Общая микробиология
 Скачать 0.8 Mb.
|
|
В тканевых культурах. Тканевые культуры или клеточные культуры – клетки, выращенные вне организма на искусственных питательных средах. Для их приготовления используют чаще всего эмбриональные и опухолевые ткани. Метод тканевых культур разработан Дж. Эндерсом в 50-е годы. Большинство вирусов способно размножаться в культурах клеток. Для каждого вируса можно подобрать наиболее чувствительную культуру клеток. Бывают культуры растущих тканей и переживающих тканей (утративших способность к росту). Существуют три типа растущих тканевых культур: а) однослойные тканевые культуры – клетки прикрепляются и растут в виде сплошного монослоя по поверхности стекла лабораторной посуды; б) культуры суспензированных клеток – клетки растут и размножаются во взвешенном состоянии; в) органные культуры - кусочки органов животных и человека, выращиваемые вне организма. Однослойные культуры – основные культуры. Различают: а) первичные – клетки этой культуры делятся один раз, поэтому каждый раз необходимо вновь получать культуру ткани; чаще всего используют эмбриональные ткани и опухолевые ткани взрослого человека; б) полуперевиваемые – клетки делятся до 50 раз, сохраняя диплоидный набор хромосом; их можно перевивать несколько раз; используют диплоидные клетки человека (фибробласты человеческого эмбриона, диплоидные клетки легких человека); в) перевиваемые – клетки культуры постоянно делятся в условиях in vitro (вне организма), поэтому их можно перевивать непрерывно; их готовят из линий клеток, которые хорошо размножаются в течение многих лет; чаще всего эти культуры получают из опухолевых клеток. Получено около 200 штаммов таких клеток: штамм L (из культуры мышиных фибробластов), штамм HeLa (из карциномы шейки матки), штамм Hep-3 (из лимфоидной карциномы) и т.д. Методы индикации: По цитопатическому действию (ЦПД). В результате размножения вирусов в клетках происходят морфологические изменения клеток (вакуолизация цитоплазмы, деструкция митохондрий, округление клеток). Часть клеток погибает и отслаивается от стекла. Вместо сплошного монослоя остаются отдельные клеточные островки. ЦПД обнаруживают под микроскопом (8). По ЦПД можно не только обнаружить, но и идентифицировать вирусы. Например, вирус полиомиелита вызывает мелкозернистую деструкцию клеток; аденовирусы вызывают образование скоплений клеток в виде виноградных гроздьев; вирус кори вызывает образование симпластов – многоядерных клеток. По образованию включений. Включения - скопления вирусов в клетках. Они имеют различную форму и размеры. Их окрашивают по Романовскому-Гимзе или флюорохромами и наблюдают под микроскопом. По гемадсорбции. Клетки, зараженные вирусами, могут адсорбировать эритроциты. Вирусы выходят на поверхность клеток и связывают эритроциты. Эритроциты добавляют к культуре и через некоторое время промывают физиологическим раствором. На поверхности клеток под микроскопом видны прилипшие эритроциты в виде разнообразных фигур;. По реакция гемагглютинации. Гемагглютинация - склеивание эритроцитов под влиянием вирусов. Эритроциты добавляют к культуральной жидкости. Если в ней есть вирусы, то эритроциты склеиваются. По "цветной" реакции. Клетки культуры выращиваются на жидкой среде с индикатором (метиленовым красным). Индикатор изменяет цвет (с красного на желтый) под действием кислых продуктов метаболизма при росте нормальных клеток. Если клетки заражены вирусом, то нормальный метаболизм нарушается, кислые продукты не образуются и индикатор не изменяет цвет. Таким образом, признаком размножения вирусов в клетках культуры является сохранение красного цвета среды. Микрофлора почвы, воды и воздуха. Принципы санитарно-микробиологических методов исследований. Индикация патогенных микробов в объектах окружающей среды. Косвенные методы –определение общей обсемененности и санитарно-показательных микробов. Микроорганизмы распространены повсюду. Большинство их в естественных условиях находятся в определенных взаимоотношениях друг с другом. В окружающую среду патогенные бактерии попадают от больных, бактерионосителей и находятся здесь в течение определенного времени. Санитарно-микробиологическое состояние почвы оценивается на основании сопоставления количества термофильных бактерий и бактерий - показателей фекального загрязнения. Почвы, с преобладанием санитарнопоказательных бактерий расцениваются как санитарно-неблагополучные, загрязненными фекалиями человека или животных. Присутствие в почве E. coli и Streptococcus faecalis указывает на свежее, бактерий родов Citrobacter и Enterobacter - на несвежее, а Clostridium perfringens - на давнее фекальное загрязнение. Более точная оценка проводится с помощью определения коли-индекса - количество бактерий группы кишечной палочки (БГКП или, так называемые, колиформные бактерии), обнаруженных в 1 г почвы, перфрингенс-титра - масса почвы (в граммах), в которой обнаружена 1 особь Clostridium perfringens, общей численности сапрофитных, термофильных и нитрифицирующих бактерий в 1 г почвы. Санитарно-микробиологическое состояние воды оценивается по: 1) микробному числу - количеству мезофильных хемоорганотрофных бактерий в 1 мл воды; 2) коли-титру -наименьшему объему воды (мл), в котором обнаруживается БГКП 3) коли-индексу - количеству БГКП в 1 л воды. 4) Кроме того, в воде определяют наличие спор сульфитредуцирующих бактерий и цист лямблий. Санитарно-микробиологическое состояние воздуха закрытых помещений оценивают по микробному числу - количеству особей, обнаруживаемых в 1 м3 воздуха, наличию санитарно-показательных бактерий - представителей микрофлоры дыхательных путей - гемолитические стрептококки, золотистый стафилококк. Микрофлора воздуха. Нормативы: чистый воздух зимой: ОМЧ не более 4500, гемолитических стрептококков - до 35; грязный воздух зимой: ОМЧ более 7000, гемолитических стрептококков - более 70. Санитарно-бактериологическое исследование воздуха проводится седиментационным и аспирационным методами. Седиментационный метод по Коху заключается в том, что чашки Петри со средой оставляют открытыми на 5-10 минут на общую обсемененность и не менее 40 минут на обсемененность кокковой микрофлорой. Засеянные чашки инкубируют 24 часа в термостате и столько же при комнатной температуре. Количество выросших колоний соответствует степени загрязненности воздуха. На площадь 100 кв. см. в течение 5 минут оседает столько бактерий, сколько их содержится в 10 л. воздуха. Аспирационный метод более точный количественный метод определения микробного числа воздуха. Посев воздуха осуществляется с помощью аппарата Кротова. Он устроен таким образом, что воздух с заданной скоростью просасывается через узкую щель пластины, закрывающей чашку Петри с питательным агаром. При этом частицы аэрозоля с содержащимися на них микроорганизмами равномерно фиксируются на всей поверхности среды благодаря постоянному вращению чашки под входной щелью. Микрофлора воды Микробиологические и паразитологические показатели для питьевой воды.
Методы индикации: Метод мембранных фильтров Мембранный фильтр помещают в воронку Зейтца, вмонтированную в колбу Бунзена, которая присоединяется к вакуумному насосу. Воду фильтруют в объеме 333 мл. Затем фильтры Зейтца помещают на поверхность среды Эндо в чашки Петри и после инкубации при 370С в течение суток подсчитывают количество выросших колоний, типичных для БГКП. Из 2-3 колоний красного цвета готовят мазки, окрашивают по Граму и ставят оксидазный тест, позволяющий дифференцировать бактерии родов Escherichia, Citrobacter и Enterobacter от грамотрицательных бактерий семейства Pseudomonadaceae и других оксидазоположительных бактерий, обитающих в воде. Для этого фильтр с выросшими на нем колониями бактерий переносят пинцетом, не переворачивая, на кружок фильтровальной бумаги, смоченной диметил-n-фенилендиамином. При наличии оксидазы индикатор окрашивает колонию в синий цвет. 2-3 колонии, не изменившие первоначальную окраску, засевают в полужидкую среду с 0,5% раствором глюкозы. Посевы инкубируют в течение суток при 370С. При наличии газообразования подсчитывают число красных колоний на фильтре и определяют коли-индекс. Метод бродильной пробы 1-й день. Воду в объме 100 мл берут 3 пробы, 10 мл (3 пробы) засевают соответственно на 10 мл и 1 мл концентрированной среды ГПС (глюкозопептонная среда) или ЛПС (лактозопептонная среда). 1 мл воды (3 пробы) засевают на 10 мл разведенной среды ГПС с «поплавками». Посевы инкубируют при 37°С 24 часа. 2-й день. Из всех объемов воды. независимо от результатов (кислота- газ) делают пересев на две чашки со средой Эндо (одна - с добавлением раствора основного фуксина или раствора разоловой кислоты, другая - с добавлением молока или желатина - для обнаружения протеолиза). Посевы инкубируют при 37°С 18 часов. 3-й день. С чашек из каждого засеянного объема отбирают 2-3 лактозоположительные, протеолизоотрицательные оксидазоотрицательные, грам-отрицательные палочки и отвивают на полужидкий агар с глюкозой и индикатором Андреде или бромтимоловым синим (укол в столбик). Посевы инкубируют 20 часов при 37°С. 4-й день. Производят учет результатов. Определяют, какой объем воды на полужидком агаре с глюкозой дает образование кислоты и газа, и делают расчет коли-титра и индекса по таблице ГОСТа 48963-73. Микробное число определяют при посеве 1мл исследуемой, воды. Оксидазный тест позволяет отбросить оксидазоположительные колонии (псевдомонады, аэромонады, вибрионы и др.). Микроскопия мазков из колоний dпозволяет исключить грамположитель-ную споровую флору и шаровидные бактерии. Окисление глюкозы, лактозы до кислоты и газа при 37°С подтверждает принадлежность бактерий к кишечной группе. 21.Взаимоотношения между микроорганизмами в ассоциациях: симбиоз, метабиоз, синергизм, антибиотизм. Микробы антагонисты и их использование в производстве эубиотиков и других лечебных препаратов. Взаимоотношения между микроорганизмами могут быть симбиотические ( симбиоз, метабиоз, сателлитизм, синергизм) и конкурентные (антагонизм, паразитизм, хищничество). Симбиоз - взаимоотношения микроорганизмов, при которых два или более вида микроорганизмов при совместном развитии создают для себя взаимовыгодные условия. Типичный пример таких взаимоотношений – совместное развитие аэробных и анаэробных бактерий. При метабиозе продукты жизнедеятельности одного микроорганизма, содержащие значительное количество энергии, потребляются другими микроорганизмами в качестве питательного материала. Между ними складываются синтрофные связи, при которых субстрат используется одновременно несколькими видами микробов. В частности, некоторые инфекционные заболевания человека являются полимикробными, т. е. вызываются синтрофными ассоциациями бактерий. Газовая гангрена, например, обусловлена действием нескольких возбудителей из рода Clоstridium в ассоциации с различными аэробными бактериями, главным образом, стафилококками и стрептококками. Разновидностью метабиоза является сателлитизм, для которого характерно, что одни микроорганизмы выделяют в среду ростовые вещества (аминокислоты, витамины и др.), стимулирующие развитие другого микроорганизма или макроорганизма-хозяина, как, например, нормальная микрофлора у человека. При синергизме у членов микробной ассоциации взаимно повышается физиологическая активность за счет выделения продуктов, стимулирующих их развитие. Помимо благоприятных взаимоотношений между микроорганизмами наблюдаются и такие, при которых один вид микроорганизмов полностью или частично подавляет рост и развитие других видов, т. е между ними при их развитии наблюдается антагонизм. Причины, приводящие к антагонизму, разнообразны: 1. Антагонизм, складывающийся при совместном развитии разных видов, нуждающихся в одних и тех же питательных веществах. В этом случае преимущества будут у того микроорганизма, скорость роста которого выше скорости роста других. Так, при совместном высеве на питательный субстрат, необходимый одновременно для роста и эубактерий и актиномицетов, эубактерии будут развиваться быстрее. 2. Антагонизм, связанный с образованием микроорганизмами органических кислот, спиртов, или других продуктов обмена, которые изменяют условия среды, делая ее непригодной для развития других микроорганизмов. В процессе смены микрофлоры свежего молока в нем содержатся как молочнокислые, так и гнилостные бактерии. Вначале они развиваются одинаково, но в результате размножения молочнокислых бактерий накапливается молочная кислота и молоко значительно подкисляется. В этих условиях наблюдается подавление роста, а затем и полная гибель гнилостных бактерий. 3. Антагонизм, связанный с образованием и выделением в окружающую среду антибиотических веществ (антибиотиков, бактериоцинов и др.). Примеры: отношения молочнокислых и гнилостных бактерий- молочнокислые бактерии подавляют рост грамотрицательных энтеробактерий различных видов, в т. ч. Условно-патогенных, населяющих кишечник человека и животных. Антагонистические отношения микроорганизмов широко применяются в производстве антибиотиков, в пищевой промышленности, в сельском хозяйстве, в очистке водоемов. Наиболее резко антагонизм проявляется у актиномицетов, бактерий и грибов, наблюдается также среди водорослей и простейших. Лучше изучен антагонизм, связанный с образованием антибиотиков и других продуктов обмена веществ. Антибиотики природного происхождения чаще всего продуцируются актиномицетами. 24. Понятие об асептике и антисептике. Дезинфекция. Стерилизация. Дробная стерилизация. Методы стерилизации. Контроль качества стерилизации. Асептика - условия и комплекс мероприятий, направленных против возможности попадания микроорганизмов в рану, ткани, органы, полости тела больного при хирургических операциях, перевязках, инструментальных исследованиях, а также на предотвращение микробного и другого загрязнения при получении стерильной продукции на всех этапах технологического процесса. Антисептика (лат. anti — против, septicus — гниение) — система мероприятий, направленных на уничтожение микроорганизмов в ране, патологическом очаге, органах и тканях, а также в организме больного в целом, использующая механические и физические методы воздействия, активные химические вещества и биологические факторы. Дезинфекция - комплекс мероприятий, направленных на уничтожение конкретных патогенных микробов. Стерилизация- обработка объектов окружающей среды, при которой достигается полное уничтожение всех микроорганизмов. Методы: Тиндализация - дробная стерилизация материалов при 56-580С в течение 1 часа 5-6 дней подряд. Применяется для стерилизации легко разрушающихся при высокой температуре веществ ( сыворотка крови, витамины и др.). Пастеризация - стерилизация при 65-700С в течение 1 часа для уничтожения бесспоровых микроорганизмов ( молоко освобождается от бруцелл, микобактерий туберкулеза, шигелл, сальмонелл, стафилококков). Хранят на холоде. Стерилизация фильтрованием - освобождение от микробов материала, который не может быть подвергнут нагреванию (сыворотка крови, ряд лекарств). Используются фильтры с очень мелкими порами, не пропускающими микробы: из фарфора (фильтр Шамберлана), каолина, асбестовых пластинок (фильтр Зейтца). Фильтрование происходит под повышенным давлением, жидкость нагнетается через поры фильтра в приемник или создается разрежение воздуха в приемнике и жидкость всасывается в него через фильтр. К фильтрующему прибору присоединяется нагнетающий или разрежающий насос. Прибор стерилизуют в автоклаве. Стерилизацию сухим жаром осуществляют в сухожаровых шкафах (печь Пастера). Сухим жаром стерилизуют лабораторную посуду. Режим стерилизации: 1600С - 60 мин, 1800С - 15 мин, 2000С - 5 мин. Жидкости, питательные среды, предметы из резины и синтетических материалов нельзя стерилизовать сухим жаром. Стерилизации паром. Существует 2 режима стерилизации: 1. Текучим паром в автоклаве или аппарате Коха при не завинченной крышке и открытым выпускном кране, когда антибактериальное действие пара проявляется в отношении вегетативных форм. Так стерилизуют среды с витаминами и углеводами, мочевиной, молоком, картофелем и желатиной. Для полного обеспложивания применяют дробную стерилизацию (при 1000С) 20-30 мин 3 дня. 2. Стерилизация паром под давлением в автоклаве - наиболее эффективный метод обеспложивания. При однократной обработке при 1-2 атм в течение 15-25 мин. погибают как вегетативные, так и споровые формы бактерий. Этим методом стерилизуют перевязочный материал, операционное белье, хирургические инструменты, лабораторную посуду, инфицированный материал, инъекционные растворы. Материал помещают в емкости (биксы). На дно бикса помещают прокладки из ткани, впитывающие влагу после стерилизации. Стерильность материала сохраняется 3 суток. Контроль стерилизации. Для контроля используют различные тесты, представляющие чаще всего порошкообразные вещества, меняющие консистенцию или цвет при достижении определенной температуры стерилизуемого материала (бензойная кислота 1210С, антипирин - 1130С, резорцин - 1100С). В настоящее время используются бумажные индикаторы стерилизации одноразового применения для контроля параметров режимов работы паровых и воздушных стерилизаторов. Бумажные полоски закладываются в разных местах со стерилизуемым материалом и после окончания цикла сверяют изменение окраски индикатора с эталоном. Если индикатор светлее эталона – стерилизуемые объекты подлежат повторной стерилизации. Для экспресс-контроля концентраций рабочих растворов для дезинфекции также используются индикаторные полоски (Дезаконт-ПВ-01). 23.Материальные основы наследственности микроорганизмов. Генотип и фенотип. Виды изменчивости. Ненаследственная изменчивость. Наследственная изменчивость. Мутации и их разновидности. Мутагены химические и биологические Генотип-совокупность генов организма. У бактерий имеется одна замкнутая кольцевая хромосома, содержащая до 4000 отдельных генов, необходимых для поддержания жизнедеятельности и размножения бактерий, т. е. бактериальная клетка гаплоидна, а удвоение хромосомы всегда сопровождается ее делением. В некоторых бактериях обнаруживают внехромосомные молекулы ДНК, представленные плазмидами. Они не являются жизненно необходимыми, т. е. не кодируют информацию о синтезе ферментов, участвующих в энергетическом и пластическом метаболизме. Плазмиды - фрагменты ДНК с молекулярной массой 106- 108 Д, несущие от 40 до 50 генов, несут 2 функции - регуляторную и кодирующую. Конъюгативные плазмиды - переносятся от бактерии к бактерии (обычно внутри вида или близкородственными видами) в процессе конъюгации, обычно это относительно крупные F-, R-, Col-плазмиды (чаще выявляются у Гр- палочек). Неконъюгативные плазмиды - обычно характерны для Гр+ кокков, но могут встречаться и у Гр - микроорганизмов; небольшие по размерам могут присутствовать до 30 на 1 клетку. Неконъюгативные плазмиды тоже могут быть перенесены из клетки в клетку при наличии в бактерии одновременно конъюгативных и неконъюгативных плазмид. R-плазмиды обуславливают устойчивость к лекарственным препаратам, например к сульфаниламидам, стрептомицину, пенициллину, тетрациклину, либо устойчивость к тяжелым металлам (ртуть, никель, кадмий, кобальт). R-плазмиды выявляют постановкой чувствительности бактерий к антибиотикам методом диффузии в агар из бумажных дисков. F-плазмиды - удвоение ДНК некоторых плазмид индуцирует деление бактерий, т. е. увеличивает их «плодовитость». Интегрированные в бактериальную хромосому F-плазмиды называют Hfr-плазмиды (от англ. High frequency of recombitions - высокая частота рекомбинации). F-плазмида контролирует синтез половых ворсинок (sex или F pili), которые способствуют эффективному спариванию бактерий-доноров с реципиентными клетками при конъюгации. Col-плазмиды - контролируют синтез особого рода антибактериальных веществ белковой природы - бактериоцинов, способных вызывать гибель бактерий того же вида или близких видов. Бактериоцины обнаружены у кишечной палочки (колицины), бактерий чумы (пестицины), холерных вибрионов (вибриоцины), стафилококков (стафилоцины). Известно более 200 различных бактериоцинов. Фенотип- совокупность свойств микробов, которые выявляются в определенных условиях. Виды изменчивости: генотипическая ( наследственная) и фенотипическая ( ненаследственная) Фенотипические изменения какого-либо признака или нескольких признаков называют модификациями, они не находятся под контролем генома, не сопровождаются изменениями первичной структуры ДНК и вскоре, после действия фактора и его прекращения, утрачиваются. Модификации проявляются в мире бактерий довольно часто, они могут возникать в популяции любого вида. У бактерий чаще наблюдаются морфологические модификации, приводящие к обратимым изменениям формы бактерий. Так, например, в старых культурах палочковидные бактерии изменяются до кокковидных, подвижные бактерии теряют подвижность на средах с формалином, пигментообразующие бактерии временно утрачивают синтез пигмента (Serratia marcescens). L-формы бактерий пенициллина. Генотипические изменения- сопровождаются изменениями в структуре генома бактерий и различными мутациями. Мутации – изменения в первичной структуре ДНК, которые выражаются в наследственно закрепленному появлению, утрате или изменению какого-либо признака. Их классифицируют: 1. По происхождению: - спонтанные. Возникают в результате репарирующих ферментов, ДНК-полимеразы при репликации РНК. - индуцированные, которые получают в эксперименте под действием различных мутагенов. 2. По характеру изменений в первичной структуре ДНК: - генные - затрагивающие один ген - хромосомные - представляющие крупные перестройки в отдельных фрагментах ДНК. Также имеет подклассы: Делеция-выпадение большого количества нуклеотидов Инверсия- поворот участка ДНК на 180 Дубликации- повторение участка хромосомы 3. Точковые мутации- изменяется одна пара нуклеотидов в молекуле ДНК. Мутагены-факторы, вызывающие предмутационные повреждения во фрагменте ДНК, которые переходят в мутацию в результате ошибок в работе репарирующих ферментов. Химические (нитраты, пестициды) приводят к различным эффектам (замена пар оснований, вступление в реакцию с ДНК) Биологические – вирусы, подвижные(мобильные) генетические элементы 24.Механизмы передачи генетической информации у бактерии (рекомбинации): трансформация, конъюгация, трансдукция. Биологическое значение и практическое применение. 1. Трансформации - непосредственная передача генетического материала (фрагмента ДНК) донора другой клетке клетке. 2. Трансдукция. Передача генетического материала при помощи фагов. Существуют 3 типа: - Неспецифическая – когда в процессе сборки фага в него проникает участок ДНК бактерии. Потом фаг страивается в другую клетку и таким образом переносит ген. информацию. - Специфическая. В результате образования дефектного фага происходит включение ДНК бактерии-донора и ДНК дефектного фага в хромосому реципиента. - Абортивная. Принесенный фагом врагмент ДНК бактерии-донора не включается в хромосому бактерии-реципиента, а остается в ее цитоплаезме и способен в таком виде функционировать 3. Конъюгация. Перенос генетического материала при скрещивании клеток через F-плазмиду (половой фактор). Свойство F-плазмиды - включаться в определенные участки хромосомы и сразу становиться ее частью, это приводит к разрыву одной из нитей ДНК и обеспечивает ее перенос Иногда F-плазмида освобождаясь из хромосомы захватывает сцепленные с ней бактериальные гены, подобно профагу. 25. Организация генетического материала у бактерий. Плазмиды и их основные генетические функции. Виды плазмид. Мобильные генетические элементы. У бактерий имеется одна замкнутая кольцевая хромосома, содержащая до 4000 отдельных генов, необходимых для поддержания жизнедеятельности и размножения бактерий, т. е. бактериальная клетка гаплоидна, а удвоение хромосомы всегда сопровождается ее делением. В некоторых бактериях обнаруживают внехромосомные молекулы ДНК, представленные плазмидами. Они не являются жизненно необходимыми, т. е. не кодируют информацию о синтезе ферментов, участвующих в энергетическом и пластическом метаболизме. Плазмиды - фрагменты ДНК с молекулярной массой 106- 108 Д, несущие от 40 до 50 генов, несут 2 функции - регуляторную и кодирующую. Конъюгативные плазмиды - переносятся от бактерии к бактерии (обычно внутри вида или близкородственными видами) в процессе конъюгации, обычно это относительно крупные F-, R-, Col-плазмиды (чаще выявляются у Гр- палочек). Неконъюгативные плазмиды - обычно характерны для Гр+ кокков, но могут встречаться и у Гр - микроорганизмов; небольшие по размерам могут присутствовать до 30 на 1 клетку. Неконъюгативные плазмиды тоже могут быть перенесены из клетки в клетку при наличии в бактерии одновременно конъюгативных и неконъюгативных плазмид. R-плазмиды обуславливают устойчивость к лекарственным препаратам, например к сульфаниламидам, стрептомицину, пенициллину, тетрациклину, либо устойчивость к тяжелым металлам ( ртуть, никель, кадмий, кобальт). R-плазмиды выявляют постановкой чувствительности бактерий к антибиотикам методом диффузии в агар из бумажных дисков. F-плазмиды - удвоение ДНК некоторых плазмид индуцирует деление бактерий, т. е. увеличивает их «плодовитость». Интегрированные в бактериальную хромосому F-плазмиды называют Hfr-плазмиды (от англ. High frequency of recombitions - высокая частота рекомбинации). F-плазмида контролирует синтез половых ворсинок (sex или F pili), которые способствуют эффективному спариванию бактерий-доноров с реципиентными клетками при конъюгации. Col-плазмиды - контролируют синтез особого рода антибактериальных веществ белковой природы - бактериоцинов, способных вызывать гибель бактерий того же вида или близких видов. Бактериоцины обнаружены у кишечной палочки (колицины), бактерий чумы (пестицины), холерных вибрионов (вибриоцины), стафилококков (стафилоцины). Известно более 200 различных бактериоцинов. Плазмиды патогенности - контролируют вирулентные свойства многих видов, особенно энтеробактерий. В частности F-,R-,Col-плазмиды в интегрированном состоянии включают tox+ транспозоны, кодирующие токсинообразование. Нередко tox+ транспозоны кодируют синтез интактных протоксинов (например, дифтерийного или ботулинического), активируемых клеточными протеазами, образование которых контролируют гены бактериальных хромосом. Мобильные (=мигрирующие) генетические элементы бактерий – дискретные сегменты ДНК, способные к самостоятельному перемещению из одного участка в другой в пределах репликона, а также к перемещению из одного репликона (хромосомного, плазмидного или фагового) в другой. К таким элементам относятся: простые вставочные последовательности (IS-элементы), транспозоны (Tn-элементы) и фагитранспозоны (Mu, Д3112 и др.). Интеграция их в репликоны происходит независимо от системы общей рекомбинации клеток, которая требует обязательной гомологии у рекомбинирующих структур. 26. Гетерогенность популяции микроорганизмов. Понятие о диссоциации бактерий. R- и S-формы колоний. Биологические свойства бактерий в R- и S-формах колоний. Своеобразной формой изменчивости является R-S диссоциация бактерий. Она возникает спонтанно вследствие образования двух форм бактериальных клеток, которые отличаются друг от друга по характеру образуемых ими колоний на твердой питательной среде. Один тип - R-колонии (rough - неровный) - характеризуется неровными краями и шероховатой поверхностью; второй тип - S-колонии (smooth - гладкий) - имеет круглую форму, гладкую поверхность. Процесс диссоциации, т. е. расщепления бактериальных клеток, формирующих оба типа колоний, обычно протекает в одном направлении: от S- к R-форме, иногда через промежуточные стадии образования слизистых (М) или карликовых (Д) колоний. Обратный переход R- в S-форму наблюдается реже. Для большинства вирулентных бактерий характерен рост в виде S-формы колоний. Исключение составляют микобактерии туберкулеза, иерсинии чумы, сибиреязвенные бактерии и некоторые другие, которые в R-форме являются вирулентными. В процессе диссоциации одновременно с изменением морфологии колоний меняются биохимические, антигенные, патогенные свойства бактерий, их устойчивость к физическим и химическим факторам внешней среды. Биологическое значение S-R-диссоциации состоит в приобретении бактериями определенных селективных преимуществ, обеспечивающих их существование в организме человека или во внешней среде. К ним относится более высокая устойчивость S-форм к фагоцитозу макрофагами, бактерицидному действию сыворотки крови. Rформы обладают большей устойчивостью к факторам окружающей среды. Они более длительное время сохраняются в воде, молоке. S-R-диссоциация усложняет бактериологическую диагностику ряда инфекционных заболеваний, например, дизентерия Зонне, эшерихиоза, вызванного E.coli О124 и др. Мутации и индукция новых мутаций мутагенами представляют собой ценный инструмент в генетических и биохимических исследованиях. Во-первых, изменения, которые вызывает мутация в определенном гене, позволяют не только его идентифицировать, но и точно указать его место в хромосоме с помощью методов генетического картирования. Во-вторых, анализ мутантных штаммов, у которых нарушены различные этапы сложной цепи биохимических процессов, может вскрыть детали организации генетического и биохимического аппаратов. В-третьих, знание механизмов действия различных мутагенов может помочь в установлении корреляции между мутагенным и канцерогенным действием множества факторов окружающей среды (химические агенты, радиоактивное излучение и др.). 27.Молекулярно-генетические методы диагностики инфекционных заболеваний: молекулярная гибридизация, полимеразная цепная реакция (ПЦР). Метод молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот (НК) основывается на способности НК специфически соединяться (гибридизироваться) с комплементарными фрагментами гомологичных ДНК или РНК искусственно созданных нитей, меченных изотопами или ферментами (пероксидаза, щелочная фосфатаза). Полимеразная цепная реакция (ПЦР). В случаях, когда в исследуемом матенриале ДНК или РНК мало или недостаточно для того, чтобы установить ее точную генетическую принадлежность, прибегают к полимеразной цепной реакции, основу которой составляет катализируемое ДНК-полимеразой многократное образование копий определенного участка ДНК. Вначале проводят термическое (t 95°) разделение двухнитевой молекулы ДНК на отдельные цепочки. После охлаждения в пробирку вносят праймеры (затравки), комплементарные нуклеотидным последовательностям обеих цепочек, содержащие не менее 20-30 нуклеотидов. Затем в среду вносят термостабильную tag-полимеразу (по названию микроба Thermus aquaticus), что запускает образование вторичных копий цепей ДНК. Процесс удвоения повторяется 20-30 раз, что позволяет получить около миллиона копий ДНК. Полученную нуклеиновую кислоту идентифицируют с помощью электрофореза в 1% геле с окраской фракций ДНК бромидом этидия, яркосветящимся в ултрафиолетовых лучах. Полученные электрофореграммы анализируются. При проведении ПЦР используются специальные термостаты-циклеры, позволяющие быстро проводить нагревание и охлаждение исследуемых проб. 28.Генетика вирусов. Внутривидовой и межвидовой обмен генетическим материалом, его значение в возникновении и течении инфекционных заболеваний. Наследственный материал вирусов представляет собой одну, иногда несколько молекул РНК и ДНК, упакованный в защитную белковую оболочку. Этот комплекс называется нуклеокапсид. Число генов колеблется от 4-6 (парововирусы) до 150 генов и больше ( вирус оспы). Множественная реактивация — процесс взаимодействия вирусов с поражением разных генов, в результате которого взаимодействующие вирионы дополняют друг друга благодаря генетической рекомбинации, образуя неповрежденный вирус. Рекомбинация — обмен генетическим материалом между вирусами — возможна в виде обмена генами (межгенная рекомбинация) или участками одного и того же гена (внутригенная рекомбинация). У вирусов рекомбинация происходит в процессе заражения двумя или более типами вирусов, отличающимися друг от друга по генетическим признакам. Вариантом рекомбинации является перекрестная реактивация, или кросс-реактивация, происходящая в том случае, когда у одного из штаммов вируса часть генома повреждена, а другой геном нормальный. При смешанной инфекции двумя такими вирусами в результате рекомбинации появляются штаммы вируса со свойствами родительских микроорганизмов. В качестве примера негенетического взаимодействия вирусов может быть приведена комплементация: при смешанной инфекции стимулируется репродукция обоих участников взаимодействия или одного из них без изменения генотипов вирусов. Комплементация широко распространена среди вирусов и наблюдается между как родственными, так и неродственными вирусами. Обмен генетическим материалом при этом феномене не наблюдается. Если геном одного вируса заключен в капсид другого вируса, этот феномен называется фенотипическим смешиванием, наблюдаемым при смешанной инфекции. Возможны также генетические взаимодействия неродственных вирусов, изучаемые генетической инженерией. Изучение генетики микроорганизмов не только имеет важное биологическое значение, но и способствует решению многих медицинских проблем, таких, как разработка патогенетических основ лечения и профилактики инфекционных болезней, способов диагностики (полимеразная цепная реакция, ДНК-зонды), создание профилактических, лечебных и диагностических препаратов. В течении инфекционных болезней это имеет большое значение, так как при обмене вирусами генетическим материалом появляются новые штаммы, что значительно усложняет течение болезни и его диагностику, а также лечение. 29.Методы лабораторной диагностики вирусных инфекций: микроскопический, вирусологический, серологический, молекулярно-генетический. Индикация и идентификация вирусов. Микроскопический метод исследования - это метод обнаружения и определения микроорганизмов в исследуемом материале на основании: морфологических свойств, специфического расположения микробных клеток в мазке, наличия специфических органоидов в микробной клетке, тинкториальных свойств микробной клетки ( отношение к красителям). Вирусологический - заключается в заражении исследуемым материалом чувствительной биологической модели (лабораторные животные, куриные эмбрионы), индикации вируса и его последующей идентификации. При заражении животных индикация проводится по клинической картине болезни или по результатам аутопсии. Серологические исследования – это методы изучения антигенов или антител в биологическом материале больных, основанные на определенных реакциях иммунитета, позволяющих обнаружить наличие антител к антигенам или же наличие антигенов, примеры: РИФ, реакция гемагглютинации. Молекулярно-генетический метод – это методы изучения структуры ДНК для диагностики заболевания, позволяет обнаружить вирус при ничтожно малых концентрациях, то есть на самых ранних стадиях заболевания, примеры: ПЦР и молекулярная гибридизация. Индикация – лабораторный процесс установления неидентифицированных вирусов в исследуемом материале или в системе культивирования вирусов. Проводят на основе следующих признаков: цпд, образование внутриклеточных включений, образование бляшек, реакция гемагглютинации, РН или цветной реакции. Идентификация – изучение свойств исследуемого вируса и определение его принадлежности к одной из классификаций вирусов , установление его сходства с раннее описанным видом или штаммом вируса. Проводят на основе морфологических, тинкториальных, биохимических и культуральных свойств, примеры: РИФ, ИФА, РНГА, РПГА, РСК. 30.Микрофлора тела человека в различные возрастные периоды. Роль микробов – постоянных обитателей тела человека в физиологических процессах. Микрофлора полости рта. Сочетание микробных ассоциаций, встречающихся в организме человека, составляют его микрофлору. Нормальная микрофлора – это качественное и количественное соотношение разнообразных популяций микробов отдельных органов и систем, поддерживающее биохимическое, метаболическое и иммунологическое равновесие макроорганизма, необходимое для сохранения здоровья человека. Кишечник родившегося ребенка стерилен. Первым и основным источником микробной флоры для новорожденного ребенка является мать. Первичная микробная контаминация ребенка начинается за счет флоры влагалища уже во время родового акта при прохождении родовых путей матери. В дальнейшем в результате постоянного контакта с матерью аутофлора новорожденного начинает формироваться в основном за счет микрофлоры кишечника матери При грудном вскармливании в течение 4-6-7 появляются бифидобактерии, энтерококки, лактобактерии, но при искусственном вскармливании в кишечнике новорожденных быстро появляются стафилококки, стрептококки, сарцины, анаэробные бактерии, дрожжи, а также возникают изменения в составе нормальной микрофлоры кишечника. Например, бактероиды у детей с искусственным вскармливанием высеваются в большем количестве (1010) и от 5 до 10% диарей вызываются этими микробами. Вейлонеллы у детей, находящихся на искусственном 49 вскармливании, также регистрируются чаще и в большем количестве (108 ), чем у взрослых (105 ) и иногда вызывают у них диспептические явления. Среди бифидобактерий у них чаще всего присутствуют виды В.adolescentis и B.longus, что характерно чаще всего для взрослых, а не B.biphidus и B.inphantis, как это бывает при грудном вскармливании. Следовательно, профилактика нарушений микробиоценоза новорожденного должна начинаться еще задолго до его рождения путем коррекции дисбактериоза родовых путей и кишечника, если таковые имеются у будущей матери. Микрофлора кожи. Преобладающим представителем кожной микрофлоры являются анаэробные пропионобактерии (преимущественно P. аcnes). Здесь же в значительных количествах присутствуют стафилококки, дифтероиды, грибы рода Candida. Микрофлора полости рта Она разнообразна и многочисленна, поскольку в ротовой полости создаются благоприятные условия для жизнедеятельности микроорганизмов. Это щелочная реакция слюны, пищевые остатки, «термостатная» температура и влажность. Особенно много их локализуется в зубном налѐте, между зубами, в криптах и лакунах миндалин. В ротовой полости встречается более 300 видов микроорганизмов. Их можно разделить на постоянную (резидентную) и факультативную микрофлору. Более многочисленны анаэробы (бактероиды, пептококки, лептотрихии, фузобактерии, вейлонеллы). Резидентную группу составляют стрептококки ( Str. salivarius, Str. mutans, Str. sanguis), непатогенные стафилококки, диплококки, коринебактерии, лактобациллы, вейлонеллы, трепонемы (Tr. Buccalis), дрожжеподобные грибы ( Candida albicans), актиномицеты, микоплазмы, простейшие. Среди факультативных микроорганизмов встречаются энтеробактерии ( роды Eseherichia, Klebsiella, Enterobacter, Proteus), синегнойная палочка, спорообразующие - бациллы, клостридии, а также - пептострептококки и пептококки. Некоторое время в ротовой полости могут персистировать вибрионы, спирохеты, дифтерийная палочка, менингококки и др. Микрофлора желудка бедна, поскольку большинство попадающих сюда микроорганизмов погибают под действием соляной кислоты желудочного сока. Однако при нарушении общего и местного гомеостаза в желудке могут появляться условно-патогенные микроорганизмы, которые способствуют возникновению гастритов и язвенной болезни (Helicobacter pyloris). В тонком кишечнике в норме микроорганизмы либо отсутствуют, либо их количество невелико. Из выявляемых бактерий чаще обнаруживаются энтерококки, лактобактерии. Иногда высеваются сарцины, грибы. В толстом кишечнике регистрируется самая разнообразная по составу микрофлора. Биомасса микроорганизмов, заселяющих кишечник взрослого человека, составляет 2,5-3 кг и включает в себя до 450 видов. Нормальная микрофлора кишечника на 92-95% состоит из строго анаэробных видов, остальная часть - аэробы. Кишечную микрофлору делят на облигатную и факультативную. К облигатным микробам относят буфидумбактерии, лактобактерии, бактероиды, кишечные палочки, энтерококки. К факультативным бактериям толстого кишечника относят сапрофитные, условно-патогенные, патогенные виды микробов. Микрофлора урогенитальной системы Почки, мочеточники и моча в мочевом пузыре в норме стерильны. На наружных половых органах мужчин и женщин обнаруживаются микобактерии смегмы ( Mycobacterium Smegmalis ), непатогенные, иногда патогенные стафилококки, монококки, коринебактерии, микоплазмы, но пейзаж микроорганизмов однообразен, включает 2-3-4 вида. Уретра женщин обычно стерильна. Уретра мужчин имеет немногочисленную микрофлору: непатогенные кокки, сапрофиты, дрожжи. Сразу после рождения женщины происходит заселение влагалища лактобактериями, затем появляется кокковая флора. В зрелом возрасте, кроме лактобактерий и непатогенных кокков, появляются непатогенные стрептококки, клебсиеллы, бактероиды, анаэробы, микоплазмы, дрожжевые грибки, грибы Candida. Но основным и важнейшим представителем нормальной микрофлоры влагалища является Bac. vaginalis ( палочка Додерлейна -лактобактерии). В некоторых случаях, в микрофлоре влагалища появляются и вызывают заболевания такие микробы как патогенные или условно-патогенные стафилококки, стрептококки, синегнойные палочки, клебсиеллы, хламидии, а также микробные ассоциации. Хламидии, вызывающие распространѐнное в настоящее время заболевание хламидиоз, не являются представителем нормальной микрофлоры влагалища. 31. Антибиотики. Классификация, единицы измерения активности антибиотиков. Механизмы действия антибактериальных препаратов на микробы. Методы определения чувствительности микробов к антибиотикам. Осложнения при антибиотикотерапии. Антибиотики – вещества, образуемые различными живыми клеточными структурами, способные подавлять рост и вызывать гибель определенных микроорганизмов. По происхождения антибиотики подразделяют на следующие группы: ∙ Антибиотики, образуемые бактериями (грамицидин, полимиксин и др.); ∙ Актиномицетами (линкомицин и др.); ∙ Грибами (пенициллин, цефалоспорины и др.); ∙ Растениями (фитонциды: аллицин, рафанин и др.); ∙ Животными клетками (экмолин, эритрин); ∙ Синтетические и полусинтетические. По химическому составу антибиотики относятся к следующим основным группам: ∙ Азотсодержащие гетероциклические соединения, имеющие в своем составе бэта-лактамовое кольцо (пенициллины); ∙ Ароматические соединения (левомецитин); ∙ Тетрациклины, содержащие четыре конденсированных шестичленных цикла (тетрациклины и др.); ∙ Аминогликозидные соединения, в составе которых имеются аминосахара (стрептомицин и др.); ∙ Макролиды: содержат макроциклическое кольцо, связанное с аминосахарами (эритромицин и др.); ∙ Ациклические (полиеновые) соединения с несколькими двойными связями - /СН=СН/ (нистатин и др.); ∙ (Фтор)хинолоны. По антимикробному спектру антибиотики подразделяют на две группы: узкого и широкого спектра действия. Антибиотики узкого спектра действуют на определенные группы бактерий (например, пенициллин, оказывающий губительное действие только на шаровидные бактерии, спирохеты и некоторые грамположительные бактерии). Антибиотиками широкого спектра действия являются аминогликозиды, подавляющие рост кислотоустойчивых, многих грамположительных и грамотрицательных бактерий, простейших, риккетсий, хламидий. Антибактериальное действие антибиотиков измеряют в единицах действия (Е.Д.), содержащихся в 1 мл раствора препарата или в 1 мг химически чистого вещества. За единицу активности принимается то минимальное количество антибиотика, которое задерживает рост стандартного штамма определенного вида микроорганизма в строго определенных условиях. Механизм антибактериального действия антибиотиков различен. У одних он связан с нарушением или блокированием синтеза клеточной стенки (пенициллины, цефалоспорины). У других - с адсорбцией на ЦПМ и взаимодействием с ее стерольным компонентом, что приводит к быстрой потере клеткой низкомолекулярных водорастворимых веществ цитоплазмы или нарушением жизненно важных функций ЦПМ (нистатин. полимиксины). У третьих - в блокировании синтеза белка рибосомами бактерий и нарушении считывания генетического кода, что нарушает репликацию бактерий (стрептомицин). Антибиотики, обладающие противоопухолевым действием, избирательно подавляют синтез нуклеиновых кислот в клетках злокачественных опухолей, для которых характерен дефект репарационных механизмов, в связи с чем они не в состоянии восстанавливать поврежденную ДНК. 32.Антибиотики. Механизмы, обеспечивающие формирование резистентности микробов к лекарственным препаратам. Пути преодоления. В основе механизма распространения генов антибиотикорезистентности между бактериями лежит обмен плазмидами и конъюгативными транспозонами. В эволюции антибиотикорезистентности плазмиды и конъюгативные транспозоны выполняют функцию генетических платформ, на которых посредством рекомбинационных систем бактерий происходит сборка и сортировка генов антибиотикорезистентности, включенных в транспозоны, интегроны, генные кассеты и инсерционные криптические последовательности. К настоящему времени известно не менее четырех биохимических механизмов, отвечающих за развития у бактерий антибиотикорезистентности: детоксикация антибиотика; уменьшение проницаемости стенки микроорганизма для антибиотиков и/или выкачивание его из клетки; структурные изменения в молекулах, являющихся мишенями для антибиотиков; продукция альтернативных мишеней для антибиотиков. Высокие уровни антибиотикорезистентности у грамотрицательных бактерий обусловлены их способностью детоксицировать антибиотики в периплазматическом пространстве. В клеточной стенке грамположительных бактерий периплазматическое пространство отсутствует, поэтому механизмы их детоксикационной резистентности к антибиотикам менее эффективны, чем у грамотрицательных бактерий. Целесообразно расширить круг исследуемых проблем, связанных с распространением антибиотикорезистентных патогенных микроорганизмов в клинике, включив в него процессы накопления и обмена генов антибиотикорезистентности среди бактерий в природных экосистемах. Пути преодоления: 1) поиск и создание новых химиотерапевтических препаратов; 2) создание комбинированных препаратов, которые включают в себя химиотерапевтические средства различных групп, усиливающих действие друг друга; 3) периодическая смена антибиотиков; 4) соблюдение основных принципов рациональной химиотерапии: а) антибиотики надо назначать в соответствии с чувствительностью к ним возбудителей заболеваний; б) лечение следует начинать как можно раньше; в) химиотерапевтические препараты необходимо назначать в максимальных дозах, не давая микроорганизмам адаптироваться. 33.Ретровирусы: классификация, биологические особенности, вызываемые ими заболевания. Ретровирусы (Retroviridae) - семейство вирусов, включающее три подсемейства. Пенящие или синцитиальные (Spumavirinae), патогенность их для людей пока не установлена. Опухолеродные (Oncovirinae): два вида вирусов этого подсемейства (HTLV1 и HTLV-2) вызывают у человека Т-клеточные лейкозы и лимфомы. Медленные (Lentivirinae) - к этому подсемейству относится вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), вызывающий СПИД -синдром приобретенного иммунодефицита. Все ретровирусы имеют диплоидный геном, представленный двумя идентичными копиями однонитчатой РНК. С геномом ассоциирована обратная транскриптаза - фермент, необходимый для образования ДНК-транскрипта, интегрирующею в клеточный геном. В отличие oт других ретровирусов ВИЧ имеет сложный геном за счет наличия 106 регупяторных генов, от которых зависит скорость репродукции вирусных частиц. В геноме ВИЧ содержится несколько генов: gag, pol и env кодируют компоненты вирусных частиц, tat и rev -главные регуляторные гены. Антигенными свойствами обладают белки сердцевины (р9, р13, р18. р24) и оболочечные гликопротеины (gp41 н gpl20). Последние характеризуются высоким уровнем антигенной изменчивости, что позволяет вирусу ускользать от иммунологического надзора. Вместе с тем на поверхности оболочечного антигена имеется высококонсервативная область (эпитоп), с помощью которого вирус избирательно распознает и поражает определенные клетки-мишени, несущиеСD-4- рецепторы. Это прежде всего Т-хелперы, макрофаги и моноциты. Моноциты и макрофаги обеспечивают диссиминацию ВИЧ, они рефрактерны к цитопатическому действию вируса, в отличие от лимфоцитов. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||