|
ГФ №11, том 1. Общие методы анализа редакционная коллегия государственной фармакопеи СССР
предпочтительнее пользоваться наиболее воспроизводимыми методами
упаривания раствора при перемешивании в фарфоровой чашке или
удаления растворителя в ротационном вакуумном испарителе.
Для обеспечения высокой эффективности разделения применяют
капиллярную газовую хроматографию, в которой неподвижная жидкая
фаза нанесена в виде тонкой пленки непосредственно на внутреннюю
поверхность капилляра. Длина капиллярных колонок обычно составляет
от 10 до 100 м, внутренний диаметр - от 0,1 до 0,6 мм.
Автоматическая система измерения, регистрации и обработки
хроматографической информации включает в себя детектор,
электронные устройства усиления, самопишущий измерительный прибор
и интегратор.
Наиболее часто применяют детектор по теплопроводности и
пламенно - ионизационный. Действие детектора по теплопроводности
основано на изменении теплопроводности газа - носителя в
присутствии других веществ. Он характеризуется большой
универсальностью, так как чувствителен практически ко всем летучим
органическим соединениям. Действие более чувствительного пламенно
- ионизационного детектора основано на измерении тока насыщения
ионизированной газовой смеси в зависимости от ее состава. Детектор
чувствителен к органическим соединениям и нечувствителен к парам
воды. Кроме этих двух детекторов, в газохроматографическом анализе
лекарственных веществ, особенно если требуется повышенная
чувствительность определения, можно использовать селективные
детекторы, такие, как термоионный и электронозахватный.
Системы термостатирования и контроля температуры колонок,
детектора, узла ввода пробы предназначены для обеспечения
необходимых температурных режимов анализа.
Качественный анализ. Наиболее часто используемыми методами
качественного анализа, применяемыми для идентификации
лекарственных веществ, являются метод веществ - свидетелей и метод
относительных удерживаний.
Метод веществ - свидетелей заключается в том, что
непосредственно после анализа исследуемого образца в идентичных
условиях проводят хроматографирование веществ, присутствие которых
в исследуемой пробе вероятно. Совпадение времен удерживания любого
из компонентов анализируемой пробы и вещества - свидетеля может
служить доказательством идентичности обоих веществ. Можно ввести
вещество - свидетель прямо в анализируемый образец. В этом случае
критерием идентичности служит увеличение соответствующего пика на
хроматограмме. Поскольку соединения различной структуры могут
иметь совпадающие времена удерживания (удерживаемые объемы), для
большей достоверности проводимой идентификации хроматограммы
анализируемого образца и веществ - свидетелей должны быть сняты
минимум на двух колонках с неподвижными жидкими фазами,
отличающимися по полярности.
Для идентификации веществ по методу относительных удерживаний
проводят анализ образца в условиях, указанных в конкретной
методике, причем предварительно к пробе прибавляют определенное
количество указанного в методике вещества сравнения. Относительное
удерживание (ч) определяется по формуле:
t - t
R 0
ч = ------------,
t - t
Rср 0
где t - время газохроматографического удерживания
R
анализируемого вещества; t - время удерживания веществ сравнения;
Rср
t - время удерживания несорбирующегося вещества.
0
Количественный анализ. Количественный анализ проводят с учетом
измерения параметров пиков веществ на хроматограммах. Практически
используют два параметра пиков: площадь или высоту. Наиболее часто
применяемым параметром является площадь пика.
Площади пиков на хроматограмме определяют одним из следующих
способов: умножением высоты пика (h) на его ширину ("ми "),
0,5
измеренную на половине его высоты; планиметрированием; с помощью
интегратора. В связи с тем что, чувствительность детекторов по
отношению к разделяемым веществам, как правило, неодинакова, в
необходимых случаях количественному определению предшествует
градуировка прибора.
Существует три основных метода количественного анализа: метод
абсолютной градуировки, метод внутренней нормализации и метод
внутреннего стандарта.
Метод абсолютной градуировки основан на предварительном
определении зависимости между количеством введенного вещества и
площадью или высотой пика на хроматограммах. В хроматограф вводят
известное количество градуировочной смеси и определяют площади или
высоты полученных пиков. Строят график зависимости площади или
высоты пика от количества введенного вещества. Анализируют
исследуемый образец, измеряют площадь или высоту пика
определяемого компонента и на основании градуировочного графика
рассчитывают его количество.
Метод внутренней нормализации основан на приведении к 100%
суммы площадей пиков на хроматограмме.
Метод внутреннего стандарта основан на сравнении выбранного
определяющего параметра пика анализируемого вещества с тем же
параметром вещества для сравнения, введенного в пробу в известном
количестве. В исследуемую пробу вводят известное количество такого
вещества для сравнения, пик которого достаточно хорошо разделяется
с компонентами исследуемой смеси. Проводят анализ пробы с
веществом сравнения и рассчитывают количество определяемого
вещества.
Последние два метода требуют введения поправочных
коэффициентов, характеризующих чувствительность используемых типов
детекторов к анализируемым веществам. Для разных типов детекторов
и разных веществ коэффициент чувствительности определяется
экспериментально.
УСЛОВИЯ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО АНАЛИЗА
В методике рекомендуется приводить следующие условия анализа:
размеры газохроматографической колонки; тип неподвижной жидкости
фазы и ее количество; тип твердого носителя; температуры колонки,
испарителя и детектора; газ - носитель и его расход; тип
детектора.
В случае необходимости в частных статьях могут быть приведены
дополнительные условия проведения хроматографического анализа.
Высокоэффективная жидкостная хроматография
(жидкостная хроматография высокого давления)
Высокоэффективная жидкостная хроматография (жидкостная
хроматография высокого давления) является вариантом колоночной
жидкостной хроматографии, в которой подвижная фаза - элюент -
проходит через заполняющий колонку сорбент с большей скоростью за
счет значительного давления на входе в хроматографическую колонку.
Высокоэффективная жидкостная хроматография является удобным
способом разделения, препаративного выделения и проведения
количественного и качественного анализа нелетучих термолабильных
соединений как с малой, так и с большой молекулярной массой.
Основными узлами современного жидкостного хроматографа
являются: насос высокого давления, дозатор, высокоэффективная
колонка, детектор с регистрирующим устройством.
Современные жидкостные хроматографы могут быть снабжены
микропроцессором и устройствами, с помощью которых можно
автоматически производить ввод пробы, поддерживать условие
хроматографического процесса по заданной программе, автоматически
оптимизировать условия разделения, проводить расчет
количественного состава анализируемой смеси по одной или
нескольким программам и проводить качественный анализ.
Насос высокого давления (до 200-500 атм) обеспечивает подачу
элюента в колонку с заданной постоянной скоростью. В некоторых
микроколоночных хроматографах применяются насосы сравнительно
низкого давления (до 10-20 атм).
Хроматографические колонки из нержавеющей стали (или из
стекла) длиной 10-25 см с внутренним диаметром 0,3-0,8 см (чаще
0,4-0,5 см) заполняются адсорбентом с диаметром частиц 5-10 мкм
сферической или неправильной формы с помощью суспензионного
метода, что дает возможность получить более равномерную и плотную
упаковку частиц сорбента в колонке. Заполнение колонки проводится
при больших давлениях, чем рабочее давление в хроматографе. В
микроколоночных хроматографах используются колонки меньшей длины и
меньшего внутреннего диаметра (0,1-0,2 см и меньше).
Частицы адсорбента не должны разрушаться при заполнении
колонки под большим давлением.
Плотная упаковка частиц адсорбента малого диаметра (5-10 мкм)
в колонке позволяет получить высокоэффективное хроматографическое
разделение компонентов смеси. Температура хроматографических
колонок может поддерживаться с точностью +/-0,1 град.С в
интервале, ограниченном температурой замерзания и кипения элюента.
Чаще всего разделение проводят в интервале температур 20-50
град.С.
В качестве детекторов в жидкостной хроматографии обычно
используют спектрофотометрический детектор с переменной (190-900
нм) или фиксированной (чаще при 254 нм) длиной волны,
рефрактометрический или флуориметрический детекторы. Могут быть
использованы и другие детекторы, например ионизационно -
пламенный, электрохимические, масс - спектрометрический и т. д.
В качестве адсорбентов чаще всего применяют силикагель с
гидроксилированной поверхностью и силикагель с привитыми к
поверхности различными функциональными группами, реже используются
окись алюминия и полимерные адсорбенты. На практике обычно
применяют готовые колонки.
При работе с колонками, заполненными силикагелем, в качестве
элюента используют углеводороды, иногда с добавлением небольшого
количества спирта или других растворителей. В обращеннофазной
хроматографии применяют колонки, заполненные силикагелем с
привитыми гидрофобными группами, и в качестве элюента - водные
растворы, содержащие низшие спирты или ацетонитрил. Во многих
случаях не требуется дополнительная очистка растворителей, но
иногда тщательная очистка растворителей необходима.
Для разделения органических соединений в виде солей, а также
кислот и оснований применяют ион - парную хроматографию. В этом
случае применяют адсорбенты с привитыми гидрофобными группами, а в
элюент, обычно водно - спиртовой или водно - ацетонитрильный,
добавляют ионные соединения, анион или катион которых содержит
гидрофобную группу.
Для разделения органических катионов или анионов применяют
ионнообменную жидкостную хроматографию. В этом случае разделение
проводят на адсорбентах с сульфо- или карбоксильными группами и
замещенными или незамещенными аминогруппами различной основности,
а в качестве элюента - водные буферные растворы с соответствующими
рН и ионной силой.
Для разделения веществ, способных образовывать комплексы с
катионами металлов, в частности для разделения оптических изомеров
аминокислот, используют лигандообменную хроматографию, в которой
разделение основано на различии в способности анализируемых
веществ образовывать координационные связи в координационной сфере
присутствующего в системе комплексообразующего иона металла. В
этом случае применяют адсорбенты, на поверхности которых имеются
группы, способные образовывать комплексы с ионами металлов и
разделяемым веществом.
Для характеристики и разделения высокомолекулярных соединений
3
(молекулярная масса выше 10 ) применяют эксклюзионную (ситовую)
хроматографию, которая обеспечивает разделение веществ в
соответствии с размерами их молекул. В качестве адсорбентов
используют гидроксилированные силикагели с различным диаметром пор
или аналогичные силикагели с привитыми диольными и другими
группами, а также различные гели.
Степень разделения веществ в колонке определяется расстоянием
между максимумами двух соседних пиков и шириной хроматографической
полосы. Расстояние между максимумами зависит от селективности
адсорбента по отношению к разделяемым веществам, а ширина полосы -
от эффективности колонки, которая определяется характером упаковки
частиц адсорбента, вязкостью элюента, размыванием в соединительных
узлах и детекторе. Высокоэффективная колонка способна разделять
вещества и при малой селективности адсорбента.
Для определения содержания каждого компонента в смеси
необходимо провести количественную оценку хроматограммы с
использованием методов абсолютной калибровки или внутреннего
стандарта (см. раздел "Газовая хроматография").
Если примеси близки по строению, то качественно их содержание
можно оценить по соотношению пиков на хроматограмме. Однако если
чувствительность детектора по отношению к примесям разная, то
такую оценку делать нельзя.
Метод жидкостной хроматографии обеспечивает достоверные данные
по содержанию интересующего компонента в смеси. Время выхода
компонента из колонки при одних и тех же условиях разделения будет
всегда постоянно и может служить характеристикой данного
компонента (качественный анализ), а площадь пика - пропорциональна
количеству данного компонента в пробе (количественный анализ).
ОПРЕДЕЛЕНИЕ рН
Водородным показателем (рН) называется отрицательный
десятичный логарифм активности ионов водорода.
рН = - lg а +.
Н
Измерение рН заключается в сравнении потенциала индикаторного
электрода, погруженного в испытуемый раствор, с потенциалом того
же электрода в стандартном буферном растворе с известным значением
рН.
При калибровке рН-метров пользуются шкалой стандартных
буферных растворов.
Таблица 1
Љ”””’”””””””””””””””””””””’”””””””””””””””””””””””””””””””””””’””””””””Ї
Ј N Ј Ј рН раствора при температуре Ј Ј
Јп/пЈ Наименование “”””””’”””””’”””””’”””””’”””””’”””””¤БуфернаяЈ
Ј Ј раствора Ј 0 Ј 10 Ј 20 Ј 25 Ј 30 Ј 40 Јемкость Ј
Ј Ј Јград.Јград.Јград.Јград.Јград.Јград.Ј Ј
Ј Ј Ј С Ј С Ј С Ј С Ј С Ј С Ј Ј
“”””•”””””””””””””””””””””•”””””•”””””•”””””•”””””•”””””•”””””•””””””””¤
Ј 1 ЈТетраоксалат калия,Ј1,67 Ј1,67 Ј1,68 Ј1,68 Ј1,69 Ј1,70 Ј0,070 Ј
Ј Ј0,05 моль/л Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј
Ј 2 ЈГидротартрат калия,Ј - Ј - Ј - Ј3,56 Ј3,55 Ј3,54 Ј0,027 Ј
Ј Јнасыщенный при 25Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј
Ј Јград.С Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј
Ј 3 ЈГидрофталат калия,Ј4,01 Ј4,00 Ј4,00 Ј4,01 Ј4,01 Ј4,03 Ј0,016 Ј
Ј Ј0,05 моль/л Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј
Ј 4 ЈОднозамещенный фосфатЈ6,98 Ј6,92 Ј6,88 Ј6,86 Ј6,84 Ј6,84 Ј0,029 Ј
Ј Јкалия + двузамещенныйЈ Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј
Ј Јфосфат натрия поЈ Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј
Ј Ј0,025 моль/л Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј
Ј 5 ЈБура, 0,01 моль/л Ј9,46 Ј9,33 Ј9,22 Ј9,18 Ј9,14 Ј9,07 Ј0,020 Ј
Ј 6 ЈГидроокись кальция,Ј - Ј - Ј - Ј12,45Ј12,30Ј11,99Ј0,09 Ј
Ј Јнасыщенный при 25Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј
Ј Јград.С Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј
ђ”””‘”””””””””””””””””””””‘”””””‘”””””‘”””””‘”””””‘”””””‘”””””‘””””””””‰
В табл. 1 приведены растворы веществ, применяемые в качестве
стандартных буферных растворов для проверки рН-метров и
зависимость их рН от температуры. Для приготовления таких
растворов могут быть использованы фиксаналы по ГОСТ 8-135-74.
Примечания. 1. Буферной емкостью ("бета") называют выраженное
в грамм - эквивалентах количество сильного основания (B),
прибавление которого к 1 л буферного раствора вызывает возрастание
величины рН этого раствора на единицу
Љ dB "ДЕЛЬТА"B Ї
Ј "бета" = ----
= ------------Ј .
ђ dрН "ДЕЛЬТА"рН ‰
2. Дистиллированная вода, применяемая для приготовления
буферных растворов, а также для приготовления контролируемых
растворов, должна иметь рН 5,8-7,0. Дистиллированная вода должна
быть освобождена от углекислого газа, для чего ее необходимо
прокипятить перед употреблением. Если рН дистиллированной воды
после кипячения не соответствует указанным пределам, то необходима
дополнительная очистка, например с помощью ионообменных колонок.
Потенциометрический метод измерения рН. Потенциометрическое
определение рН заключается в измерении ЭДС элемента, состоящего из
двух электродов: индикаторного, потенциал которого зависит от
активности ионов водорода, и электрода сравнения - стандартного
электрода с известной величиной потенциала.
В качестве индикаторных электродов для измерения рН на
практике применяют стеклянный и хингидронный электроды. В
отдельных случаях в качестве индикаторного электрода можно
использовать водородный электрод.
Для измерения рН применяют высокоомные потенциометры различных
|
|
|
Скачать 2.11 Mb.