Общая микробиология
 Скачать 0.8 Mb.
|
Требования к средамУсловия, предъявляемые к питательным средам для культивирования бактерий: Питательность. Они должны содержать вещества, причем находящиеся в легко усвояемом виде, необходимые микроорганизмам для питания и пополнения энергии. К ним относят органогены и минеральные вещества. Для некоторых микроорганизмов дополнительно необходимы витамины и аминокислоты, которые они не могут синтезировать. Оптимальный уровень рН. Он влияет на проницаемость клеточной оболочки и, соответственно, на возможность усвоения питательных веществ бактерией. Чаще всего значение водородного показателя должно быть на уровне 7,2–7,4. Многие микроорганизмы в ходе своей жизнедеятельности вырабатывают продукты с кислой или щелочной реакций, и для того, чтобы рН питательной среды не изменялся, она должна обладать буферностью. Изотоничность. Осмотическое давление в питательной среде для культивирования бактерий должно иметь те же значения, что и внутри микробных клеток. Обычно оно соответствует 0,5 % раствору NaCl. Стерильность. Связано это с тем, что появление посторонних бактерий исказит результаты изучения анализируемого штамма. Уровень влажности. Этот показатель наряду с консистенцией среды должен иметь оптимальные характеристики для конкретного вида бактерий. Окислительно-восстановительный потенциал (RH2). Он показывает соотношение веществ, которые отдают и которые принимают электроны, а также уровень насыщения кислородом питательной среды. Для аэробов и анаэробов условия культивирования бактерий несколько разнятся по данному показателю. Анаэробные микроорганизмы лучше всего размножаются при значениях RH2, не превышающих 5, а аэробные – не менее 10. Унифицированность. Важно, чтобы питательная среда содержала неизменные количества отдельных ее ингредиентов. Кроме того, предпочтительны прозрачные растворы, на которых легче отслеживать рост культуры или заметить ее загрязнение. Виды питательных средНа выбор той или иной среды для выращивания микроорганизмов влияет множество факторов, среди которых - особенности их питания и цели исследования. Основными признаками, положенными в основу классификации питательных сред, являются: 1. Компоненты. По исходным веществам, используемым для создания субстрата, различают: натуральные, которые готовятся из продуктов животного или растительного происхождения (например, мяса, молока, фруктов) и удобны для выращивания смешанных культур; полусинтетические, в которых дорогостоящие натуральные пищевые продукты заменены на непищевые (например, костную муку, сгустки крови), и которые оптимальны для культивирования бактерий отдельных видов или выделения из среды продуктов их жизнедеятельности; синтетические, которые готовятся из точных количеств химических соединений, имеют известный постоянный состав и легко воспроизводятся. 2. Консистенция (плотность). Различают среды: жидкие; плотные; полужидкие. Последние две готовят из специальных растворов или жидких веществ с добавлением агар-агара или желатина для создания необходимой плотности. Кроме того, плотной средой для роста бактерий является свернутая сыворотка крови, картофель, среды с силикагелем, каррагинан. 3. Состав. По данному признаку среды бывают: простые, список которых короток - это мясопептонный бульон (МПБ), бульон и агар Хоттин-гера, мясопептонный агар (МПА), питательный желатин и пептонная вода. сложные, приготовляемые из простых с добавлением крови, сыворотки, углеводов и другие веществ. 4. Назначение. Выделяют следующие питательные среды: основные служат для выращивания многих патогенных микробов (обычно простого состава); специальные применяют для выделения и культивирования бактерий, которые не растут на простых субстратах; элективные (они же избирательные) подходят для выделения конкретного вида бактерий и подавляют рост сопутствующих микробов (селективность создается путем прибавки к средам некоторых веществ, например антибиотиков или солей, или коррекцией рН); дифференциально-диагностические дают возможность отличить один вид бактерий от другого путем оценки ферментативной активности, например, среды; консервирующие нужны для первичного посева с последующей транспортировкой образцов, поскольку предотвращают отмирание микроорганизмов, а также подавляют рост других бактерий. 15.Принципы и методы выделения чистой культуры аэробных и анаэробных бактерий. Чистой культурой называется популяция бактерий одного вида или одной разновидности, выращенная на питательной среде. Многие виды бактерий подразделяют по одному признаку на биологические варианты —биовары (син: биотипы). Биовары, различающиеся по биохимическим свойствам, называют хемоварами, по антигенным свойствам — сероварами, по чувствительности к фагу—фаговарами. Культуры микробов одного и того же вида, или биовара, выделенные из различных источников или в разное время из одного и того же источника, называют штаммами, которые обычно обозначаются номерами или какими-либо символами. Чистые культуры бактерий в диагностических бактериологических лабораториях получают из изолированных колоний, пересевая их петлей в пробирку с твердой или, реже, жидкой питательной средой. Колония представляет собой изолированное скопление бактерий одного вида, или биовара, выросших на плотной питательной среде в результате размножения одной или нескольких бактериальных клеток. Колонии бактерий разных видов отличаются друг от друга по своей морфологии, цвету и другим признакам. Чистую культуру -бактерий получают для проведения диагностических исследований, которые заключаются в идентификации, т. е. определении родовой и видовой принадлежности выделенных бактерий. Это достигается путем изучения их морфологических, культуральных, биохимических и других признаков (см. схему 1). Морфологические и тинкториальные признаки бактерий изучают при микроскопическом исследовании мазков, окрашенных разными методами, и нативных препаратов. Культуральные свойства характеризуют питательные потребности, условия и тип роста бактерий на плотных и жидких питательных средах. Эти свойства устанавливаются по морфологии колоний и особенностям роста культуры. Биохимические признаки бактерий определяются набором конститутивных и индуцибельных ферментов, присущих определенному роду, виду, варианту. В бактериологической практике таксономическое значение имеют чаще всего сахаролитические и протеолитические признаки бактерий, которые определяют на дифференциально-диагностических средах. Для идентификации бактерий до рода и вида имеют значение пигменты, окрашивающие колонии и культуры в разнообразные цвета. Например, красный пигмент образуют Serratia marcescens (палочка чудесной крови), золотистый пигмент—Staphylococcus aureus (золотистый стафилококк), сине-зеленый пигмент—Pseudomonas aeruginosa (палочка синезе-леного гноя). Для установления биовара (хемовара, серовара, фаготипа) проводят дополнительные исследования по выполнению соответствующего маркера — определению фермента, антигена, чувствительности к фагам. Основные типы и сущность процессов дыхания бактерий. Облигатные и факультативные анаэробы, микроаэрофилы. Особенности культивирования. По типу дыхания бактерии делятся на 4 группы: -Облигатные аэробы- бактерии, которые могут расти и размножаться только при наличии кислорода. К ним относятся бруцеллы, микрококки, микобактерии туберкулеза (необходимо для роста около 20% кислорода) -Облигатные анаэробы-бактерии, которые растут при отсутствии кислорода ( в анаэробных условиях). Для них кислород токсичен, так как у них отсутствуют ферменты (каталаза, супероксиддисмутаза), нейтрализующие перекисные радикалы кислорода. К ним относятся возбудители ботулизма, газовой гангрены, столбняка и др. Для них характерно сульфатное дыхание, при котором акцепторами водорода являются сульфаты, восстанавливающиеся до H2S. При культивировании этих бактерий требуются анаэробные условия. -Факультативные анаэробы- бактерии, которые растут как при наличии кислорода, так и при отсутствии. К ним относятся большинство патогенных и сапрофитных бактерий ( E.coli и др). Для них характерно нитратное дыхание, при котором акцептором водорода являются нитраты, восстанавливающиеся до N2 и NH3. -Микроаэрофилы- необходимым условием для роста и размножения этих бактерий является пониженное содержание кислорода, пример: менингокки, гонококки Дыхание бактерий- это окислительно-восстановительные процессы, идущие с выделением энергии и образованием АТФ. Субстраты дыхания- глюкоза, аминокислоты, спирты и др. Особенности культивирования: Культивирование аэробов проводят следующим образом: Культивируют на поверхности плотных сред или в тонком слое жидких сред, они получают кислород, непосредственно, из воздуха. В жидких средах ( глубинное культивирование). В данном случае микроорганизмы используют растворенный в среде кислород. В связи с низкой растворимостью кислорода, для обеспечения роста аэробных бактерий в толще среды требуется постоянное аэрирование. Культивирование анаэробных микроорганизмов более сложно, чем аэробов. Известны несколько методов культивирования этих бактерий: физические, химические и биологические, механические. К физическим методам культивирования относятся выращивание бактерий в микроанаэростате- специальный вакуумный аппарат для выращивания микроорганизмов, в котором воздух замещен газовой смесью. Наиболее часто используемая смесь следующий состав: Азот с 5% CO2 и 10% H2. Химические методы -Прибор Омельянского- для поглощения кислорода используют пирогаллол -Среда Вильсон-Блера. Среда содержит глюкозу, сернисто-кислый натрий, хлорид железа. Анаэробы образуют черные колонии за счет восстановления сернисто-кислого натрия в сернистый натрий, который, соединяясь с хлоридом железа, образует осадок черного цвета- сернистое железо 3. Биологический метод Фортнера Чашку Петри с толстым слоем агара делят на 2 половины на одну половину засевают облигатный аэроб — «чудесную» палочку, на другую половину чашки засевают исследуемую анаэробную культуру. Чашку заливают растопленным парафином. Через 24 — 48 часов в чашке вырастают аэробы, затем, когда запас кислорода исчерпывается, начинают размножаться анаэробы. Аппаратура: микроанаэростаты - толстостенные металлические или пластиковые цилиндры с герметичечки закрывающимися крышками, на которых имеются вакуометр и краны для присоединения к вакуум насосу или баллону с газом. Засеянные анаэробами питательные среды помещают в анаэростат,откачивают воздух и замеряют его газовой смесью, инкубируют 2-3 суток при t =37º Вместо анаэростатов используют газонепроницаемые полиэтиленовые пакеты Анаэробный бокс - прозрачная плексиглазовая камера о шлюзом, отверстиями для рук с рукавами, заканчивающимися резиновыми перчатками. В ем создают стерильные условия, закачивают газовую смесь поддерживают температуру 37 ºС. Этапы выделения чистых культур облигатных анаэробов: 1) получение изолированных колоний (посевы на пит средах инкубируют в микроанаэростатах 48-72ч при 37º. 2) получение чистой культуры ( изучают морфологические и культуральные свойства. проводят параллельный рассев каждой отобранной колонии на 2 чашки Петри с пит средой, 1 чашку инкубируют в аэробных условиях, другую в - в анаэробных) Отбирают культуры, которые выросли в анаэробных условиях ( исключение факультативных анаэробов) 3) идентификация выделенных облигатных анаэробов (биохимическая, микротест -система) Типы и механизмы питания бактерий. Ферменты бактерий. Использование ферментативной активности бактерий для их идентификации. В настоящее время в бактерии в зависимости от способности усваивать различные формы углеродсодержащих соединений, подразделяются по типу питания на 2 группы: Авторофы ( autos- сам, trophe- питание), способны синтезировать сложные соединения углерода из CO2 и H2O. К ним относятся нитрифицирующие бактерии, железобактерии и др. Гетеротрофы ( heteros-другой)- нуждаются в готовых органических соединениях. Они подразделяются на сапрофиты ( sapros-гнилой, phyton- растение) и паразиты (parazitos-нахлебник) Сапрофиты используют готовые органические соединения, но они независимы от других организмов. К ним относятся микробы, вызывающие процессы гниения и брожения. Паразиты- это микробы, зависимые в получении питательных веществ от макроорганизмов. Различают облигатные и факультативные паразиты, первые способны размножаться только в живой клетке, они не растут на питательных средах. К ним относятся риккетсии и хламидии. Для синтеза азотсодержащи соединений ( пурины, аминокислоты, витамины, пиримидины) микробам нужен азот. Одни микробы способны усваивать молекулярный азот из воздуха или неорганический азот из солей аммония, нитратов, нитритов, другие используют органические азотсодержащие соединения. Прототрофы- синтезируют все необходимые соединения из глюкозы и солей аммония. Ауксотрофы- нуждаются в готовых факторах роста. Механизмы питания: В основе питания лежит транспорт питательных веществ. Простая диффузия (пассивный транспорт)- вещества поступают в клетку по градиенту концентрации без энергозатрат, так поступают воды и ограниченное количество веществ. Облегченная диффузия- вещества поступают так же по градиенту концентрации без энергозатрат, но при участии особых ферментоподобных белков-переносчиков- пермеаз. Активный транспорт- вещества поступают в клетку против градиента концентрации при помощи пермеаз. Данный вид транспорта требует затраты энергии, так как концентрация веществ в микробной клетке выше, чем в питательной среде. Транслокация- данный вид транспорта похож на активный транспорт, но переносимая молекула видоизменяется в процессе переноса, н-р, фосфорилируется. Ферменты состоят из белковой части ( апофермента) и простетической группы ( кофермента), который взаимодействует с субстратом. Микробы синтезируют разные ферменты. По функциям они делятся на 6 классов: оксиредуктазы, трансферазы, гидролазы, изомеразы, лиазы, лигазы. По расположения ферменты микробов: Экзоферменты-выделяются в окружающую среду и расщепляют макромолекулы до простых, способных проникнуть в клетку и эндоферменты ( ферменты дыхательной цепи)- функционируют в клетке. По постоянству действия: конституитивные ( ферменты гликолиза) и адаптационные ( ферменты транспорта лактозы B-галактозидпермеаза). Каждый микроб имеет определенный набор ферментов, который генетически запрограммирован и является достаточно постоянным признаком. Это может быть использовано при идентификации бактерий. Идентификацию бактерий по б/х активности проводят на дифференциально—иагностических средах Гисса ( пестрый ряд), а также для этого используют современные диагностические тест-системы: API, Lachema, Roshe-Tube, Vitek. Этапы выделения чистых культур бактерий, их идентификация. 1. Первый этап (день) • Посев материала на пит. среду ГРМ-агар методом механического разобщения по Дригальскому, ставим в термостат при 37* на 24ч. Цель этапа – получить изолированные колонии микроорганизмов. 2. Второй день • Изучение роста выросших бактерий на пит.средах: А) Макроскопически- культуральные свойства (питательные потребности, условия и тип роста бактерий) Б)Микроскопически – морфологические и тинкториальные (форма и отношение к красителям) • Пересев колоний на скошенный агар для накопления чистой культуры (37*,24ч) 3. Третий день • Учитываем рост колоний на скошенном агаре. • Делают мазок с целью проверки культуры на чистоту. Если под микроскопом наблюдают бактерии однотипной морфологии, размеров и тинкториальних (способность краситься) свойств,то культура чиста. Проводят индентификацию - достигается путем определения морфологических, культуральных, биохимических и других признаков микроорганизмов. 4. Четвертый день • Учитываем биохимические свойства выделенной культуры (определяются набором ферментов: сахаролитическими и протеолитическими) Методы культивирования вирусов: лабораторные животные, эмбрионы птиц, клеточные культуры. Индикация вирусов (ЦПД, вирусные включения, гемагглютинация, гемадсорбция). Существуют несколько методов культивирования вирусов: На лабораторных животных. Заражают животных ( подкожно, внутримышечно, внутрибрюшино), которые чувствительны к определенным вирусам: хорьков - вирусом гриппа, кроликов - вирусом бешенства, обезьян - вирусом полиомиелита. Индикация (обнаружение) вируса проводится по признакам заболевания. Недостаток метода - не все вирусы можно культивировать на животных, например, животные невосприимчивы к вирусам человека. В куриных эмбрионах. Заражают куриный эмбрион (аллонтоисная полость, хорион-аллонтоисная оболочка, амниотическая полость, желточный мешок, сам эмбрион). Куриный эмбрион – очень удобен. Он защищен от попадания других микробов (стерильный), техника работы с ним проста, можно накопить большое количество вирусов. Индикация: а) по специфическим поражениям на хорион-аллантоисной оболочке, по гибели эмбриона, б) по реакции склеивания эритроцитов – реакции гемагглютинации (РГА). Недостатки метода: а)не все вирусы (вирус полиомиелита, вирус ящура) можно вырастить в куриных эмбрионах; б) невозможно обнаружить вирус без вскрытия эмбриона; в) в нем много загрязняющих белков и других соединений. |