ГФ №11, том 1. Общие методы анализа редакционная коллегия государственной фармакопеи СССР
 Скачать 2.11 Mb.
|
|
Т = 0,01221. Титр раствора устанавливают каждый раз перед применением. Примечание. Установку титра следует проводить в тщательно закрытых сосудах для титрования. Лучше титрование проводить в атмосфере инертного газа. Раствор метилата натрия (0,1 моль/л) 1 мл раствора содержит 0,005402 г метилата натрия. Приготовление. Около 2,5 г свежеочищенного от окисной пленки металлического натрия малыми порциями прибавляют к 150 мл метилового спирта в мерной колбе вместимостью 1 л. Колбу с метиловым спиртом охлаждают в ледяной воде. После полного растворения металла объем раствора доводят бензолом или толуолом до метки, постепенно помешивая. Установку титра проводят так же, как в случае раствора едкого натра (0,1 моль/л) в смеси метилового спирта и бензола. Титр раствора устанавливают каждый раз перед применением. Примечание. Установку титра проводят в тщательно закрытых сосудах для титрования. Титрование лучше проводить в атмосфере инертного газа. Раствор гидроокиси тетраэтиламмония (0,1 моль/л) 1 мл раствора содержит 0,014726 г гидроокиси тетраэтиламмония. Приготовление. 30 г йодида тетраэтиламмония растворяют в 200 мл метилового спирта и встряхивают в течение часа с 25 г тонко измельченной окиси серебра в склянке с притертой пробкой. По окончании встряхивания центрифугируют несколько миллилитров смеси и раствор испытывают на присутствие йодид-ионов (проба с нитратом серебра в азотнокислой среде). В случае образования осадка йодида серебра к основному раствору прибавляют еще 5 г окиси серебра и снова встряхивают 30 мин. По окончании реакции осадок йодида серебра отфильтровывают через стеклянный фильтр N 4. Реакционную колбу споласкивают тремя порциями по 50 мл сухого бензола, бензольный раствор фильтруют через тот же фильтр и прибавляют к фильтрату. Затем фильтрат помещают в мерную колбу вместимостью 1 л и доводят объем раствора бензолом до метки. Раствор хранят в склянке, снабженной поглотительной трубкой, заполненной натронной известью или аскаритом для предохранения раствора от влаги воздуха и углекислоты. Установка титра. Около 0,1 г (точная навеска) бензойной кислоты растворяют в смеси 5 мл метилового спирта и 20 мл ацетона, нейтрализованных непосредственно перед титрованием по тимоловому синему в метиловом спирте, и титруют приготовленным раствором гидроокиси тетраэтиламмония до получения отчетливого синего окрашивания или потенциометрически со стеклянным электродом. Поправочный коэффициент вычисляют по первому способу, где Т = 0,01221. Примечание. Установку титра проводят в тщательно закрытых сосудах для титрования. Титрование лучше проводить в атмосфере инертного газа. Индикаторы Диметиловый желтый п-Диметиламиноазобензол (ч.д.а.) С14Н15N3 М.м. 225,30 Желтый кристаллический порошок или желтые пластинки. Практически нерастворим в воде, растворим в 95% спирте, бензоле, хлороформе, эфире, разведенных минеральных кислотах. Переход окраски от оранжево - красной к желтой в пределах рН от 2,9 до 4,0. Раствор индикатора. 0,1 г растертого индикатора растворяют в 95% спирте и доводят объем раствора 95% спиртом до 100 мл. Раствор индикатора в бензоле. 0,1 г индикатора растворяют в бензоле и доводят объем раствора бензолом до 100 мл. Кристаллический фиолетовый Гексаметил-п-розанилин - хлорид (ч.д.а.) С25Н30СlN3 М.м. 408,0 Бронзовые блестящие кристаллы или кристаллический порошок темно - зеленого цвета. Растворим в воде, 95% спирте и ледяной уксусной кислоте. Переход окраски при неводном титровании от фиолетовой (щелочная) через сине - зеленую (нейтральная) к желтовато - зеленой (кислая). Раствор индикатора в ледяной уксусной кислоте. 0,1 г индикатора растворяют в ледяной уксусной кислоте и доводят объем раствора той же кислотой до 100 мл. Метиловый красный 4-Диметиламино-2-карбоксиазобензол (ч.д.а.) С15Н15N3О2 М.м. 269,29 Блестящие красно - фиолетовые кристаллы или красно - бурый кристаллический порошок. Мало растворим в воде, трудно растворим в 95% спирте, легко - в кипящем 95% спирте, растворим в растворах едких и углекислых щелочей. Переход окраски от красной к желтой в пределах рН от 4,2 до 6,3. Растворы индикатора. 1. 0,1 г растертого индикатора растворяют в 60 мл 95% спирта и доводят объем тем же спиртом до 100 мл. 2. 0,1 г индикатора растворяют в ступке с 7,4 мл раствора едкого натра (0,05 моль/л) и после его растворения доводят объем раствора свежепрокипяченной и охлажденной водой до 250 мл. Метиловый оранжевый 4-Диметиламиноазобензол-4-сульфонат натрия С14Н14N3NaО3S М.м. 327,34 Кристаллический порошок оранжевого, иногда с коричневатым оттенком цвета. Трудно растворим в воде, легко - в горячей воде; практически нерастворим в 95% спирте. Переход окраски от красной через оранжевую к желтой в пределах рН от 3,0 до 4,4. Раствор индикатора. 0,1 г растертого индикатора растворяют в воде и доводят объем раствора водой до 100 мл. Насыщенный раствор индикатора в ацетоне. К 0,025 г индикатора прибавляют 100 мл ацетона и время от времени встряхивают, через один час фильтруют. Метиловый фиолетовый смесь тетра-, пента- и гексаметил-п-розанилин - хлоридов с преобладанием пентаметил-п-розанилин - хлорида (ч.д.а.) С24Н28СlN3 М.м. 393,96 Темно - зеленый порошок с металлическим блеском. Растворим в воде и 95% спирте. Переход окраски от желтой к зеленой в пределах рН от 0,1 до 1,5 и от зеленой к фиолетовой в пределах рН от 1,5 до 3,2. Раствор индикатора. 0,1 г индикатора растворяют в воде и доводят объем раствора водой до 100 мл. Раствор индикатора в ледяной уксусной кислоте. 0,1 г индикатора растворяют в ледяной уксусной кислоте и доводят объем раствора той же кислотой до 100 мл. Раствор применяют свежеприготовленным. Тимоловый синий Тимолосульфофталеин (ч.д.а.) С27Н30О5S М.м. 466,6 Коричневый кристаллический порошок. Трудно растворим в воде с образованием раствора, окрашенного в желтый цвет, переходящий при нагревании в красный. Растворим в 95% спирте, эфире и ледяной уксусной кислоте, легко растворим в разведенных растворах щелочей с образованием растворов темно - синего цвета. Переход окраски от красной к желтой в пределах рН от 1,2 до 2,8 и от желтой к синей в пределах рН от 8,0 до 9,6. Раствор индикатора. 0,1 г индикатора растирают в ступке с 4,3 мл раствора едкого натра (0,05 моль/л) и после его растворения доводят объем раствора свежепрокипяченной и охлажденной водой до 200 мл. Раствор индикатора в метиловом спирте. 0,3 г индикатора растворяют в метиловом спирте и доводят объем раствора метиловым спиртом до 100 мл. Раствор индикатора в диметилформамиде. 1 г тимолового синего растворяют в диметилформамиде и доводят объем раствора диметилформамидом до 100 мл. Тропеолин 00 4-(Фениламино)-азобензол-4-сульфонат калия (ч.д.а.) С18Н14КN3О3S М.м. 391,50 Коричневато - желтый с золотистым оттенком кристаллический порошок. Растворим в воде и 95% спирте. Переход окраски от красной к желтой в пределах рН от 1,3 до 3,2. Раствор индикатора. 0,1 г растертого индикатора растворяют в воде при нагревании на водяной бане и после охлаждения доводят объем раствора водой до 100 мл. Раствор индикатора в метиловом спирте. К 0,2 г индикатора прибавляют 100 мл метилового спирта и время от времени взбалтывают (около 1 ч), после чего фильтруют. Бромтимоловый синий Дибромтимолсульфофталеин (ч.д.а.) С27Н28Вr2О5 М.м. 624,4 Белый мелкокристаллический порошок. Очень мало растворим в воде, легко - в 95% спирте, эфире, растворах едких и углекислых щелочей и растворе аммиака. Переход окраски от желтой через зеленую к синей в пределах рН от 6,0 до 7,6. Растворы индикатора. 1. 0,1 г растертого индикатора растворяют в 20 мл теплого 95% спирта и после охлаждения доводят объем раствора водой до 100 мл. 2. 0,1 г индикатора растирают в ступке с 3,2 мл раствора едкого натра (0,05 моль/л) и после его растворения доводят свежепрокипяченной охлажденной водой до 250 мл. 3. 1 г бромтимолового синего растворяют в диметилформамиде и доводят объем раствора диметилформамидом до 100 мл. Нейтральный красный 2-Метил-3-амино-7-диметиламинофеназоний - хлорид (ч.д.а.) С15H17ClN4 М.м. 288,78 Блестящий черно - зеленый порошок. Легко растворим в воде. Переход окраски от красной к желтой в пределах рН от 6,8 до 8,0. Раствор индикатора. 0,1 г растертого индикатора растворяют в воде и доводят объем раствора водой до 100 мл. Раствор индикатора в ледяной уксусной кислоте. 0,1 г индикатора растворяют в ледяной уксусной кислоте и доводят объем раствора той же кислотой до 100 мл. Реактивы Ацетон (ч.д.а.) СН3СОСН3 М.м. 58,08 Прозрачная бесцветная, легко воспламеняющаяся жидкость с характерным запахом. Содержание основного вещества не менее 99,5%. Температура кипения от 55,5 до 56,6 град. С. Максимальное содержание примесей 0,001%. Плотность от 0,7900 до 0,7915. В колбу вместимостью 25 мл наливают 10 мл испытуемого ацетона и помещают в водяную баню с температурой 15 град. С. Когда температура ацетона станет равной 15 град. С, прибавляют 0,2 мл свежеприготовленного раствора перманганата калия (0,001 моль/л) и перемешивают. В течение 30 мин должно сохраниться розовое окрашивание. Смесь 25 мл ацетона с 25 мл воды должна оставаться прозрачной в течение 30 мин. Ацетон, применяемый в качестве среды при титровании раствором хлорной кислоты, должен отвечать следующим дополнительным требованиям: на титрование 30 мл ацетона должно расходоваться не более 0,1 мл раствора хлорной кислоты (0,1 моль/л). В случае титрования с метиловым оранжевым в присутствии ацетата окисной ртути после прибавления последней к ацетону не должно появляться желтое окрашивание. Диметилсульфоксид (х.ч.) (СН3)2SО М.м. 78,13 Прозрачная бесцветная маслянистая жидкость, гигроскопична. Растворим в воде, 95% спирте, эфире, ацетоне. Температура кипения 189 град. С. Плотность от 1,100 до 1,103. Показатель преломления 1,4783. Температура затвердевания от 17 до 18,5 град. С. Диметилформамид (х.ч.) НСОN(СН3)2 М.м. 73,10 Бесцветная прозрачная жидкость с характерным запахом. Смешивается с водой, 95% спиртом, бензолом, хлороформом. Содержание основного вещества не менее 99,9%. Температура кипения от 152,5 до 154 град. С. Плотность от 0,9470 до 0,9490. Содержание воды не более 0,05%. Диметиламина не более 0,002%. Муравьиной кислоты не более 0,002%. Нелетучий остаток не более 0,003%. При титровании 10 мл диметилформамида переход окраски индикатора происходит от прибавления одной капли титранта. 2,4-Динитрофенилгидразин С6Н3(NО2)NН2 М.м. 198,14 Красный кристаллический порошок. Практически нерастворим в воде, мало растворим в 95% спирте, эфире, растворим в разбавленных кислотах. Температура плавления от 190 до 198 град. С. Сульфатная зола не более 0,2%. Потеря в массе при высушивании не более 0,2%. 2,4-Динитрофенилгидразина раствор 1,5 г 2,4-динитрофенилгидразина растворяют в 20 мл 50% серной кислоты, разводят водой до 100 мл и фильтруют. Раствор должен быть свежеприготовленным. Дифенилгуанидин (C6H5NH)2C=NH М.м. 217,27 Бесцветные кристаллы, мало растворим в воде и эфире, растворим в бензоле. Температура плавления от 147 до 148 град. С. Дихлорэтан (ч.д.а.) С2Н4Сl2 М.м. 98,96 Прозрачная бесцветная жидкость, несмешивающаяся с водой. Температурные пределы при 760 мм рт. ст., в которых должно отгоняться 95% препарата, от 83 до 84 град. С. Плотность от 1,2520 до 1,2535. Нелетучий остаток не более 0,002%. Свободный хлор не более 0,001%. В две пробирки из бесцветного стекла, предварительно промытые концентрированной серной кислотой, наливают по 5 мл той же серной кислоты. В одну пробирку прибавляют 5 мл испытуемого дихлорэтана и встряхивают. Полученная окраска не должна превышать окраску серной кислоты. Дихлорэтан, применяемый для неводного титрования, проверяют на устойчивость к бихромату калия: смесь 5 мл дихлорэтана с 25 мл раствора бихромата калия (0,0167 моль/л) и 12,5 мл разведенной серной кислоты кипятят с обратным холодильником 15 мин. После охлаждения прибавляют 10 мл раствора йодида калия и выделившийся йод титруют раствором тиосульфата натрия (0,1 моль/л). На 5 мл дихлорэтана должно расходоваться не более 1 мл раствора тиосульфата натрия (0,1 моль/л). Калия гидрофталат (ч.д.а.) КНС6Н4(СОО)2 М.м. 204,23 Бесцветные кристаллы или мелкокристаллический порошок. Растворим в воде, мало растворим в 95% спирте. Содержание калия гидрофталата от 99,8 до 100,2%. рН 5% водного раствора 4 +/-0,1. Метилэтилкетон (ч.) СН3СОС2Н5 М.м. 72,11 Бесцветная прозрачная жидкость, растворима в воде, смешивается во всех соотношениях с 95% спиртом, эфиром, хлороформом, бензолом. Температура кипения от 79 до 80,5 град. С. Нелетучий остаток не более 0,002%. Муравьиная кислота (ч.д.а.) НСООН М.м. 46,03 Бесцветная прозрачная жидкость с резким запахом, смешивается с водой во всех соотношениях. Растворима в 95% спирте и эфире. Содержание основного вещества не менее 99,7%. Температура кипения от 100 до 101 град. С. Температура кристаллизации не ниже 7,5 град. С. Плотность от 1,22 до 1,221. Содержание уксусной кислоты не более 0,05% щавелевой - не более 0,005%. Нелетучий остаток не более 0,002 %. Нитрометан (ч.) СH3NO2 М.м. 61,04 Прозрачная бесцветная жидкость со своеобразным запахом, напоминающим горький миндаль. Смешивается с 95% спиртом и эфиром, мало растворим в воде. Температура кипения 101 град. С. Плотность от 1,130 до 1,132. Показатель преломления от 1,382 до 1,383. При нагревании нитрометана выше 100 град. С под давлением, особенно в присутствии окисляющих веществ, следует соблюдать осторожность, так как иногда при этом происходит взрыв. Пиридин (ч.д.а.) С6Н5N М.м. 79,10 Бесцветная подвижная жидкость с характерным запахом, гигроскопична. Смешивается во всех соотношениях с водой, 95% спиртом, эфиром, хлороформом. Легко воспламеняется. Содержание пиридина 99,0%. Температура кипения от 114 до 116 град. С. Плотность от 0,982 до 0,985. Содержание воды не более 0,1%. Высушивание пиридина проводят следующим образом. К 1 л пиридина прибавляют 50 г сульфата натрия, предварительно высушенного при температуре от 100 до 110 град. С и охлаждавшегося в эксикаторе. После 10-минутного встряхивания и настаивания фильтруют в перегонную колбу и перегоняют. Сохраняют в склянках с притертыми пробками в защищенном от света месте. Ртути окисной ацетат (ч.д.а.) Нg(CH3COO)2 M.м. 318,68 Бесцветные кристаллы, легко растворимые в воде, растворимые в 95% спирте и уксусной кислоте. Ядовит. Содержание ртути окисной ацетата не менее 97,0%. Около 0,5 г препарата (точная навеска) растворяют в 50 мл воды, прибавляют 5 мл разведенной азотной кислоты и титруют раствором роданида аммония (0,1 моль/л) до перехода светло - зеленого окрашивания в желтоватое (индикатор - железоаммониевые квасцы). 1 мл раствора роданида аммония (0,1 моль/л) соответствует 0,01593 г Нg(СН3СОО)2. Остаток после прокаливания не более 0,02%. Хлоридов не более 0,013%, сульфатов не более 0,005%. Железа не более 0,001%. Ртути окисной ацетата раствор 5 г ацетата окисной ртути помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл и растворяют в теплой ледяной уксусной кислоте. После охлаждения объем раствора доводят ледяной уксусной кислотой до метки. Сохраняют в склянках оранжевого стекла в защищенном от света месте. Спирт метиловый, очищенный от карбонилсодержащих примесей 1 л метилового спирта нагревают три часа с 10 г 2,4-динитрофенилгидразина и 2 мл концентрированной хлористоводородной кислоты с обратным холодильником на кипящей водяной бане. Затем метиловый спирт два раза перегоняют на колонке, собирая фракцию, кипящую при 64,5 град. С. Примечание. Проверка на отсутствие альдегидов: к 25 мл метилового спирта в колбе вместимостью 300 мл прибавляют 75 мл раствора 2,4-динитрофенилгидразина, нагревают на водяной бане с обратным холодильником 24 ч, спирт отгоняют, разводят до 200 мл 2% раствором серной кислоты и оставляют на 24 ч. Не должны образовываться кристаллы. Тетраэтиламмоний - йодид (ч.) (C2H5)4 NI M.м. 257,16 Белые прозрачные кристаллы без запаха. Легко растворим в воде, трудно растворим в 95% спирте. Водные растворы имеют нейтральную реакцию. Температура разложения 250 град. С. Уксусная кислота ледяная (х.ч.) СН3СООН М.м. 60,05 Температура кипения от 118 до 119 град. С. Содержание уксусной кислоты не менее 99,8%. В коническую колбу вместимостью 100 мл с притертой пробкой наливают 10 мл воды, прибавляют около 2 г (точная навеска) испытуемой уксусной кислоты и титруют раствором едкого натра (1 моль/л) до слабо - розового окрашивания (индикатор - фенолфталеин). 1 мл раствора едкого натра (1 моль/л) соответствует 0,06005 г СН3СООН. Нелетучий остаток не более 0,001%. Хлоридов не более 0,0002%. Сульфатов не более 0,0003%. Тяжелых металлов не более 0,0002%. Железа не более 0,0002%. 2 мл испытуемой кислоты (с точностью до 0,1 мл) помещают в колбу, прибавляют 10 мл воды и 0,1 мл раствора перманганата калия (0,1 моль/л). Розовое окрашивание должно сохраняться в течение 30 мин. Ледяная уксусная кислота, применяемая в качестве растворителя при неводном титровании, должна выдерживать следующее дополнительное испытание. 10 мл испытуемой кислоты (с точностью до 0,1 мл) помещают в колбу, прибавляют 10 мл концентрированной серной кислоты, смесь охлаждают до температуры 5 град. С, прибавляют 1 мл 5% раствора бихромата калия и перемешивают. Одновременно готовят контрольный раствор, для чего в колбу прибавляют 10 мл воды, 10 мл концентрированной серной кислоты, 1 мл 5% раствора бихромата калия и перемешивают. Испытуемый и контрольный растворы оставляют на 30 мин. Затем к обоим растворам прибавляют по 50 мл воды, перемешивают и охлаждают до комнатной температуры. По охлаждении к растворам прибавляют по 2 г йодида калия и выделившийся йод титруют раствором тиосульфата натрия (0,1 моль/л) до обесцвечивания раствора. Разность между количеством тиосульфата натрия, пошедшего на титрование испытуемого и контрольного растворов, не должна быть более 0,4 мл. Уксусный ангидрид (ч.д.а.) (СН3СО)2О М.м. 102,09 Бесцветная прозрачная жидкость с резким запахом. В водных растворах быстро гидролизуется, образуя уксусную кислоту. Содержание уксусного ангидрида не менее 99,0%. Температура кипения от 138 до 141 град. С. Плотность от 1,0790 до 1,0820. Хлоридов не более 0,0001%. Сульфатов не более 0,0005%. Тяжелых металлов не более 0,0001%. Нелетучий остаток не более 0,002%. Хлорная кислота, 72% и 57% водные растворы (х.ч.) НСlО4 М.м. 100,46 Бесцветная или со слабым желтоватым оттенком прозрачная жидкость. Плотность около 1,7 и 1,5 соответственно. Хлоридов не более 0,0002%. Сульфатов не более 0,001%. Железа не более 0,00015%. Окислителей не более 0,00025%. Тяжелых металлов не более 0,001%. Около 2,5 г хлорной кислоты (точная навеска) растворяют в мерной колбе вместимостью 100 мл и доводят объем раствора водой до метки. 10 мл полученного раствора разбавляют 100 мл воды и титруют раствором едкого натра (0,1 моль/л) (индикатор - метиловый - оранжевый). 1 мл раствора едкого натра (0,1 моль/л) соответствует 0,01005 г хлорной кислоты. Сохраняют в склянках с притертыми пробками вдали от горючих веществ. Серебра окись (ч.) Аg2О М.м. 231,74 Коричнево - черный тяжелый порошок без запаха. Практически нерастворим в воде, легко растворим в разведенной азотной кислоте и концентрированном растворе аммиака. ЭЛЕКТРОФОРЕЗ Электрофорез - метод анализа, основанный на способности заряженных частиц к передвижению во внешнем электрическом поле. Передвижение частиц при электрофорезе зависит от ряда факторов, основными из которых являются: напряженность электрического поля, величина электрического заряда, скорость и размер частицы, вязкость, рН и температура среды, а также продолжительность электрофореза. При электрофорезе на носителях (твердая среда) на подвижность и эффективность разделения дополнительное влияние оказывают: адсорбция, неоднородность вещества носителя и его ионообменные свойства, электроосмос и капиллярный эффект. Электрофоретическая подвижность является величиной, характерной для данного вещества. Различают абсолютную и относительную электрофоретическую подвижность. Абсолютная электрофоретическая подвижность измеряется в сантиметрах в секунду под влиянием градиента потенциала 1 В на 1 см и выражается в -1с - 1 кв. см х В . Относительная электрофоретическая подвижность есть отношение подвижности исследуемого вещества к подвижности другого вещества, принятого за стандарт. Существуют два различных метода электрофореза: фронтальный электрофорез, который проводят в свободной незакрепленной среде, и зональный электрофорез - в закрепленной среде (стабилизированная жидкость или носители). Они имеют единую аппаратурную схему: источник тока, камеру для электрофореза, два электрода, соединяющих камеру с источником тока, и аппаратуру для сбора и идентификации разделенных веществ. Для электрофореза используют как готовые наборы аппаратуры (универсальный прибор для иммуноэлектрофореза и электрофореза белков на бумаге и крахмале, набор для электрофореза в полиакриламидном геле венгерской фирмы "Реанал"), так и наборы, составляемые экспериментатором из отдельных приборов (универсальный источник питания УИП-1, двухлучевой регистрирующий микрофотометр ИФО-451 и др.). Примерная схема проведения электрофореза: - подготовка среды (носителя); - нанесение веществ, подлежащих разделению; - проведение электрофореза; - обнаружение и количественная оценка разделенных веществ. Фронтальный электрофорез Электрофорез проводят в свободной незакрепленной среде в кювете, которая представляет собой разборный U-образный канал. В кювете создают четкую границу между исследуемой смесью веществ и буферным раствором. В процессе электрофореза первоначальная граница постепенно расходится на ряд границ по числу компонентов смеси. Метод является единственным способом прямого определения абсолютной электрофоретической подвижности. Его применяют для веществ с высокой молекулярной массой, которые обладают слабой диффузией. Зональный электрофорез Зональный электрофорез проводят в закрепленной среде, роль которой состоит в стабилизации электрофоретических зон. В зависимости от среды и способа проведения зональный электрофорез имеет много вариантов. ЭЛЕКТРОФОРЕЗ В СВОБОДНОЙ ЖИДКОСТИ Электрофорез в градиенте плотности. В качестве среды используют жидкость, стабилизированную добавлением глицерина, гликолей или сахарозы, создающих градиент плотности. Этой жидкостью, более тяжелой, чем фракционируемый раствор, заполняют внутреннюю трубку стеклянной охлаждаемой колонки. Дно трубки закрыто пористой стеклянной пластинкой. К обоим концам колонки присоединяют два электродных сосуда и проводят электрофорез. Изоэлектрическое фокусирование. В качестве среды используют жидкость, в которой создают объединенный градиент плотности и рН. Градиент рН достигают прибавлением амфолитов, представляющих собой готовую смесь алифатических полиаминополикарбоновых кислот, или экспериментально подобранных смесей, которые при приложении электрического напряжения концентрируются в узких зонах своих изоэлектрических точек (рI). В результате в колонке создается градиент рН от 1 до 11. При электрофоретическом разделении, например смеси белков, каждый из них перемещается, пока дойдет до зоны, соответствующей его рI. Метод позволяет разделять вещества, различие в рI которых составляет до 0,02, а также определять их рI. В обоих методах полностью исключена адсорбция, что позволяет обнаруживать и количественно оценивать вещества во фракциях непосредственно после электрофореза. ЭЛЕКТРОФОРЕЗ НА КРУПНОПОРИСТЫХ НОСИТЕЛЯХ В качестве крупнопористых носителей применяют фильтровальную бумагу, крахмал, целлюлозу, порошкообразную пластмассу, агар - агар, ацетилцеллюлозу, стеклянный порошок. Электрофорез в блоке. В качестве носителя используют крахмал, который формируют в виде блока, помещают на лоток, соединенный с двумя электродными сосудами, заполненными буферным раствором. Раствор исследуемого препарата замешивают на сухом крахмале и вносят в узкую поперечную траншею, сделанную в середине блока. После прекращения электрофореза блок разрезают на поперечные доли из каждой элюируют и количественно определяют исследуемое вещество. Метод применяется для разделения веществ с молекулярной массой выше 30 000, так как вещества с меньшей молекулярной массой проникают и адсорбируются внутри крахмальных зерен. Электрофорез на колонках. Колонку заполняют суспендированным в буфере носителем. Фракционируемую смесь отрицательно заряженных веществ (что имеет место для большинства биологических материалов) наносят в колонку сверху, а положительно заряженных - снизу. Сбор фракций после электрофореза осуществляют путем последовательного элюирования буферным раствором. Электрофорез на проточных установках. Кювета проточной установки представляет собой полую стенку, которую заполняют носителем. Электрическое поле накладывают в поперечном направлении. В кювете создают равномерный ток буферного раствора сверху вниз. Наверх кюветы в одно и то же место непрерывно подают тонкую струйку фракционируемого раствора. Под совместным влиянием электрического и гравитационного полей исходная смесь по мере спускания разделяется на расходящиеся веером компоненты. Со дна кюветы фракции собирают в серию пробирок. Вариант этого метода на бумаге известен под названием вертикального электрофореза. Электрофорез на бумаге. Вещество, подлежащее фракционированию, наносят на пропитанную проводящей жидкостью полоску фильтровальной бумаги на расстоянии не менее 1 см от края и не менее 2,5 см друг от друга. Бумагу подсушивают, помещают в камеру, концы погружают в кюветы с проводящей жидкостью. После пропитывания бумаги жидкостью к ее концам подключают электрический ток. По окончании электрофореза бумагу подсушивают в токе воздуха и оценивают результаты в соответствии с указаниями в статьях. Для электрофореза пригодны только лучшие сорта хроматографической бумаги, которые должны содержать не менее 96% альфа - целлюлозы. Бумагу предварительно подвергают хроматографической очистке подходящими растворителями. Вместо бумаги могут быть использованы полоски ацетатцеллюлозы. ЭЛЕКТРОФОРЕЗ НА МЕЛКОПОРИСТЫХ НОСИТЕЛЯХ На мелкопористых носителях разделение веществ на зоны идет не только в соответствии с их электрическими зарядами, но и в зависимости от молекулярной массы и формы молекул. Электрофорез в тонком слое проводится в закрепленном толщиной 1-2 мм слое силикагеля, агара, агарозы, крахмала, полиакриламидного геля, сефадекса, целлюлозы, кизельгура, окиси алюминия, алебастра. Проводящую жидкость вводят в слой носителя или ею опрыскивают слой после его формирования. Раствор исследуемого вещества вносят на поверхность слоя или внутрь отверстий, вырезанных в слое. Электрофоретический процесс можно проводить в устройствах, предназначенных для электрофореза на бумаге. Электрофорез в крахмальном геле. Гель готовят из гидролизованного крахмала. Горячий гель заливают в кювету глубиной 5-6 мм, которую закрывают специальной крышкой, устроенной так, что в застывшем геле остается поперечный ряд узких щелей (0,3-0,7 мм). В щели вносят кусочки фильтровальной бумаги, смоченной раствором исследуемого вещества, и проводят одномерный или двухмерный электрофорез в горизонтальных или вертикальных установках. Преимущество горизонтального варианта - простота исполнения, вертикального - большая разрешающая сила. Электрофорез в полиакриламидном геле. Полиакриламидный гель (ПАГ) представляет собой синтетический продукт сополимеризации акриламида и сшивающего агента, чаще всего N, N1-метиленбисакриламида. Благодаря образованию поперечных связей между растущими соседними полиакриламидными цепями, возникающими в результате полимеризации винильных групп, такой гель имеет структуру трехмерной сетки. В отличие от природного полимера крахмала синтетический гель прозрачен, химически стабилен, инертен, устойчив к изменениям рН и температуры, нерастворим в большинстве растворителей и, наконец, в нем практически отстутствуют адсорбция и электроосмос. ПАГ готовят на буфере, в котором растворяют акриламид, сшивку и катализатор. Можно получить гель с концентрацией акриламида от 2 до 50%. Повышение концентрации геля понижает его пористость. Буферная система и состав геля определяются природой разделяемого вещества. Концентрацию (с) акриламида подбирают с учетом средней молекулярной массы (М. м.) фракционируемых веществ: М. м. с, % 3 < 10 х 10 > 30,0 3 10-30 х 10 15,0-30,0 3 30-100 х 10 7,5-15,0 3 > 100 х 10 < 7,5 Электрофорез выполняют в установках вертикального или горизонтального типа. В ходе электрофореза необходимо следить за тем, чтобы кювета не перегревалась во избежание возникновения конвекционных токов. Диск - электрофорез представляет собой разновидность электрофореза в ПАГ. Метод имеет высокую разрешающую способность благодаря использованию двух физических явлений: 1) эффекта концентрирования анализируемой смеси в узкой стартовой зоне (бесконечность 10"ми"), который обусловлен автоматическим выравниванием скоростей движения ионов на границе Кольрауша; 2) эффекта молекулярного сита, т.е. разделения вещества по величине молекулярной массы и по форме молекул. Диск - электрофорез обычно проводят в узких стеклянных трубках, содержащих два разнопористых геля. В ходе электрофореза в верхнем относительно более крупнопористом геле происходит концентрирование смеси, а в нижнем мелкопористом - ее разделение. Верхний и нижний гели готовят на различных буферных растворах, которые в свою очередь отличаются от буфера в электродных сосудах. Схема проведения опыта: стеклянные трубки последовательно заполняют смесью реактивов, из которых вначале полимеризуется мелкопористый, а затем - крупнопористый гель, после чего трубки соединяют с электродными камерами, которые заполняют буферным раствором так, чтобы в него погрузились верхний и нижний концы трубок. Сверху под буфер в трубки вносят исследуемый образец. После электрофореза гель извлекают из трубок, фиксируют и определяют исследуемые вещества. Изотахофорез представляет собой также разновидность электрофореза в ПАГ с использованием прерывистой буферной системы, в которой ведущий ион имеет высокую подвижность, а замыкающий - низкую, что обеспечивает высокую разрешающую способность метода. КОМБИНИРОВАННЫЕ МЕТОДЫ ЗОНАЛЬНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА Иммуноэлектрофорез представляет собой сочетание электрофореза с реакцией преципитации. Сначала проводят электрофорез белков в тонком слое геля. После электрофореза в геле в направлении движения белков делают боковые углубления, которые заполняют соответствующей антисывороткой. Затем пластинки на 1-2 сут помещают во влажные камеры, где в результате диффузии антигены взаимодействуют с антителами и образуют изогнутые зоны преципитации. Метод позволяет выявлять индивидуальные белки. Метод пептидных карт представляет собой сочетание бумажной и тонкослойной хроматографии с высоковольтным электрофорезом. В качестве носителей используют силикагель или порошок целлюлозы. Вначале проводят хроматографию, для чего пробу наносят в точку вблизи одной стороны бумаги или пластинки, а затем под углом 90 град. проводят высоковольтный электрофорез. Метод применяют для разделения смеси низкомолекулярных соединений. МЕТОДЫ ОБНАРУЖЕНИЯ И РЕГИСТРАЦИИ РАЗДЕЛЕННЫХ ВЕЩЕСТВ В зависимости от варианта метода результаты электрофореза оцениваются разными способами: - документирование (фотографирование или зарисовка); - определение величины абсолютной или относительной электрофоретической подвижности; - денситометрия; - определение характерных химических, физико-химических или биологических показателей фракций. Для окраски электрофореграмм наиболее часто применяют следующие красители: для белков - амидошварц 10 В, кумаси, бромфеноловый синий, азокармин В; для липидов и липопротеидов - жировой краситель 0, судан черный; для моносахаридов - водородно - анилино - фталатный реактив; для высших жирных кислот - краситель, состоящий из метилового красного и бромтимолового синего. МЕТОД ФАЗОВОЙ РАСТВОРИМОСТИ Метод фазовой растворимости - это количественное определение чистоты вещества путем точных измерений величины растворимости. Практическое выполнение анализа данным методом заключается в определении величины растворимости исследуемого вещества в растворителе в условиях равновесия при постоянных температуре и давлении. Для этой цели прибавляют возрастающие количества образца к постоянному количеству растворителя, помещенному в одинаковые емкости. Системы, состоящие из вещества и растворителя, приводят в состояние равновесия длительным встряхиванием при постоянной температуре. Затем определяют содержание растворенного вещества в каждой системе. Строят диаграмму (рис. 12) <*>, откладывая по оси ординат массу растворенного вещества на единицу массы растворителя (состав раствора) и по оси абсцисс - массу прибавленного вещества на единицу массы растворителя (состав системы). -------------------------------- <*> Рис. 12. Типичная диаграмма фазовой растворимости. АВ - состав системы, соответствующей ненасыщенным истинным растворам; ВС - состав системы, соответствующей насыщенным растворам; СД - линия растворимости; ДЕ - состав системы, насыщенной всеми компонентами испытуемого вещества. (Рисунок не приводится). При данной температуре в определенном количестве растворителя растворяется определенное количество чистого вещества. Полученный раствор насыщен определенным веществом, но этот же раствор остается ненасыщенным в отношении других веществ, даже если эти вещества могут быть близки по химическому строению и физическим свойствам к данному исследуемому веществу. Равные величины растворимости, полученные в каждой системе, указывают на то, что материал чист или свободен от посторонних веществ. Исключением является случай, когда процентный состав исследуемого вещества равен отношению величин растворимости соответствующих компонентов. Различие в значениях растворимости для каждой системы указывают на наличие примеси или примесей. Метод фазовой растворимости применим ко всем видам соединений, которые образуют устойчивые истинные растворы. Растворители. При выборе подходящего растворителя для метода фазовой растворимости пользуются следующими критериями. 1. Растворитель должен иметь такую летучесть, чтобы его можно было выпарить в условиях вакуума - 1 кгс/кв. см, но не настолько летучим, чтобы в процессе анализа происходили его потери. Обычно подходят растворители с точкой кипения от + 60 до + 150 град. С. 2. Растворитель не должен неблагоприятно влиять на образец. Нельзя использовать растворители, которые вызывают разложение образца или реагируют с ним. Следует избегать растворителей, образующих сольваты или соли, так как при высушивании подобных соединений возможно растрескивание кристаллов и как следствие этого - изменение массы высушенных остатков. 3. Степень чистоты и состав растворителя должны быть известны. Допускаются тщательно приготовленные смешанные растворители. Следовые количества примесей в растворителях могут существенно влиять на растворимость. 4. Оптимальной растворимостью испытуемого вещества в избранном растворителе является растворимость в пределах от 5 до 25 мг на 1 г растворителя. Приборы. Используют термостат, способный поддерживать заданную температуру в пределах +/-0,1 град. С. Для удобства работы обычно выбирают температуру от +25 до +30 град. С. Термостат оборудуют подходящим вибратором, обеспечивающим 100-120 колебаний в секунду и имеющим приспособление с зажимами для ампул. Вместо этого термостат может быть снабжен горизонтальным устройством, способным вращаться со скоростью приблизительно 25 об/мин и имеющим зажимы для ампул. Емкости, используемые в анализе. Используют любые ампулы вместимостью 15 мл. Можно использовать и другие емкости при условии, что они герметичны и подходят во всех других отношениях (рис. 13) <*>. Выпаривание растворителя проводят в колбочках, пригодных для лиофилизации, или в бюксах подходящей емкости. -------------------------------- <*> Рис. 13. Ампула (слева) и колбочки (справа), применяемые при анализе методом фазовой растворимости. (Рисунок не приводится). Весы. Используют весы и метод взвешивания, обеспечивающие точность взвешивания в пределах +/- 10 мкг. Методика. Описанная ниже методика является общепринятой. Однако в некоторых случаях можно предпочесть и другие условия (объем растворителя и т. д.). Состав системы. Точно взвешивают не менее 7 помеченных, тщательно вымытых ампул и в каждой из них точно взвешивают постоянно увеличиваемые количества исследуемого вещества. Массу вещества подбирают таким образом, чтобы первая ампула содержала немного меньше вещества, чем будет растворяться в объеме выбранного растворителя, обычно в 5 мл, а вторая и последующие ампулы - несколько больше, чем указанная величина растворимости. В каждую из ампул пипеткой вносят 5 мл растворителя, охлаждают в смеси сухой лед - ацетон, если это необходимо, и запаивают с помощью двухструйной газовой горелки. Принимают меры предосторожности, чтобы сохранить все кусочки стекла. Дают ампулам вместе с их содержимым остыть до комнатной температуры и взвешивают отдельно каждую ампулу вместе с относящимися к ней кусочками стекла. Рассчитывают состав системы в миллиграммах вещества на грамм растворителя для каждой ампулы по формуле: 1000(W2 - W1) / (W3 - W2), где W1 - масса пустой ампулы; W2 - масса ампулы с исследуемым веществом; W3 - масса ампулы с исследуемым веществом, растворителем и кусочками стекла. Равновесие. Время, необходимое для достижения состояния равновесия, зависит от вещества, метода перемешивания (вибрация или вращение) и температуры. Обычно с помощью вибрационного метода равновесие устанавливается быстрее (2-7 сут), чем с помощью ротационного метода (7-14 сут). Убедиться в том, что состояние равновесия достигнуто, можно следующим образом. В одной из ампул - предпоследней в этой серии - получают пересыщенный раствор нагреванием при температуре на 10 град. С выше, чем температура термостата, принимая меры предосторожности, чтобы твердое вещество в ампуле не растворилось полностью. После этого с "пересыщенной" ампулой поступают так же, как с другими. Если величина растворимости, полученная для этой ампулы, будет находиться на одной прямой с другими величинами на графике, то это указывает на то, что состояние равновесия достигнуто. Однако, если величина растворимости из "пересыщенной" ампулы окажется вне прямой, на которой лежат другие значения растворимости, это не обязательно означает, что в других ампулах не достигнуто равновесие, так как в ряде случаев это может быть обусловлено тенденцией определенных веществ образовывать пересыщенные растворы. Для достижения состояния равновесия в таких случаях проводят ряд определений методом фазовой растворимости, подбирая различные отрезки времени для достижения состояния равновесия: таким образом можно убедиться, что получены постоянные величины наклона кривой растворимости. Состав раствора. После достижения состояния равновесия ампулы помещают вертикально в стойку в термостат и дают нерастворившемуся веществу осесть. Соблюдая все меры предосторожности для уменьшения потерь растворителя за счет испарения, открывают ампулы и берут пипеткой 2 мл из каждой ампулы. На кончик пипетки необходимо поместить комочек ваты или другого подходящего материала, служащего фильтром. Удаляют вату, переносят прозрачный раствор из каждой ампулы в помеченную, предварительно взвешенную колбочку или бюкс и взвешивают каждую емкость вместе с раствором: таким образом, получают массу раствора. Охлаждают колбочки в смеси сухой лед - ацетон и затем выпаривают растворитель в вакууме. Постепенно увеличивают температуру вакуум - сушильного шкафа до 50-80 град. С, высушивают остаток до постоянной массы. Рассчитывают состав раствора в миллиграммах вещества на грамм растворителя по формуле: 1000(F3 - F1) / (F2 - F3), где F1 - масса колбочки; F2 - масса колбочки вместе с раствором; F3 - масса колбочки с остатком. Расчет. Для каждой части взятого исследуемого вещества на оси абсцисс откладывают состав системы и по оси ординат - состав раствора. Как показано на рис. 12, точки для тех ампул, в которых получены ненасыщенные истинные растворы, должны приближаться к прямой линии (АВ) с наклоном 1, проходящей через начало координат; точки, соответствующие насыщенным растворам, должны приближаться к другой прямой линии (ВС) с наклоном, который отражает содержание суммы примесей в исследуемом веществе. Если точки не приближаются к прямой линии, это означает, что состояние равновесия достигнуто не было, хотя это может быть также обусловлено образованием твердого раствора. Процентное содержание примесей в исследуемом веществе рассчитывают по формуле: 100 - 100 х S. Наклон (S) рассчитывают по уравнению: S = (Y2 - Y1) / (Х2 - Х1), где Y2 и Y1 - составы растворов, Х2 и Х1 - составы систем, соответствующие точкам, взятым на второй прямой линии ВС. Кроме того, суммарное содержание примеси может быть вычислено статистически, например методом наименьших квадратов. Значение растворимости основного компонента получают продлением линии растворимости ВС до оси Y. Точка пересечения на оси Y дает величину экстраполированной растворимости в миллиграммах на грамм и должна быть постоянной для данного вещества. В идеальных условиях число примесей в исследуемом веществе соответствует числу изломов кривой растворимости выше точки насыщения (В), и значения растворимости соответствующих компонентов могут быть получены продлением соответствующих линий растворимости до пересечения с осью Y и вычитанием из общей величины растворимости соответствующих величин растворимости компонентов. Между точками Д и Е на диаграмме раствор насыщен всеми компонентами испытуемого вещества и его состав остается постоянным. Метод фазовой растворимости рекомендуется использовать для оценки качества стандартных образцов и серийных субстанций стероидных соединений, тетрациклинов, цефалоспоринов и некоторых пенициллинов. ПОЛЯРОГРАФИЯ Полярография - электрохимический метод анализа, основанный на измерении силы тока, возникающего при электролизе раствора анализируемого вещества на микроэлектроде. При помощи полярографического метода обычно изучаются вещества, способные к электровосстановлению, реже - вещества, окисляющиеся при электролизе. Обычная область концентраций -2 -4 анализируемых веществ составляет 10 - 10 моль/л. Электролиз проводят в полярографической ячейке, состоящей из сосуда - электролизера и двух электродов. Микроэлектродом является ртуть, вытекающая каплями из тонкого стеклянного капилляра (ртутный капающий электрод), макроэлектродом служит либо слой ртути на дне электролизера, либо внешний стандартный электрод, чаще всего насыщенный каломельный электрод. Обыкновенно микроэлектрод функционирует в качестве катода, на котором происходит электрохимическое восстановление анализируемого вещества. При подаче на электроды постепенно возрастающего напряжения вначале через электролизер протекает очень слабый ток, называемый остаточным, который линейно зависит от величины приложенного напряжения. Когда достигается потенциал выделения, характерный для данного электроактивного вещества - деполяризатора, начинается электролиз и сила тока резко возрастает, при этом средняя концентрация деполяризатора у поверхности ртутного капающего электрода уменьшается, а скорость диффузии соответственно возрастает. При дальнейшем увеличении напряжения концентрация деполяризатора у поверхности электрода становится настолько малой по сравнению с концентрацией в основной части раствора, что разность концентраций по величине приближается к концентрации анализируемого вещества в растворе. При этом через систему будет протекать максимально возможный ток, который называют предельным диффузионным током. В результате на графике зависимости силы тока от напряжения появляется так называемая полярографическая волна (рис. 14) <*>. -------------------------------- <*> Рис. 14. Вольтамперная кривая (полярографическая волна). 1 - предельный диффузионный ток; 2 - ток разряда полярографического фона; 3 - потенциал полуволны; 4 - потенциал выделения; 5 - остаточный ток. На оси ординат - величина среднего диффузного тока (мкА); на оси абсцисс - прилагаемое напряжение в вольтах. (Рисунок не приводится). Величина диффузионного тока выражается уравнением Ильковича: 1/2 2/3 1/6 i = 607ncD m t , d где i - величина среднего диффузионного тока в микроамперах d (мкА); n - число электронов, расходуемых на электрохимическое превращение одной молекулы деполяризатора; с - концентрация определяемого вещества (ммоль/л); D - коэффициент диффузии деполяризатора (кв.см/с); m - масса ртути, вытекающей в секунду из капилляра (мг/с); t - период капания капающего электрода (с). Уравнение Ильковича отражает линейную зависимость величины предельного диффузионного тока от концентрации вещества в растворе, а также указывает на зависимость диффузионного тока от характеристики применяемого в эксперименте капающего электрода 2/3 1/6 1/2 (m t ) и характера электроактивных частиц (nD ). В водных растворах в интервале температур от 20 до 50 град. С коэффициенты диффузии с повышением температуры возрастают приблизительно на 3% на градус, а значения i на 1-2% на градус повышения температуры, d поэтому температуру полярографической ячейки следует соблюдать с точностью до +/-0,5 град. С при стандартной температуре 25 град. С. Величины m и t зависят от параметров ртутного капающего электрода и высоты столба ртути. Ртутный капающий электрод представляет собой стеклянный капилляр с внешним диаметром 3-7 мм и внутренним 0,03-0,05 мм, длина капилляра 7-15 см. Высота ртутного столба (расстояние от конца капилляра до поверхности ртути в резервуаре) должна составлять 40-80 см. Количество электричества, проходящее через испытуемый раствор за время регистрации полярограммы, очень мало, поэтому изменение концентрации деполяризатора в исследуемом растворе ничтожно, что позволяет многократно регистрировать полярограммы. Для создания достаточной электропроводности к испытуемому раствору прибавляют избыток (в 50-100 раз) индифферентного электролита, так называемого полярографического фона, т. е. соли, ионы которой не принимают участия в электродной реакции, но участвуют в переносе электрических зарядов через раствор. Ток разряда электролита фона не должен мешать наблюдению тока восстановления или окисления анализируемого вещества. Полярографический анализ может быть проведен как в водной среде, так и в смешанной водно - органической (водно - спиртовой, водно - ацетоновой, водно - диметилформамидной и др.) или неводных средах (спирт, ацетон, диметилформамид, диметилсульфоксид и т.д.). Потенциал полуволны E 1/2 (см. рис. 14) характеризует природу электроактивного вещества. E 1/2 сильно зависит от состава и рН раствора, но обычно мало зависит от концентрации диполяризатора и характеристики капилляра, вследствие чего он может служить критерием при качественной идентификации определяемого вещества. Количественный полярографический анализ основан на измерении предельного диффузионного тока определяемого вещества (высоты волны). Высота волны определяется графически либо проведением касательных по способу, представленному на рис. 15, а, <*> либо вычитанием остаточного тока фона (полярографируемого раствора, содержащего все реактивы в той же концентрации, в какой они содержатся в испытуемом растворе, но без определяемого вещества) в соответствии с рис. 15, б <*>. ------------------------------- <*> Рис. 15. Способы измерения высоты полярографической волны. а - определение проведением касательных; б - определение вычитанием остаточного тока фона; 1 - полярограмма раствора определяемого вещества; 2 - полярограмма раствора фона. (Рисунок не приводится). Второй способ пригоден в случае, если полярограмма имеет недостаточно четко выраженную площадку предельного диффузионного тока, к тому же позволяет проверить чистоту реактивов, используемых для приготовления исследуемого раствора. Методика определения. Для аналитических целей обычно применяются электроды с величиной t = 2 - 3 c, m = 1 - 2 мг/с или электроды с принудительным отрывом капли, имеющие t = 0,2 - 0,5 с при тех же величинах m. Испытуемый раствор, приготовленный, как указано в соответствующей частной статье, помещают в полярографическую ячейку и снимают полярограмму. Перед снятием полярограммы для удаления растворенного кислорода из полярографируемого раствора через него пропускают инертный газ (аргон, очищенный азот) в течение 5-20 мин в зависимости от применяемого растворителя. В отдельных случаях кислород связывают химически (сульфитом натрия, метолом). Для предотвращения потерь растворителя за счет испарения инертный газ следует предварительно пропускать через раствор фона. Для определения концентрации исследуемого вещества пользуются следующими методами. Метод калибровочных кривых. Готовят ряд растворов с различной концентрацией стандартного образца, снимают их полярограммы и определяют высоты волн. По полученным данным строят калибровочный график, откладывая по оси абсцисс величины концентраций, а по оси ординат соответствующие значения диффузионного тока (высоты волн). Калибровочный график обычно представляет собой прямую линию, проходящую через начало координат. Затем снимают полярограмму испытуемого раствора и, пользуясь калибровочным графиком, находят искомую концентрацию. Метод целесообразно применять при анализе большого количества серийных растворов. Этот метод наиболее точен. Метод стандартных растворов. В случае анализа отдельных проб пользуются более простым методом стандартных растворов, заключающимся в том, что сначала полярографируют испытуемый раствор, а затем в тех же условиях 2-3 стандартных раствора, содержащих определяемое вещество в известной концентрации. Концентрация стандартных растворов подбирается с таким расчетом, чтобы полученная высота волны была примерно равна высоте волны неизвестного раствора. Сопоставляя высоту волн стандартных растворов (Нст) с высотой волны испытуемого раствора (Нх), концентрацию вещества в испытуемом растворе (с ) рассчитывают по формуле: х с х Нх ст с = ----------, х Нст где с - концентрация раствора стандартного образца. ст Метод добавок. Снимают полярограмму испытуемого раствора, затем к нему прибавляют раствор с известной концентрацией определяемого вещества и снимают вторую полярограмму. Для обеспечения большей точности определения стандартный раствор добавляют в таком количестве, чтобы высота волны получалась примерно вдвое больше первоначальной. Концентрацию вещества в испытуемом растворе (с ) расчитывают х по формуле: с ст с = -----------------------, х Vх + Vст Нст Vх -------- х ---- - ---- Vст Нх Vст где с - концентрация раствора добавляемого стандартного ст образца; Нх - высота волны испытуемого раствора; Нст - высота волны, полученная после прибавления стандартного раствора; Vх - объем испытуемого раствора; Vст - объем прибавленного стандартного раствора. Метод имеет особое значение при анализе растворов, в которых неизвестно точное содержание присутствующих в нем посторонних веществ. Относительная ошибка воспроизводимости полярографического метода составляет 2-5%. Примечание. Пары ртути ядовиты. Работу проводят в хорошо проветриваемом помещении. Полярографическую ячейку устанавливают в вытяжном шкафу. Пролитую ртуть немедленно собирают. Стеклянную посуду, загрязненную мельчайшими каплями ртути, моют концентрированной азотной кислотой. |