ГФ №11, том 1. Общие методы анализа редакционная коллегия государственной фармакопеи СССР
 Скачать 2.11 Mb.
|
|
глубиной 2,5 см. Камеру закрывают и оставляют для насыщения на 24 ч при постоянной температуре. В отдельных случаях, при использовании достаточно летучих растворителей, это время может быть сокращено. Растворы веществ наносят на линию старта микропипеткой или микрошприцем так, чтобы расстояние между точками нанесения отдельных проб было не менее 3 см. Если минимально необходимое для проведения хроматографирования количество анализируемого раствора может образовывать на бумаге пятно, превышающее в диаметре 10 мм, нанесение проводят в несколько приемов, предотвращая путем подсушивания чрезмерное растекание пятна на линии старта. После нанесения растворов анализируемых веществ и высыхания образовавшихся при этом пятен полосу бумаги закрепляют в рабочем положении в камере и оставляют на 1,5 ч. В рабочем положении полоса хроматографической бумаги должна висеть вертикально так, чтобы между ее верхним концом, погруженным в лодочку, и линией старта был лишь один, по возможности плавный, перегиб. По окончании выдержки начинают хроматографирование, для чего в лодочку вливают подвижную фазу. Хроматографирование обычно заканчивают при приближении фронта подвижной фазы к нижнему концу полосы бумаги. Если в частной статье нет специальных указаний, полосу вынимают из камеры и высушивают на воздухе, отметив графитовым карандашом конечное положение подвижной фазы. Пятна открывают как указано в частной статье. Восходящая хроматография Для проведения восходящей хроматографии на бумаге используют камеры, в которых сосуд (лодочка) с подвижной фазой располагается в нижней части или на дне. Полоса хроматографической бумаги закрепляется в верхней части камеры так, чтобы обеспечить возможность погружения нижнего конца полосы в лодочку с подвижной фазой. В рабочем положении полосы линия старта должна отстоять от поверхности подвижной фазы на 2-3 см. В остальном приемы работы при проведении восходящей хроматографии на бумаге не отличаются от описанных выше. Обработка хроматограмм По окончании хроматографирования пятна веществ на хроматограммах открывают при просмотре в видимом или ультрафиолетовом свете. При необходимости хроматограмму предварительно обрабатывают (погружением или опрыскиванием) раствором реактива, дающего цветные реакции с хроматографируемыми веществами. В отдельных случаях пятна обнаруживают путем установления факта угнетения или стимулирования роста бактерий в непосредственной близости от пятна при помещении хроматограммы на инокулированную среду. Для обнаруженных пятен вычисляют величину Rf по уравнению: а Rf = ---, b где а - расстояние от линии старта до центра пятна; b - расстояние от линии старта до фронта подвижной фазы. ХРОМАТОГРАФИЯ В ТОНКОМ СЛОЕ СОРБЕНТА Хроматографический процесс, протекающий при движении подвижной фазы в тонком слое сорбента (носителя), нанесенном на инертную поверхность, называется хроматографией в тонком слое сорбента. Неподвижной фазой в данном случае являются сам твердый сорбент либо вещества, предварительно на него нанесенные. Механизм хроматографического разделения может быть различным, но чаще всего он является адсорбционным. Перемещение подвижной фазы в слое сорбента с целью упрощения аппаратурного оформления процесса хроматографирования, как правило, осуществляется восходящим методом, т.е. под действием капиллярных сил. По сравнению с хроматографией на бумаге хроматография в тонком слое сорбента имеет ряд преимуществ, основными из которых являются: высокая скорость процесса хроматографирования, возможность использования в качестве неподвижных фаз (носителей) разнообразных сорбентов, а также сильнокислых, щелочных или иных взаимодействующих с бумагой подвижных фаз и жестких методов открытия пятен путем обработки хроматограмм агрессивными веществами при повышенных температурах. Для хроматографирования могут использоваться готовые пластинки с закрепленным слоем сорбента, выпускаемые промышленностью, и пластинки со специально приготовленным тонким слоем сорбента. Приготовление пластинок с тонким слоем сорбента Обычно слой сорбента (чаще всего силикагеля или окиси алюминия квалификации "для хроматографии") с размером частиц 150-200 меш (сито N 61; ГОСТ 4403-67) наносят на стеклянные матовые пластинки подходящего размера. Для закрепления слоя применяют добавки сульфата кальция СаSО4 х 1/2H2О (гипса) или крахмала. Нанесение слоя может осуществляться следующими способами. Способ 1. Для получения закрепленного слоя сорбента толщиной около 200-300 мкм с площадью 100 кв. см 2 г силикагеля или окиси алюминия (150-200 меш) и 0,1 г гипса растирают с 5 мл воды в фарфоровой ступке до образования однородной жидкой массы, которую немедленно выливают на горизонтально расположенные, тщательно вымытые стеклянные пластинки выбранного размера. Массу разравнивают шпателем и полученный таким образом слой сушат при комнатной температуре, предохраняя от возможных механических и химических загрязнений. Если в частной статье не указано иначе, пластинки активируют в сушильном шкафу при 120 град. С в течение 1 ч. Готовые пластинки с тонким слоем сорбента хранят в эксикаторе над силикагелем или хлоридом кальция. Примечание. Для получения слоя толщиной около 100-150 мкм нанесение указанного выше количества массы проводят на пластинки с общей площадью 200 кв. см. Способ 2. Для получения закрепленного слоя сорбента толщиной в несколько десятков микрон 2-3 г гипса растирают в ступке в 40 мл метилового спирта. В суспензию гипса, продолжая растирание, добавляют 40 г силикагеля или окиси алюминия (200-400 меш) и 140 мл хлороформа. Полученную суспензию сорбента из расчета 4,5 мл на 100 кв. см поверхности выливают на тщательно вымытые сухие стеклянные пластинки, расположенные горизонтально. Пластинки, если в частной статье не указано иначе, сушат на воздухе в течение 10-15 мин. Суспензии сорбентов сохраняют в колбах с притертой пробкой, тщательно взбалтывая перед употреблением. Способ 3. Для приготовления незакрепленного слоя сорбента последний насыпают на горизонтально расположенное матовое стекло и разравнивают до получения слоя толщиной 1-2 мм валиком из нержавеющей стали диаметром 6-8 мм с цилиндрическими утолщениями на обоих концах. Диаметр утолщения должен превышать на 2-4 мм диаметр валика (соответственно предполагаемой толщине слоя). Длина средней части валика должна быть на 20-30 мм меньше ширины стекла, на которое наносится слой сорбента. Вместо металлического валика можно использовать стеклянную палочку с надетыми на концы кусками резиновой или полиэтиленовой трубки, имеющей подходящую толщину стенки и диаметр. Методика хроматографического разделения Для разделения веществ методом хроматографии в тонком слое сорбента используют хроматографические камеры подходящего размера. На дно камеры наливают подвижную фазу в количестве, достаточном для образования слоя глубиной 0,5 см, камеру закрывают и выдерживают для насыщения парами растворителей 30-60 мин. Стенки камеры для полноты насыщения можно обкладывать фильтровальной бумагой. Анализируемый раствор наносят микропипеткой или микрошприцем на линию старта, проведенную на расстоянии 2-3 см от нижнего края пластинки, так, чтобы пятна образцов отстояли друг от друга и от краев слоя сорбента не менее чем на 2 см. Нежелательное растекание пятен анализируемых проб при нанесении предотвращают путем периодического подсушивания. После окончательного высыхания нанесенных на линию старта пятен пластинку вносят в камеру. Нижний край пластинки при этом должен погрузиться в подвижную фазу на 0,5-1 см. Пластинки с закрепленным слоем сорбента располагают под углом 60-90 град., а пластинки с незакрепленным слоем сорбента - под углом 15-20 град. к поверхности жидкости. Когда фронт растворителя пройдет 10-15 см, пластинку вынимают, отмечают положение фронта и открывают пятна хроматографировавшихся веществ, как указано в соответствующей частной статье. Опрыскивание незакрепленного слоя сорбента проводят немедленно после завершения процесса хроматографирования, не допуская высыхания хроматограммы. Результаты хроматографирования оценивают, как описано в разделе "Хроматография на бумаге" настоящей статьи. СПЕЦИАЛЬНЫЕ ПРИЕМЫ ХРОМАТОГРАФИИ НА БУМАГЕ И В ТОНКОМ СЛОЕ СОРБЕНТА При необходимости достигнуть лучшего разделения анализируемых смесей веществ методами хроматографии на бумаге и в тонком слое сорбента можно применять специальные приемы хроматографирования - повторное и двухмерное. Повторное хроматографирование заключается в том, что после завершения первого хроматографирования пластинку или бумагу высушивают и подвергают повторному пропусканию той же или иной подвижной фазы в том же направлении. При двухмерном хроматографировании повторное пропускание той же или иной подвижной фазы осуществляют в направлении, перпендикулярном направлению первоначального движения. Двухмерное хроматографирование целесообразно осуществлять на квадратных пластинках или листах бумаги. Анализируемая проба при этом наносится на диагональ квадрата вблизи одного из его углов. Двухмерную хроматографию с использованием одной и той же подвижной фазы часто применяют для проверки устойчивости веществ в условиях хроматографирования. Устойчивые вещества образуют пятна, лежащие только на диагонали пластинки или листа бумаги. Газовая хроматография Газовая хроматография - это хроматография, в которой подвижная фаза находится в состоянии газа или пара. В фармацевтическом анализе находит применение как газожидкостная, так и газоадсорбционная хроматография. В газожидкостной хроматографии неподвижной фазой служит жидкость, нанесенная на твердый носитель, в газоадсорбционной хроматографии неподвижной фазой служит твердый адсорбент. В дальнейшем твердый носитель с нанесенной на него жидкой фазой и адсорбент будут обозначаться термином "сорбент". Анализируемые вещества вводятся в поток газа-носителя, испаряются и в парообразном состоянии проходят через колонку с сорбентом, распределяясь в результате многократного повторения актов сорбции и десорбции между газовой и жидкой или газовой и твердой фазами. Отношение количества вещества в неподвижной фазе к количеству вещества в подвижной фазе представляет собой коэффициент распределения, который, в частности, зависит от природы растворенного вещества и количества неподвижной фазы. Разделенные вещества элюируются из хроматографической колонки потоком газа-носителя, регистрируются детектором и фиксируются на хроматограмме в виде пиков. Полученная хроматограмма служит основой для качественного и количественного анализа смеси веществ. Метод газовой хроматографии применяется для анализа летучих веществ либо веществ, которые могут быть переведены в летучие с помощью специальных приемов и устройств в парообразное состояние. Газовый хроматограф состоит из систем: измерения и регулирования скорости потока газа - носителя и вспомогательных газов (для детектора); ввода пробы анализируемого образца; газохроматографических колонок, а также систем детектирования, регистрации (и обработки) хроматографической информации; термостатирования и контроля температуры колонок, детектора и системы ввода проб. Газ - носитель поступает в хроматограф из баллона через редуктор. Обычно в качестве газа - носителя применяют гелий, азот, аргон. При работе с детектором по теплопроводности предпочтительнее гелий, так как он обеспечивает максимальную чувствительность детектора благодаря высокой теплопроводности по сравнению с большинством органических соединений. Система ввода пробы анализируемого образца обычно состоит из испарителя и мембраны из термостойкой резины, которая прокалывается при вводе пробы. Некоторые хроматографы снабжены также специальными дозаторами для ввода газообразных и твердых веществ. Анализируемые вещества поступают в колонку в парообразном состоянии, поэтому температура испарителя должна обеспечить возможно быстрое испарение компонентов пробы. Жидкие пробы вводят в хроматограф микрошприцем. Объем вводимой пробы зависит от типа детектора, количества неподвижной жидкой фазы и диаметра колонки. Обычно для насадочной аналитической колонки объем пробы жидкости составляет 0,1-1 мкл, а газа - от 0,5 до 5 мл. Газохроматографическая колонка представляет собой прямую, спиральную или U-образную трубку, обычно изготовленную из нержавеющей стали или стекла с внутренним диаметром от 0,6 до 5 мм. Наиболее часто используются колонки длиной 1-3 м. Эффективность газохроматографической колонки n, характеризующая степень расширения зоны определяемого вещества на выходе газохроматографической колонки, определяется по формуле: Љ l Ї2 n = 5,545 Ј------ Ј , Ј"ми "Ј ђ 0,5 ‰ где l - время удерживания вещества, выраженное в единицах длины диаграммной ленты (например, мм); "ми " - ширина 0,5 хроматографического пика, измеренная на половине его высоты и выраженная в тех же единицах, что и расстояние удерживания. Степень газохроматографического разделения веществ R определяют по формуле: "ДЕЛЬТА"l R = ------------------------- , "ми " + "ми " 0,5(1) 0,5 (2) где "ДЕЛЬТА"l - разность расстояний времен удерживания разделяемых веществ 1 и 2. Температура колонки должна обеспечивать оптимальное разделение компонентов смеси при достаточно коротком времени анализа. Для анализа смесей с широким диапазоном температур кипения компонентов целесообразно применять газовую хроматографию с программированием температуры либо газовую хроматографию с программированием расхода газа - носителя, либо сочетание этих видов газовой хроматографии. Твердый носитель служит для удержания тонкой равномерной пленки неподвижной жидкой фазы, его поверхность должна обеспечивать достаточное разделение. Он должен иметь достаточную механическую прочность и быть инертным как по отношению к анализируемым веществам, так и к жидкой фазе. В качестве твердых носителей применяют материалы на основе кремнезема - диатомита или кизельгура (например, сферохромы, хроматоны, хезосорбы, целиты); фторуглеродных полимеров (например, тефлон, полихром); полистирола и сополимеров стирола и дивинилбензола (полисорбы). В отдельных случаях в качестве твердых носителей могут использоваться кристаллы некоторых солей (например, хлорида натрия), стеклянные шарики и графитированная сажа (карбохром). Наиболее часто используемый размер частиц твердого носителя от 0,1 до 0,5 мм. В зависимости от задач анализа свойства носителей можно изменять обработкой их кислотами или щелочами, а также силанизированием. Неподвижная жидкая фаза представляет собой, как правило, высококипящую жидкость. В качестве жидкой фазы обычно применяют: индивидуальные углеводороды или их смеси, например вазелиновое масло, апиезоны; силоксановые полимеры без функциональных групп; сложные эфиры и полиэфиры; простые эфиры; полифенилы; амиды; силоксановые полимеры с привитыми нитрильными или галогеналкильными группами; одно- и многоатомные спирты; полигликоли; амины; жирные кислоты и т. д. Перед работой с новой колонкой ее следует кондиционировать при температуре, как правило, на 10-30 град. С превышающей рабочую температуру, в токе газа-носителя в течение нескольких часов. Важно следить за тем, чтобы температура термостата колонки не превышала температурного предела применения данной фазы. Как правило, неподвижная жидкая фаза наносится на твердый носитель в количестве 1-20% от его массы, наиболее часто используются колонки с содержанием жидкой фазы до 5-10% от массы твердого носителя. Нанесение жидкой фазы на носитель осуществляется из ее раствора в подходящем растворителе. Существует несколько методов нанесения жидкой фазы, из которых |