНК), депротонизация высвобождается РНК+ , которые идут к рибосомам и образуется длинные полипептидные нити. Протеазы делают их короткими. А другое направление: на матрице + образуются “ – “ (минус) это репликативная форма становится двунитчатой + и “– “ и с “ –“ идет репликация на + ниточек. Короткие нити идут в рибосомы образуется РНК-полимераза идет синтез белковых структур. Идет сборка. Уходят через мембрану, испорченную М-белками.Ретровирусы (ВИЧ, онкогенные вир.) имеют фермент обратную транскриптазу. Она + . Обладают способностью встраиватся в хромосому клетки хозяина. РНК превращается в ДНК. Вирус попал в клетку путем слияния мембран, освобождается РНК+ (обратная транскриптаза), каторая на матрице РНК строит ДНК (минусовую). Клетка достраивает ДНК нормальную, которая направляется в ядро и клеточные ферменты разрезают и встраивают вирусную ДНК в хромосом клетки. Клеточные ферменты образуют РНК+ , матричную вир. РНК и в рибосомах идёт синтез белковых структур (М, структурные и не структурные белков, шипы). Выход почкованием и захват кл. мембраны (фрагменты). Репродукция ДНК-вирусов. Проникает путем виропексиса. Ранняя стадия- вирусная ДНК проникает в кл , тренскрибируерся РНК-полимеразой. Считывается => транслируется часть вирусного генома => синтезируется «ранние белки». Поздняя стадия- синтез нуклеиновых кислот вируса. Вирусная ДНК упаковывается в вирионы дочерней популяции. Часть ДНК на синтез «поздних белков». 12.Бактериофаги. Фазы взаимодействия фага с бактериальной клеткой. Умеренные и вирулентные фаги. Культивирование, индикация и титрование фага . Лизогения. Фаговая конверсия. Применение фагов в медицине и микробиологии. Бактериофаг (бактери[и] + греческий phagos пожирающий; синоним: фаг, бактериальный вирус) — вирус, способный инфицировать бактериальную клетку, репродуцироваться в ней, образуя многочисленное потомство, и вызывать ее лизис, сопровождающийся выходом фаговых частиц в среду обитания бактерии. Наиболее часто процесс взаимодействия фага с клеткой протекает по типу продуктивной инфекции и обычно заканчивается лизисом клеток бактериальной культуры. Но возможна и абортивная инфекция, при которой фаговое потомство не образуется, а бактериальные клетки сохраняют свою жизнедеятельность. Наконец, нередко наблюдается лизогенизация бактериальных клеток инфицирующим фагом, в результате чего возникает состояние лизогении (вирогении), характеризующееся интеграцией генома фага в геном бактериальной клетки. В зависимости от типа взаимодействия различают вирулентные и умеренные бактериофаги. Вирулентные бактериофаги взаимодействуют с бактерией по продуктивному типу. Умеренные бактериофаги заражают бактерий-хозяев, но не размножаются в них автономно и не вызывают лизиса - интегративный тип взаимодействия. При интегративном типе – геном фага встраивается в хромосому бактерии и сосуществует с ней. Процесс взаимодействия вирулентного фага с бактериальной клеткой состоит из последовательной смены отдельных стадий.Стадиипродуктивной инфекции: I стадия – адсорбция. На клеточной стенке бактерий имеются рецепторы, на которых адсорбируются соответствующие фаги. Рецепторы различаются по химическому составу. Рецепторы для одних фагов находятся в липопротеиновом слое, для других – в липополисахаридном. Для ряда фагов рецепторы находятся на отростках клеток – жгутиках или пилях. Фагорезистентность некоторых бактерий определяется, вероятно, отсутствием у них соответствующих рецепторов в результате мутаций. При избытке бактериофага на одной клетке может адсорбироваться 200-300 фаговых частиц, хотя для заражения достаточно и одной. Фаг может адсорбироваться и на изолированных клеточных стенках, в то время как на протопластах, полностью лишенных клеточной стенки, адсорбции не происходит. Литический цикл инфекции начинается с того, что частица бактериофага случайно сталкивается с клеткой-хозяином. Если у вириона имеется участок адсорбции, химически комплементарный специфическому рецепторному участку на поверхности бактериальной клетки, то происходит необратимая адсорбция. На процесс адсорбции фага большое влияние оказывают условия среды: солевой состав, рН, температура, а также наличие в среде строго определенных веществ – кофакторов адсорбции, например, триптофана для адсорбции фагов Т4, Т6. Некоторые фаги в качестве рецепторов используют половые пилибактерий. II стадия – пенетрация (проникновение). Фаги, имеющие сократительный механизм в хвостовой части, такие, как Т3, подобно шприцу инъецируют свою ДНК в периплазматическое пространство между клеточной стенкой и клеточной мембраной. Затем ДНК проникает в клетку через мембрану с затратой энергии хозяина. Некоторые мелкие кубические фаги, способные адсорбироваться на половых пилях, вводят свою нуклеиновую кислоту через канал этих пилей. Известен механизм пенетрации и других фагов.Нитевидные ДНК-содержащие фаги проникают в клетку по другому механизму. В этом случае через клеточную стенку проникает весь вирион. Белок, преобладающий в оболочке фаговой частицы, остается на клеточной мембране (ЦПМ), а фаговая ДНК, вместе с минорным оболочечным белком (А-белком) проникает в цитоплазму. Установление фагового генома: - Однонитевая ДНК – к репликативному аппарату для синтеза комплементарной ей нити и образования репликативной формы; далее – аналогично двунитевой - Двунитевая ДНК – к транскрипционному аппарату для синтеза мРНК и последующей трансляции вирусспецифических белков (ферментов и структурных) - РНК-геном – к трансляционному аппарату для синтеза вирусспецифических белков (ферментов репликации и структурных). III стадия – биосинтез фаговой НК и белков капсида. В первые минуты после проникновения НК внутрь бактериальной клетки в течение латентного периода фаговые частицы обнаружить не удается. У E. coli этот период продолжается в среднем 25 мин, в искусственно разрушенных бактериальных клетках также не удается обнаружить фага. Инъецированная ДНК фага, прежде всего, вызывает полную перестройку метаболизма зараженной клетки. Сразу же прекращается синтез бактериальной ДНК, через несколько минут прекращается также синтез бактериальной РНК и бактериальных белков, хотя общее количество белка продолжает непрерывно возрастать. Синтез ДНК возобновляется, даже с повышенной скоростью. Сначала фаговая ДНК образуется за счет распавшейся бактериальной. Эту перестройку и последующее новообразование фаговой ДНК можно проследить по увеличению количества5-гидроксиметилцитозина– основания, специфичного для ДНК Т-четных фагов. Необходимые для синтеза фаговой ДНК ферменты образуются в клетке уже вскоре после заражения; это так называемые «ранние» белки. К «поздним» белкам относятся белки оболочки и фаговые лизоцимы, или эндолизины; они образуются лишь во второй половине латентного периода. Репликация фаговой ДНК протекает в соответствии с общим механизмом репликации, однако детали этого механизма варьируют в зависимости от того, реплицируется ли фаговая ДНК в виде кольцевой (симметричный и асимметричный способы) или в виде линейной молекулы. В течение очень короткого периода (минуты) в клетке синтезируется несколько сотен новых фаговых хромосом, которые по мере образования беспорядочно обмениваются генетическим материалом. Культивируют бактериофаги в жидких и плотных питательных средах, в которые засеяны соответствующие культуры бактерий. Существуют 2 метода титрования бактериофагов: метод по Аппельману (в жидкой питательной среде) и по Грациа (на плотной среде). По Аппельману, титром в жидкой питательной среде называется то максимальное разведение, которое даёт полный лизис бактерий. По Грациа, титр – количество активных фаговых частиц в пересчёте на 1 мл неразведённого фага. Количество активных фаговых частиц в 1 мл = количество зон лизиса * величина обратного разведения. Метод по Грациа более точный. Для приготовления биопрепаратов из бактериофагов используют в основном три источника: лизогенные культуры бактерий, фекалии выздоравливающих больных, сточные воды. Для выделения дизентерийного бактериофага в сочных водах сначала проводят его индикацию методом фаговой дорожки. На чашку Петри с МПА засевают газоном культуру дизентерийных бактерий, затем на поверхность посева закапывают фильтрат сточной воды стекающей каплей. Посевы инкубируют в термостате в течение 18 часов. При положительном ответе проводят определение исходного титра бактериофага по Аппельману. Для титрования фага готовят его десятикратные разведения, в которые добавляют эталонную культуру дизентерийных бактерий (2 млрд. м. т. в 1 мл). Пробирки помещают в термостат на сутки. Учитывают исходный титр бактериофага. По Грациа, готовят десятикратные разведения фага, которые смешивают со стандартной культурой дизентерийных бактерий в объёме 0,1 мл каждое разведение бактериофага и расплавленным и слегка остуженным агаром. Полученную смесь выливают на чашку Петри с МПА вторым агаровым слоем и после застывания смеси инкубируют в термостате 24 часа. Подсчитывают количество «негативных колоний» бактериофага, умножают на степень разведения фага и объём из расчёта на 1 мл. Это и будет титр бактериофага по Грациа. ЛИЗОГЕНИЯ — (от греч. lysis разложение, распад, растворение и geneia происхождение, создание), процесс встраивания вирусной ДНК в геном бактерии без размножения и разрушения ее клетки. Фаговая конверсия (лат. conversio изменение, превращение; син. лизогенная конверсия) — изменение фенотипа бактериальной клетки (антигенной характеристики, токсинообразования, чувствительности к другим фагам и т.п.), обусловленное включением в ее хромосому генома умеренного фага. Цели: лечебно-профилактическая или диагностическая. С лечебно-профилактической целью применяют только вирулентные фаги. Это могут быть стафилококковый, брюшнотифозный, дизентерийный, синегнойный, стрептококковый, эшерихиозный бактериофаг или комбинированные фаги. Обязательна проверка чувствительности. «+» применения: можно назначать на фоне лечения антибиотиками (5 – 7 дней энтерально; орошение на раневую поверхность). Диагностические препараты бактериофагов применяются с целью (3 «И»): индикация идентификация источник инфекции Индикация – точная диагностика. Быстро, недорого по сравнению с другими методами. Пример: холерный вибрион имеет 2 биовара – для их индикации используют классический и эльторовский бактериофаги. Идентификация. Пример: исследование сточных вод при подозрении на наличие дизентерийной палочки с помощью дизентерийного фага. Определение источника инфекции – фаготипирование. Пример: вспышка стафилококковой инфекции в больнице. Нужно определить источник инфекции (медперсонал, больные). Можно использовать генетические маркёры и типовые бактериофаги, которые взаимодействуют с определёнными сероварами у бактерий внутри вида. 13.Типы питания бактерий. Понятие об аутотрофах, гетеротрофах, сапрофитах, прототрофах, ауксотрофах, абсолютных и факультативных паразитах. Бактерии нуждаются в таких элементах, как кислород, водород, углерод, азот, сера, фосфор, калий и др. Источниками водорода и кислорода являются вода и кислород воздуха у аэробных микробов. По источнику углерода бактерии делят на: - автотрофы – источником является СО2; - гетеротрофы – источниками являются различные органические соединения (глюкоза, спирты, аминокислоты, органические кислоты); По источнику энергии: - фототрофы – используют энергию солнечного света; - хемотрофы – используют энергию химических реакций окисления неорганических и органических соединений. По донору Н2 (е): - литотрофы – донором являются неорганические соединения (Н2О, H2S); - органотрофы – донором являются органические соединения (карбоновые кислоты, аминокислоты, глюкоза и т.д.). По источнику азота: - аминоавтотрофы – источником является атмосферный азот, аммонийные соли, нитраты, нитриты; - аминогетеротрофы – источником являются белки (органические вещества). Фотоавтотрофы– это фотосинтезирующие бактерии, использующие энергию солнечного света для синтеза органических соединений из неорганических соединений. Хемоавтоторофысинтезируют органические вещества из СО2 за счет энергии реакций окисления неорганических соединений. К ним относятся нитрифицирующие бактерии (NH3 ® HNO3), серобактерии (H2S ® S; H2SO4), железобактерии (Fe2+ ® Fe3+). Хемо(органо)гетеротрофы для синтеза собственных органических соединений используют энергию окисления других органических веществ, которые являются одновременно и источниками углерода. К ним относится большинство бактерий: Автотрофные бактерии — это бактерии, которые могут синтезировать органические вещества из неорганических в результате фотосинтеза (фототрофные) и хемосинтеза (хемотрофные). К фототрофным относятся пурпурные и зеленые серобактерии, которые синтезируют составные части своего тела из минеральных веществ и углекислого газа, а энергию используют за счет света. Бактерии, которые еще называются гетеротрофы, – это микроорганизмы, использующие в качестве источника энергии химические соединения, содержащие углерод. бактериисапротрофные — (уст. сапрофитные) – бактерии, превращающие органические вещества отмерших организмов в неорганические, обеспечивая круговорот веществ в природе. прототрофы — микроорганизмы дикого типа, способные развиваться на простых средах без добавления сложных органических соединений. Прототрофы — (прото + троф) микроорганизмы, не требующие для своего развития готовых витаминов, аминокислот и др. факторов роста, а синтезирующие их из минерального и органического сырья 14.Основные принципы культивирования бактерий. Факторы, влияющие на их рост и размножение. Питательные среды и их классификация. Под культивированием бактерий в микробиологии понимают выращивание микроорганизмов, осуществляемое в лабораторных условиях. В свою очередь микробы, которые выросли на подобранной питательной среде, называют культурой. Культуры могут быть смешанными, если они образованы разными видами микроорганизмов, и чистыми, если представлены только одним видом бактерий. Если в питательную среду помещают только одну клетку, а получают в результате ее размножения группу особей, то эту совокупность микроорганизмов называют клоном. Когда клон развивается до такого уровня, что становится виден невооруженным глазом, такое скопление бактерий называют колонией. Обычно культивирование бактерий, выделенных из различных источников, производят отдельно друг от друга. Каждую такую отдельно выращенную группу микробов называют штаммом. Так, если один вид стафиллококка выделен из трех источников (или разных порций одного и того же продукта, разных человек), говорят о трех штаммах этого вида стафилококка. Факторы роста бактерий К ним относят различные аминокислоты, липиды, пуриновые основания и другие соединения, необходимые для развития микроорганизмов. Некоторые микробы могут самостоятельно вырабатывать необходимые им вещества, а другим необходимо получать их в готовом виде. По потребности микроорганизмов в тех или иных ростовых факторах проводят идентификацию и дифференциацию бактерий. Также этот параметр важен для правильного изготовления питательной среды в целях проведения лабораторных и биотехнологических работ: Аминокислоты. Бактерии могут нуждаться в одной конкретной аминокислоте или какой-либо группе кислот. Так, клостридиям необходим лейцин и тирозин, стрептококкам - лейцин и аргинин. Микроорганизмы, которым для роста необходимо получение аминокислот извне, называют ауксотрофными. Пуриновые и пиримидиновые основания, а также их производные (аденин, гуанин и другие). Они являются важным фактором роста многих видов стрептококков. Витамины. Они входят в состав коферментов, требуемых бактериям. Так, никотиновая кислота, а также ее амид, входящие в состав НАД и НАДФ, нужна коринебактериям дифтерии, шигеллы. Тиамин, как составная часть пирофосфата, требуется золотистому стафилококку, пневмококку, бруцеллам. Пантотеновая кислота, входящая в кофермент КоА, требуется бациллам столбняка и отдельным видам стрептококка. Цитохромы, а значит, образующие их фолиевая кислота, гемы и биотин, необходимы микобактериям туберкулеза и гемофильным бактериям. | ||||||||||||||||||||